Изоцитратдегидрогеназа ( IDH ) ( EC 1.1.1.42) и ( EC 1.1.1.41) — это фермент , катализирующий окислительное декарбоксилирование изоцитрата с образованием альфа-кетоглутарата (α-кетоглутарата) и CO2 . Это двухэтапный процесс, включающий окисление изоцитрата ( вторичного спирта ) до оксалосукцината ( кетона ), за которым следует декарбоксилирование карбоксильной группы бета до кетона с образованием альфа-кетоглутарата. У людей IDH существует в трех изоформах: IDH3 катализирует третий этап цикла лимонной кислоты , одновременно превращая NAD + в NADH в митохондриях . Изоформы IDH1 и IDH2 катализируют ту же реакцию вне контекста цикла лимонной кислоты и используют NADP + в качестве кофактора вместо NAD + . Они локализуются в цитозоле, а также в митохондриях и пероксисомах . [2]
NAD-IDH состоит из 3 субъединиц, регулируется аллостерически и требует интегрированного иона Mg 2+ или Mn 2+ . Ближайший гомолог, имеющий известную структуру, — это E. coli NADP-зависимая IDH, которая имеет только 2 субъединицы и 13% идентичности и 29% сходства на основе аминокислотных последовательностей, что делает ее непохожей на человеческую IDH и не пригодной для близкого сравнения. Все известные NADP-IDH являются гомодимерами.
Большинство изоцитратдегидрогеназ являются димерами, если быть точным, гомодимерами (две идентичные мономерные субъединицы, образующие одну димерную единицу). При сравнении C. glutamicum и E. coli [4] , мономера и димера соответственно, оба фермента были обнаружены как «эффективно катализирующие идентичные реакции». Однако было зарегистрировано, что C. glutamicum имеет в десять раз большую активность, чем E. coli , и в семь раз большую аффинность/специфичность к НАДФ. C. glutamicum отдавал предпочтение НАДФ + по сравнению с НАД + . С точки зрения стабильности в ответ на температуру оба фермента имели схожую Tm или температуру плавления примерно от 55 °C до 60 °C. Однако мономер C. glutamicum показал более постоянную стабильность при более высоких температурах, что и ожидалось. Димер E. coli показал стабильность при более высокой температуре, чем обычно, из-за взаимодействий между двумя мономерными субъединицами.
Структура Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ICDH-1, связанная с НАДФН и Mn(2+), была решена с помощью рентгеновской кристаллографии. Это гомодимер, в котором каждая субъединица имеет складку Россмана и общий верхний домен взаимосвязанных β-слоев. Mtb ICDH-1 наиболее структурно похож на мутантный человеческий ICDH R132H, обнаруженный в астроцитомах ЦНС 4-й степени по классификации ВОЗ , ранее классифицированных [5] как глиобластомы . Подобно человеческому R132H ICDH, Mtb ICDH-1 также катализирует образование α-гидроксиглутарата. [6]
Шаг IDH цикла лимонной кислоты часто (но не всегда) является необратимой реакцией из-за его большого отрицательного изменения свободной энергии. Поэтому его необходимо тщательно регулировать, чтобы избежать истощения изоцитрата (и, следовательно, накопления альфа-кетоглутарата). Реакция стимулируется простыми механизмами доступности субстрата (изоцитрат, НАД + или НАДФ + , Mg 2+ / Mn 2+ ), ингибированием продукта НАДН (или НАДФН вне цикла лимонной кислоты) и альфа-кетоглутаратом, а также конкурентным ингибированием обратной связи АТФ . [7] Консервативная нкРНК выше гена icd , который кодирует НАДФ + -зависимую изоцитратдегидрогеназу (IDH), была зарегистрирована в бактериальных геномах, из-за своих характеристик эта нкРНК напоминает предыдущие регуляторные мотивы, называемые рибопереключателями , мотив icd-II нкРНК был предложен в качестве сильного кандидата на рибопереключатель. [8]
Изоцитратдегидрогеназа катализирует химические реакции :
Общая свободная энергия для этой реакции составляет -8,4 кДж/моль. [12]
В цикле лимонной кислоты изоцитрат , полученный в результате изомеризации цитрата, подвергается как окислению, так и декарбоксилированию . Фермент изоцитратдегидрогеназа (ИДГ) удерживает изоцитрат в своем активном центре , используя окружающие аминокислоты , включая аргинин , тирозин , аспарагин , серин , треонин и аспарагиновую кислоту .
