Zingibain , zingipain или протеаза имбиря ( EC 3.4.22.67) — фермент цистеиновой протеазы, обнаруженный в корневищах имбиря ( Zingiber officinale ) . [1] [2] [3] Он катализирует преимущественное расщепление пептидов с остатком пролина в положении P2. Он имеет две различные формы : протеаза имбиря I (GP-I) и протеаза имбиря II (GP-II). [4]
Как член семейства папаин-подобных протеаз цистеиновых протеаз, зингибаин имеет несколько структурных и функциональных сходств с более хорошо изученными ферментами, такими как папаин , бромелайн и актинидин . Эти пептидазы содержат активный остаток цистеина в своих центрах, который катализирует гидролитическое расщепление пептидных связей. Зингибаин известен своей активностью в качестве протеиназы и коллагеназы . [1]
Впервые он был выделен, очищен и описан в 1973 году Ичикавой и др. в Японском женском университете . [5] Недавно было обнаружено, что зингибаин существует в виде двух изоферментов , GP-I и GP-II, которые были выделены с помощью хроматографии, с молекулярным весом приблизительно 22 500 Да. [5]
Зингибаин использует каталитическую триаду остатков Cys, His и Asn в своем активном центре для гидролитического расщепления пептидных связей. Присутствие Asn175 стабилизирует имидазольное кольцо His, гарантируя его оптимальное расположение для катализа гидролиза.
Механизм начинается с переноса протона от Cys25 к His159. [6] Затем сульфид-анион атакует альфа-углерод аминокислоты , вытесняя аминогруппу , которая присоединяется к His159. [6] Затем альфа-углерод на стабилизированной аминокислоте подвергается атаке молекулы воды, которая вытесняет сульфид Cys25, превращая аминокислоту в карбоновую кислоту , которая высвобождается из активного центра фермента. [6]
The experimental introduction of dithiothreitol, a known thiol group protector, improves proteolytic activity, providing further verification of the importance of the central cysteine residue to enzymatic activity.[7]
Zingibain exhibits maximum turnover rate at 60 °C and rapidly denatures at 70 °C.[8] Proteolysis is largely unhampered during cooking with ginger. Optimal temperature ranges of papain and ficin are elevated relative to zingibain, whereas bromelain operates at a slightly lower range.[7]
Maximum proteolytic activity of zingibain occurs at pH of 6.0, although the enzyme is still active in pH ranges from 4.5 to 6.0 (optimal pH for meat marinades).[7]
GP-II, the more acidic of the two isozymes, exhibits a pI of 4.82, and GP-I exhibits pI values at 5.05 or 5.16.[1] These multiple pI values lend support to a theory that GP-I may be a mixture of two proteins.
Zingibain was first purified and characterized with X-ray crystallography in 2000 by researchers at Boston University.[1]
The enzyme is 221 amino acids long and glycosylated with 2 N-linked oligosaccharide chains at Asn96 and Asn154.[3] The polypeptide chain of zingibain folds into two polar domains of roughly equal size, divided by a central neutral cleft.[3] The first domain contains alpha helices, and the second has antiparallel beta sheets.[3] This separation of polar and non-polar regions facilitates protein-protein interactions between the enzyme and a large range of substrates.[3]
The active site of zingibain, located in the central cleft, is 5.5 Å deep and 9.5 Å long.[3] The active site contains the catalytic triad of Cys25, His159, and Asn175, which both cooperatively enable acid/base catalysis.
Zingibain exhibits binding specificity to peptide substrates with proline in the P2 position.[1] The S2 subsite of zingibain contains the amino acid chain Trp67-Met68-Asn69-Thr133-Ala157, which makes the site too compact to accommodate larger hydrophobic aromatic substrate residues favored by other enzymes in the papain family.[1] Proline, however, is stabilized by multiple non-covalent interactions with this region.
The enzyme structure is stabilized by hydrogen bonds, as well as crosslinking sulfide bonds between three pairs of cysteine residues (Cys22-Cys63, Cys56-Cys95, and Cys153-Cys200), analogous to many other papains.[1]
В то время как фермент существует в виде мономера в растворе, кристаллизованный зингибаин образует тетрамеры или димеры димеров, связанных цепями гликозилирования на каждой субъединице. Зингибаин демонстрирует сложные N-связанные олигосахаридные цепи в двух остатках. [1] Цепи имеют длину от 5 до 13 гликозильных единиц и состоят из N-ацетилглюкозамина , фукозы , маннозы и ксилозы . Последовательности сахаров зингибаина почти идентичны олигосахаридам, обнаруженным в лектинах из семян японского дерева пагоды , лакказе a из клеток платана и S-гликопротеинах из Brassica campestris . [1]
В корневищах имбиря протеаза имбиря участвует в выполнении множества функциональных ролей по поддержанию и поддержанию жизнедеятельности растительных клеток .
