cccDNA ( ковалентно замкнутая кольцевая ДНК ) — это особая структура ДНК , которая возникает при размножении некоторых вирусов в ядре клетки и может оставаться там постоянно. Это двухцепочечная ДНК , которая возникает в линейной форме, которая лигируется с помощью ДНК-лигазы в ковалентно замкнутое кольцо. В большинстве случаев транскрипция вирусной ДНК может происходить только из кольцевой формы. cccDNA вирусов также известна как эписомальная ДНК или иногда как минихромосома .
cccDNA была впервые описана в бактериофагах , но она также была обнаружена в некоторых клеточных культурах, где была обнаружена инфекция ДНК-вирусов ( Polyomaviridae ). [1] [2] cccDNA типична для Caulimoviridae и Hepadnaviridae , включая вирус гепатита B (HBV). cccDNA в HBV образуется путем преобразования связанной с капсидом расслабленной кольцевой ДНК (rcDNA). [3] После заражения гепатитом B cccDNA может оставаться после клинического лечения в клетках печени и редко может реактивироваться. Относительное количество присутствующей cccDNA является индикатором для лечения HBV. [4]
Закрытая ковалентная кольцевая ДНК (cccDNA) — уникальная структура ДНК, которая формируется в ответ на инфицирование клетки. Геномная ДНК проникает в ядро клетки, а частично двухцепочечная ДНК затем преобразуется в cccDNA.
CccDNA в первую очередь рассматривается в контексте вируса гепатита B (HBV). Примерно 257 миллионов человек во всем мире хронически инфицированы этим вирусом, что подвергает их высокому риску развития цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). [5] Хроническая инфекция характеризуется сохранением минихромосомы cccDNA в ядрах гепатоцитов хозяина (клеток печени). [6] Современные методы лечения не способны полностью очистить вирусную минихромосому от гепатоцитов хозяина, [7] и, как следствие, направлены на «функциональное излечение» хозяина, что требует блокады вирусной cccDNA посредством транскрипционного сайленсинга . [5] Инфицированный человек не может быть полностью излечен без очистки cccDNA от инфицированных гепатоцитов, что в настоящее время невозможно. [8]
Возбудитель HBV — это небольшой вирус, передающийся через кровь, с высокой тканевой и видовой специфичностью, который передается через контакт с инфицированной кровью или биологическими жидкостями. [6] Единственными клетками, которые может инфицировать вирус, являются гепатоциты, и они попадают в организм через кровоток после заражения. [6] Гепатоциты — это клетки печеночной ткани, которые участвуют в синтезе и хранении белка. Хотя это заболевание можно предотвратить с помощью вакцинации , у лиц с высоким риском, таких как младенцы, вероятность хронического заболевания печени может достигать 90%, если они ранее не были вакцинированы. [9] В результате CDC рекомендует вводить первую дозу вакцины против гепатита В сразу после рождения. [10] КзкДНК и ее сохранение в ядре остаются главным препятствием для эффективного излечения и, следовательно, являются причиной строгого графика вакцинации против гепатита В. [10]
На практике единственным известным организмом, который использует cccDNA, является вирус гепатита B. Более конкретно, cccDNA является реактивным промежуточным продуктом , который вносит значительный вклад в инфекции гепатоцитов. [11] Сохранение cccDNA на протяжении всей инфекции сыграло ключевую роль в распространенности HBV. [11] Исследования показывают, что cccDNA на самом деле является основной причиной того, что исторически не было достигнуто большого прогресса в искоренении HBV. [12] Во многих случаях, даже после того, как инфекция была вылечена, cccDNA все еще можно обнаружить. [12] В настоящее время терапия HBV включает нуклеотидные аналоги (NA), которые первоначально были внедрены в клиническую практику в конце 1990-х годов. [ необходима цитата ] Хотя за эти годы было опробовано множество различных терапевтических методов, лекарство от HBV до сих пор не найдено. Исследователи связывают это с продолжающейся неспособностью отключить cccDNA. [ необходима цитата ] Будущие методы лечения должны будут быть направлены непосредственно на устранение этого фактора.