На представленном рисунке в первом блоке показана общая реакция изоцитратдегидрогеназы. Необходимыми реагентами для этого ферментативного механизма являются изоцитрат, НАД + / НАДФ + и Mn 2+ или Mg 2+ . Продуктами реакции являются альфа-кетоглутарат , диоксид углерода и НАДН + Н + / НАДФН + Н + . [10] Молекулы воды помогают депротонировать атомы кислорода изоцитрата.
Второй блок на рисунке иллюстрирует шаг 1 реакции, который представляет собой окисление альфа-углерода (здесь C2, также называемого альфа-C). [9] [10] В этом процессе [9] спиртовая группа альфа-углерода депротонируется, и образовавшаяся неподеленная пара электронов образует кетонную группу на этом углероде. NAD + /NADP + действует как кофактор , принимающий электроны , и собирает образовавшийся гидрид из C2. Окисление альфа-углерода вводит молекулярное расположение, в котором электроны (на следующем шаге) будут течь из близлежащей карбоксильной группы и выталкивать электроны кислорода с двойной связью на сам атом кислорода, который собирает протон из близлежащего лизина .
Третий блок иллюстрирует шаг 2, который является декарбоксилированием оксалосукцината . На этом шаге [9] [10] кислород карбоксильной группы депротонируется близлежащим тирозином , и эти электроны текут вниз к C2. Диоксид углерода, уходящая группа, отсоединяется от бета-углерода изоцитрата (C3), и электроны текут к кислороду кетона, присоединенному к альфа-углероду, предоставляя отрицательный заряд связанному атому кислорода и образуя альфа-бета-ненасыщенную двойную связь между углеродами 2 и 3.
Четвертый и последний блок иллюстрирует шаг 3, который является насыщением альфа-бета-ненасыщенной двойной связи, которая образовалась на предыдущем шаге. Отрицательно заряженный кислород (присоединенный к альфа-углероду) отдает свои электроны, реформируя двойную связь кетона и выталкивая другую неподеленную пару (ту, которая образует двойную связь между альфа- и бета-углеродами) «от» молекулы. Эта неподеленная пара, в свою очередь, забирает протон из соседнего тирозина. [14] Эта реакция приводит к образованию альфа-кетоглутарата, NADH + H + /NADPH + H + и CO 2 .
Два остатка аминокислот аспартата (внизу слева) взаимодействуют с двумя соседними молекулами воды (w6 и w8) в комплексе Mn2 + изоцитрат свиной IDH, чтобы депротонировать спирт с альфа-углеродного атома. Окисление альфа-C также происходит на этой картинке, где NAD + принимает гидрид, что приводит к образованию оксалосукцината. Наряду со стереохимическим изменением sp3 в sp2 вокруг альфа- C , существует кетонная группа, которая образуется из спиртовой группы. Образование этой двойной связи кетона позволяет происходить резонансу, когда электроны , спускающиеся с уходящей карбоксилатной группы, движутся к кетону.
Декарбоксилирование оксалосукцината (ниже центра) является ключевым этапом в образовании альфа-кетоглутарата. В этой реакции неподеленная пара на соседнем гидроксиле тирозина отрывает протон от карбоксильной группы. [14] Эта карбоксильная группа также называется бета-субъединицей в молекуле изоцитрата. Депротонирование карбоксильной группы заставляет неподеленную пару электронов перемещаться вниз, образуя диоксид углерода и отделяясь от оксалосукцината. Электроны продолжают двигаться к альфа-углероду, выталкивая электроны двойной связи (образуя кетон) вверх, чтобы оторвать протон от соседнего остатка лизина. Между углеродом 2 и 3 образуется альфа-бета-ненасыщенная двойная связь. Как вы можете видеть на рисунке, зеленый ион представляет собой либо Mg 2+ , либо Mn 2+ , который является кофактором, необходимым для протекания этой реакции. Ион металла образует небольшой комплекс посредством ионных взаимодействий с атомами кислорода на четвертом и пятом атомах углерода (также известный как гамма-субъединица изоцитрата).