Зингибаин, как и большинство цистеиновых протеаз, синтезируется как пропротеин массой 40-50 кДа в цитоплазматических полисомах , связанных с клеточными мембранами . [9] Внутри эндоплазматического ретикулума эти удлиненные цепи помечены сигналом удержания KDEL ER и помещены в большие везикулы KDEL, которые перемещаются из ER в вакуоли для хранения белка в клеточных стенках . [9]
Зингибаин, вероятно, участвует в хранении белков (в семенах или растительной ткани ), но в основном разрушает и мобилизует запасные белки. Он также может реагировать на абиотические и биотические стрессы, такие как тепловой шок , низкие температуры и обезвоживание , чтобы устранить любые полученные неправильно свернутые или денатурированные белки. [9]
Подобно папаину из папайи и бромелаину из ананасов , он используется в качестве размягчителя мяса . [10] [11]
Было показано, что при добавлении зингибаина в готовящееся мясо, обычно в сыром или сушеном имбире, он повышает нежность мяса. [8] [12] Размягчение мяса происходит из-за быстрого протеолиза зингибаином основных мышечных белков в мясе, особенно актомиозина и коллагена I типа , который находится в мышечных суставах . [8]
В то время как другие ферменты папаина, включая папаин, фицин и бромелайн, чаще используются для размягчения мяса, зингибаин демонстрирует схожую или повышенную протеолитическую активность. [11] Фактически, зингибаин является единственной каталогизированной растительной протеазой с коллагенолитической активностью. Зингибаин может быть предпочтительным размягчителем мяса, чем папаин, из-за получаемой в результате текстуры мяса. Хотя папаин может гидролизовать актомиозин, он также расщепляет другие основные тканевые белки, что приводит к кашеобразной текстуре мяса. [11] Специфичность связывания зингибаина обеспечивает преимущественную гидролиз актомиозина и коллагена типа I.
Зингибаин также используется для ароматизации колбас и хлебобулочных изделий . [8]
На протяжении последних 100 лет имбирная протеаза традиционно использовалась для свертывания молока с целью создания имбирного молочного творога , гелеобразного кантонского блюда, приготовленного из горячего молока и имбирного сока . Способность свертывать молоко и специфичность имбирной протеазы к протеолизу κ-казеина делают фермент потенциальной заменой растительного сычужного фермента для производства сыра .
Коагуляция молока традиционно осуществляется с помощью коагулирующих ферментов, извлеченных из таких источников, как сычужный фермент. В сычужном ферменте три изофермента химозина гидролизуют κ-казеин, основную фракцию белка в молоке, между Phe105 и Met106 . Гидрофильные субрегионы κ-казеина расщепляются, оставляя после себя в основном гидрофобный агрегат. Таким образом, ферменты дестабилизируют мицеллы κ-казеина и способствуют слипанию гидрофобных остатков белка, заставляя молоко сворачиваться.
К основным промышленным недостаткам сычужного фермента относятся его ограниченные поставки и высокая стоимость, его недоступность для вегетарианцев и практикующих членов некоторых религиозных групп , а также недавние европейские национальные запреты на использование рекомбинантного телячьего сычужного фермента . [13] Грибковые протеазы в значительной степени непригодны в качестве заменителей сычужного фермента, а ферменты из многих растительных экстрактов, как было показано, дают низкий выход, плохую текстуру и горький привкус сыра. [13]
Однако сырая имбирная протеаза, извлеченная из экстракта имбиря, нестабильна, ее период полураспада составляет около 2 дней при температуре 5 °C, что делает ее проблематичной для коммерческого применения. [14] Хотя период полураспада фермента не влияет на его эффективность во время приготовления пищи, эта низкая стабильность при хранении требует улучшения для коммерциализации.
Коммерческие попытки стабилизировать фермент для крупномасштабного производства исследовали потенциальные методы инактивации свободной сульфгидрильной группы в активном центре фермента. Механистические возможности включают окисление сульфгидрила, обмен его с дисульфидными мостиками , образование хинон -тиоловых аддуктов или связывание сульфгидрила с ионом тяжелого металла . [14] Было обнаружено, что 0,2% аскорбата натрия стабилизирует зингибаин в течение 14 дней при 5 °C, тогда как сопоставимые концентрации ЭДТА и CaCl 2 оказали минимальное влияние на стабильность. [14]
Было обнаружено, что зингибаин дезактивируется посредством аутолиза , который можно предотвратить путем взаимодействия активной сульфгидрильной группы с цистеином или PCMB. [14]
Ацетоновые порошки являются жизнеспособным коммерческим методом стабилизации зингибаина. После удаления гидрофобных растительных полифенолов из сырого имбиря вводится ацетоновый порошок при низких температурах для обезвоживания корневой мякоти. [14] Фермент стабилизируется за счет пониженной активности воды, более низких концентраций растительных пигментов и более жестких трехмерных структур при более низких температурах. [14]