CccDNA способна образовывать стабильную минихромосому в ядре клеток, инфицированных определенным вирусом, связанным с cccDNA. [13] Как часть ядра, cccDNA способна взаимодействовать с гистоновыми и негистоновыми белками, образуя структуры, похожие на хроматин . [14] Так же, как и хроматин хозяина, транскрипция cccDNA регулируется посредством контроля двух энхансеров и четырех различных промоторов . Она также зависит от множества регуляторов, включая факторы транскрипции , коактиваторы , корепрессоры и ферменты , модифицирующие хроматин . Кроме того, cccDNA может служить шаблоном для вирусной репликации и транскрипции ДНК для пяти вирусных РНК, что позволяет производить вирусные антигены . [13]
Сложно количественно оценить количество копий cccDNA в каждой клетке, поскольку это зависит от типа клетки и типа инфекции. Хотя период полураспада cccDNA еще не определен, было проверено in vitro , что он сохраняется в течение всей жизни клетки. [13] В недавнем исследовании in vitro HBV результаты показали, что период полураспада клетки печени человека ( HepG2 ) составляет 40 дней и обеспечивает предполагаемую продолжительность жизни в 58 дней. Период полураспада in vivo клеток печени человека еще не определен. [15]
CccDNA связана с вирусом гепатита B (HBV), где вирус конструирует свою плазмиду посредством ковалентного связывания своих связей. Гистонсодержащая область ядра внутри вируса - это то место, где обычно находится cccDNA, обычно взаимодействующая с гистонами, подобными гистонам хроматина . Модели, доступные для определения бактериальной специфичности, в настоящее время ограничены тремя типами клеточных культур: первичные тупайи, или человеческие гепатоциты (PHH), и дифференцированные HepaRG (dHepaRG). [16] Именно из этих моделей наблюдалась репликация HBV посредством транскрипции cccDNA. Именно отсутствие этих моделей препятствует лекарственному лечению из-за отсутствия эффективности в искоренении cccDNA. [17]
HepaRG была первой клеточной линией, которая успешно поддерживала инфекцию HBV и продемонстрировала, что инфекция может быть размещена только в человеческих гепатоцитах . [18] После того, как гепатоцитоподобные клетки подверглись воздействию индукторов дифференциации, вирусный источник был введен от известного носителя HBV, содержащего высокие уровни cccDNA, и были проанализированы уровни поверхностного антигена HBV , что указывает на то, что инфекция успешно реплицировалась в клетках HepaRG. [19] Обычно HBV измеряется по уровням cccDNA с помощью кинетики саузерн-блоттинга здоровых и инфицированных клеток и количественно определяется с помощью дот-блоттинга. В этих инфицированных клетках существует сильная корреляция между cccDNA, которая действует как маркер репликации, и уровнями секреции поверхностного антигена, HBsAg. [18]
CccDNA образуется из rcDNA (релаксированной кольцевой ДНК) посредством удаления вирусной полимеразы на 5'-конце отрицательной цепи ДНК, удаления 5'-конца плюс-цепи и удаления одной копии короткой терминальной избыточности из минус-цепи. После того, как эти удаления происходят, положительная цепь завершается и происходит лигирование двух вирусных цепей ДНК. [16] Механизм заражения вытекает из преобразования расслабленной кольцевой двухцепочечной ДНК (rcDNA) в cccDNA из вирусных шаблонов, предположительно выполняемого собственными ферментами репарации ДНК клетки. Этот процесс происходит из-за ретротранскрипции транскрипта cccDNA в нормальные геномы rcDNA клетки. Депротонирование rcDNA затем действует как предшественник cccDNA посредством полимеразной цепной реакции . [20] [21] Хотя ведутся споры относительно следующих шагов в механизмах формирования и метаболизма cccDNA, известно, что ингибиторы лигазы играют решающую роль, как подтверждают эксперименты по нокауту. ДНК-лигаза 1 и ДНК-лигаза 3 напрямую снижают образование cccDNA, тогда как ДНК-лигаза 4 имеет решающее значение для формирования cccDNA только в двухцепочечной линейной ДНК. [21]
Такое преобразование частично двухцепочечной rcDNA в cccDNA обычно происходит, когда гепатоцит инфицируется. [22] cccDNA может производить все необходимое оборудование для завершения репликации вируса и производства белка и, следовательно, не нуждается в использовании полуконсервативного механизма репликации ДНК своего хозяина. [22]
Триггеры и средства контроля производства cccDNA не полностью известны, но считается, что может существовать система, включающая отрицательную обратную связь для подавления производства cccDNA после того, как сделано около 10-50 копий. Пулы cccDNA, однажды созданные, легко поддерживаются, поэтому нет необходимости в многократном инфицировании клетки для создания пула cccDNA. [23] cccDNA может быть разбавлена и/или утрачена в результате митоза, но в целом cccDNA может существовать в течение жизненного цикла гепатоцита, не влияя на его жизнеспособность. Предполагается, что эта пожизненная персистенция cccDNA объясняет наблюдаемые пожизненные иммунные реакции на HBV. [24]
Считается, что иммуноопосредованные, эпигенетические и вирусные факторы оказывают влияние на активность cccDNA. Исследование механизмов, посредством которых эти различные факторы влияют на активность cccDNA in vivo, довольно ограничено из-за выбора доступных животных-хозяев. [25] Что касается иммуноопосредованных факторов, исследования показали, что воспалительные цитокины могут подавлять репликацию вируса и уменьшать пулы cccDNA в инфицированных клетках. Кроме того, считается, что ацетилирование и деацетилирование cccDNA регулируют транскрипцию cccDNA и, таким образом, ее вирусную репликацию. Было обнаружено, что ацетилирование коррелирует с вирусной репликацией, в то время как деацетилирование коррелирует с низкой вирусной репликацией in vitro. [22] Необходимы дальнейшие исследования для изучения эффектов ацетилирования и деацетилирования на активность cccDNA in vivo.