После того, как диоксид углерода отщепляется от оксалосукцината на этапе декарбоксилирования (внизу справа), енол таутомеризуется в кето. Образование двойной связи кетона начинается с депротонирования этого кислорода от альфа-углерода (C#2) тем же лизином, который протонировал кислород в первую очередь. [14] Неподеленная пара электронов движется вниз, выбивая неподеленные пары, которые создавали двойную связь. Эта неподеленная пара электронов отрывает протон от тирозина, который депротонировал карбоксильную группу на этапе декарбоксилирования. Причина, по которой мы можем сказать, что остатки Lys и Tyr будут такими же, как на предыдущем этапе, заключается в том, что они помогают удерживать молекулу изоцитрата в активном центре фермента. Эти два остатка смогут образовывать водородные связи вперед и назад, пока они находятся достаточно близко к субстрату . [ 4]
Фермент изоцитратдегидрогеназа, как указано выше, производит альфа-кетоглутарат, углекислый газ и NADH + H + /NADPH + H + . В ходе реакции происходят три изменения. Окисление углерода 2, декарбоксилирование (потеря углекислого газа) углерода 3 и образование кетонной группы со стереохимическим изменением от sp 3 до sp 2 . [14]
Структура фермента изоцитратдегидрогеназы (IDH) в Escherichia coli была первой ортологичной структурой IDH, которая была выяснена и понята. [14] С тех пор структура IDH Escherichia coli использовалась большинством исследователей для сравнения с другими ферментами изоцитратдегидрогеназами. Существует много подробных знаний об этом бактериальном ферменте, и было обнаружено, что большинство изоцитратдегидрогеназ схожи по структуре и, следовательно, также по функции. Это сходство структуры и функции дает основание полагать, что структуры консервативны, как и аминокислоты. [11] Следовательно, активные центры среди большинства прокариотических ферментов изоцитратдегидрогеназы также должны быть консервативны, что наблюдается во многих исследованиях, проведенных на прокариотических ферментах. С другой стороны, эукариотические ферменты изоцитратдегидрогеназы еще не полностью обнаружены. Каждый димер IDH имеет два активных центра. [14] Каждый активный сайт связывает молекулу НАД + /НАДФ + и двухвалентный ион металла (Mg 2+ ,Mn 2+ ). В общем, каждый активный сайт имеет консервативную последовательность аминокислот для каждого специфического сайта связывания. У Desulfotalea psychrophila ( Dp IDH) [14] и свиньи ( Pc IDH) [3] есть три субстрата, связанных с активным сайтом.
Специфические мутации в гене изоцитратдегидрогеназы IDH1 были обнаружены в нескольких типах опухолей, [16] в частности, в опухолях головного мозга, включая астроцитому и олигодендроглиому . [5] Пациенты, у которых опухоль имела мутацию IDH1, выживали дольше, чем пациенты, у которых опухоль имела дикий тип IDH1 . [17] [18] Кроме того, мутации IDH2 и IDH1 были обнаружены у 20% цитогенетически нормального острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). [19] [20] Известно, что эти мутации производят D-2-гидроксиглутарат из альфа-кетоглутарата. [21] D-2-гидроксиглутарат накапливается до очень высоких концентраций, что подавляет функцию ферментов, зависящих от альфа-кетоглутарата. [22] Это приводит к гиперметилированному состоянию ДНК и гистонов, что приводит к различной экспрессии генов, которая может активировать онкогены и инактивировать гены-супрессоры опухолей. В конечном итоге это может привести к типам рака, описанным выше. [23] Соматические мозаичные мутации этого гена также были обнаружены в связи с болезнью Олье и синдромом Маффуччи . [24] Однако недавние исследования также показали, что D-2-гидроксиглутарат может быть преобразован обратно в альфа-кетоглутарат либо ферментативно, либо неферментативно. [25] [26] Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять роль мутации IDH1 (и D-2-гидроксиглутарата) в развитии рака. Недавние исследования выявили вызывающие рак мутации в изоцитратдегидрогеназе, которые могут вызывать накопление метаболита D-2-гидроксиглутарата (D-2HG). Нотаранджело и др. показали, что такие высокие концентрации D-2HG могут действовать как прямой ингибитор лактатдегидрогеназы в Т-клетках мышей. Ингибирование этого метаболического фермента изменило метаболизм глюкозы в Т-клетках и ингибировало их пролиферацию, выработку цитокинов и способность убивать клетки-мишени. [27]
Ниже приведен список изоферментов изоцитратдегидрогеназы человека:
Каждый НАДФ + -зависимый изофермент функционирует как гомодимер:
Изофермент изоцитратдегидрогеназы 3 представляет собой гетеротетрамер, состоящий из двух альфа-субъединиц, одной бета-субъединицы и одной гамма-субъединицы: