stringtranslate.com

Криогенная электронная микроскопия

Титан Криос в Университете Лидса

Криогенная электронная микроскопия ( криоЭМ ) — это метод криомикроскопии , применяемый к образцам, охлажденным до криогенных температур. Для биологических образцов структура сохраняется путем помещения их в среду стекловидного льда . Водный раствор образца наносится на сетку и замораживается погружением в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана . [1] Хотя разработка этого метода началась в 1970-х годах, последние достижения в области детекторных технологий и алгоритмов программного обеспечения позволили определять биомолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [2] Это привлекло широкое внимание к этому подходу как альтернативе рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии для определения структуры макромолекул без необходимости кристаллизации. [3]

В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [4] Компания Nature Methods также назвала криоЭМ «методом года» в 2015 году. [5]

История

Ранняя разработка

В 1960-е годы использование просвечивающей электронной микроскопии для определения структуры было ограничено из-за радиационного повреждения пучками электронов высокой энергии. Ученые предположили, что исследование образцов при низких температурах уменьшит радиационные повреждения, вызванные лучом. [6] И жидкий гелий (-269  ° C или 4  K или -452,2  ° F ), так и жидкий азот (-195,79 ° C или 77 K или -320 ° F) считались криогенами. В 1980 году Эрвин Кнапек и Жак Дюбоше опубликовали комментарии о повреждении пучка при криогенных температурах, поделившись наблюдениями о том, что:

Было обнаружено, что тонкие кристаллы, закрепленные на углеродной пленке, в 30–300 раз более устойчивы к лучу при 4 К, чем при комнатной температуре... Большую часть наших результатов можно объяснить, предположив, что криозащита в области 4 К сильно зависит от температура. [7]

Однако эти результаты не удалось воспроизвести, и всего два года спустя в журнале Nature были опубликованы поправки , в которых сообщалось, что сопротивление луча было менее значительным, чем первоначально предполагалось. Защита, полученная при 4 К, была ближе «в десять раз для стандартных образцов L- валина » [8] , чем утверждалось ранее.

В 1981 году Аласдер МакДауэлл и Жак Дюбоше, ученые Европейской лаборатории молекулярной биологии , сообщили о первом успешном внедрении криоЭМ. [9] Макдауэлл и Дюбоше остекловали чистую воду в виде тонкой пленки, распылив ее на гидрофильную углеродную пленку, которую быстро погрузили в криоген (жидкий пропан или жидкий этан, охлажденный до 77 К). Тонкий слой аморфного льда имел толщину менее 1 мкм, и электронограмма подтвердила наличие аморфного/стекловидного льда. В 1984 году группа Дюбоше продемонстрировала возможности криоЭМ в структурной биологии с анализом витрифицированного аденовируса типа 2, бактериофага Т4 , вируса леса Семлики , бактериофага CbK и вируса везикулярного стоматита . [10]

Последние достижения

2010-е годы ознаменовались резким развитием электронных камер. Примечательно, что усовершенствования, внесенные в детекторы прямых электронов, привели к «революции разрешения» [11] , подтолкнув барьер разрешения ниже критического предела ~ 2-3 Å для определения положения и ориентации аминокислот. [12]

Хендерсон ( Лаборатория молекулярной биологии MRC , Кембридж, Великобритания) сформировал консорциум с инженерами лаборатории Резерфорда Эпплтона и учеными Общества Макса Планка для финансирования и разработки первого прототипа. Затем консорциум объединил усилия с производителем электронных микроскопов FEI , чтобы представить и продать новую конструкцию. Примерно в то же время компания Gatan Inc. из Плезантона, Калифорния, представила аналогичный детектор, разработанный Питером Денесом ( Национальная лаборатория Лоуренса Беркли ) и Дэвидом Агардом ( Калифорнийский университет, Сан-Франциско ). Третий тип камеры был разработан Нгуеном-Хуу Сюонгом в компании Direct Electron ( Сан-Диего, Калифорния ). [11]

В последнее время достижения в использовании каркасов для визуализации на основе белков помогают решить проблемы смещения ориентации образца и ограничения размера. Белки размером менее ~50 кДа обычно имеют недостаточное соотношение сигнал/шум для разрешения белковых частиц на изображении, что затрудняет или делает невозможным трехмерную реконструкцию. [13] Каркасы для визуализации повышают SNR более мелких белков, связывая их с более крупным объектом — каркасом. Группа Йейтса из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе смогла создать более четкое изображение трех вариантов KRAS (размером примерно 19 кДа), используя жесткий каркас для визуализации и используя DARPins в качестве модульного связывающего домена между каркасом и интересующим белком. [14]

Нобелевская премия по химии 2017 г.

В знак признания влияния криоЭМ на биохимию трое учёных, Жак Дюбоше , Иоахим Франк и Ричард Хендерсон , были удостоены Нобелевской премии по химии «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [4]

Сравнение с рентгеновской кристаллографией

Традиционно рентгеновская кристаллография была самым популярным методом определения трехмерных структур биологических молекул. [15] Однако вышеупомянутые усовершенствования криоЭМ увеличили ее популярность как инструмента для изучения деталей биологических молекул. С 2010 года ежегодные депозиты криоЭМ-структур опередили рентгеновскую кристаллографию. [16] Хотя рентгеновская кристаллография имеет значительно больше общих депозитов из-за более длительной истории, по прогнозам, общее количество депозитов обоих методов затмится примерно к 2035 году. [16]

Разрешение рентгеновской кристаллографии ограничено однородностью кристаллов, [17] и приведение биологических молекул с неизвестными идеальными условиями кристаллизации в кристаллическое состояние может занять очень много времени, в крайних случаях занимающих месяцы или даже годы. [18] Напротив, подготовка проб в криоЭМ может потребовать нескольких раундов скрининга и оптимизации для преодоления таких проблем, как агрегация белков и предпочтительная ориентация, [19] [20] , но для этого не требуется, чтобы образец образовывал кристалл, а нужны образцы для криоЭМ подвергаются мгновенной заморозке и исследуются в состоянии, близком к нативному. [21]

По данным Proteopedia , среднее разрешение, достигнутое с помощью рентгеновской кристаллографии (по состоянию на 19 мая 2019 г.) в Банке данных белков, составляет 2,05 Å [17] , а самое высокое разрешение, достигнутое за всю историю наблюдений (по состоянию на 30 сентября 2022 г.), составляет 0,48. О. [22] По состоянию на 2020 год большинство белковых структур, определенных с помощью криоЭМ, имеют более низкое разрешение - 3–4 Å. [23] Однако по состоянию на 2020 год лучшее разрешение криоЭМ было зафиксировано при 1,22 Å, [20] что в некоторых случаях делало его конкурентом по разрешению.

Корреляционный свет CryoTEM и CryoET

В 2019 году корреляционный свет CryoTEM и CryoET использовался для наблюдения туннелирующих нанотрубок (ТНТ) в нейрональных клетках. [24]

Сканирующая электронная криомикроскопия

Сканирующая электронная криомикроскопия (криоСЭМ) — это метод сканирующей электронной микроскопии с использованием холодного столика сканирующего электронного микроскопа в криогенной камере.

Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия

Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия (криоТЕМ) — это метод трансмиссионной электронной микроскопии , который используется в структурной биологии и материаловедении . В просторечии термин «криогенная электронная микроскопия» или его сокращение «криоЭМ» по умолчанию относится к криогенной трансмиссионной электронной микроскопии, поскольку подавляющее большинство криоЭМ выполняется в трансмиссионных электронных микроскопах, а не в сканирующих электронных микроскопах.

Центры

Федеральный технологический институт , Университет Лозанны и Женевский университет открыли Центр визуализации Дюбоше (DCI) в конце ноября 2021 года с целью применения и дальнейшего развития криоЭМ. [25] Менее чем через месяц после первой идентификации варианта Омикрон SARS-CoV-2 исследователи из DCI смогли определить его структуру, выявить важные мутации, позволяющие обойти отдельные вакцины, и предоставить информацию о новых терапевтических подходах. [26]

Датский национальный криоЭМ-центр, также известный как EMBION, был открыт 1 декабря 2016 года. EMBION — это криоЭМ-консорциум датских университетов (принимающий Орхусский университет и соучредитель Копенгагенского университета).

Рабочий процесс анализа одиночных частиц

Расширенные методы

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Тивол В.Ф., Бригель А., Дженсен Г.Дж. (октябрь 2008 г.). «Улучшенный криоген для погружной заморозки». Микроскопия и микроанализ . 14 (5): 375–379. Бибкод : 2008MiMic..14..375T. дои : 10.1017/S1431927608080781. ПМК  3058946 . ПМИД  18793481.
  2. ^ Ченг Ю, Григорьев Н, Пенчек П.А., Уолц Т. (апрель 2015 г.). «Практическое пособие по одночастичной криоэлектронной микроскопии». Клетка . 161 (3): 438–449. doi :10.1016/j.cell.2015.03.050. ПМЦ 4409659 . ПМИД  25910204. 
  3. ↑ Стоддарт C (1 марта 2022 г.). «Структурная биология: как белки стали крупным планом». Знающий журнал . doi : 10.1146/knowable-022822-1 . S2CID  247206999 . Проверено 25 марта 2022 г.
  4. ^ ab «Нобелевская премия по химии 2017». NobelPrize.org . Проверено 30 сентября 2022 г.
  5. ^ Дорр А (январь 2017 г.). «Криоэлектронная томография». Природные методы . 14 (1): 34. doi :10.1038/nmeth.4115. ISSN  1548-7091. S2CID  27162203.
  6. ^ Дубочет Дж, Кнапек Э (апрель 2018 г.). «Взлёты и падения в ранней электронной криомикроскопии». ПЛОС Биология . 16 (4): e2005550. doi : 10.1371/journal.pbio.2005550 . ПМЦ 5929567 . ПМИД  29672565. 
  7. ^ Кнапек Э, Дубоше Дж (август 1980 г.). «Лучевое повреждение органического материала значительно снижается при криоэлектронной микроскопии». Журнал молекулярной биологии . 141 (2): 147–161. дои : 10.1016/0022-2836(80)90382-4. ПМИД  7441748.
  8. ↑ Ньюмарк П. (30 сентября 1982 г.). «Криотрансмиссионная микроскопия. Угасающие надежды». Природа . 299 (5882): 386–387. Бибкод : 1982Natur.299..386N. дои : 10.1038/299386c0 .
  9. ^ Дубоше Дж., МакДауэлл А.В. (декабрь 1981 г.). «Витрификация чистой воды для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 124 (3): 3–4. дои : 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x .
  10. ^ Адриан М., Дюбоше Дж., Лепо Дж., Макдауэлл А.В. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов». Природа . 308 (5954): 32–36. Бибкод : 1984Natur.308...32A. дои : 10.1038/308032a0. PMID  6322001. S2CID  4319199.
  11. ^ аб Кюльбрандт, Вернер (28 марта 2014 г.). «Революция разрешения». Наука . 343 (6178): 1443–1444. Бибкод : 2014Sci...343.1443K. дои : 10.1126/science.1251652. ISSN  0036-8075. PMID  24675944. S2CID  35524447.
  12. ^ Кастер, Дэниел Дж.; Лю, Чэнъюй; Фан, Чжэн; Подумайте, Джей В.; Маршалл, Гарланд Р. (20 апреля 2015 г.). «Кристаллические структуры белковых спиралей высокого разрешения, согласованные с трехцентровыми водородными связями, и мультипольная электростатика». ПЛОС ОДИН . 10 (4): e0123146. Бибкод : 2015PLoSO..1023146K. дои : 10.1371/journal.pone.0123146 . ISSN  1932-6203. ПМК 4403875 . ПМИД  25894612. 
  13. ^ Герзик, Марк А.; Ву, Мэнъюй; Ландер, Габриэль К. (04 марта 2019 г.). «Определение структуры комплексов с массой менее 100 кДа с высоким разрешением с использованием традиционной криоЭМ». Природные коммуникации . 10 (1): 1032. Бибкод : 2019NatCo..10.1032H. дои : 10.1038/s41467-019-08991-8. ISSN  2041-1723. ПМК 6399227 . ПМИД  30833564. 
  14. ^ Кастельс-Граэллс Р., Мидор К., Арбинг М.А., Савая М.Р., Джи М., Касио Д. и др. (сентябрь 2023 г.). «Крио-ЭМ определение структуры небольших терапевтических белковых мишеней с разрешением 3 Å с использованием жесткого каркаса для визуализации». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 120 (37): e2305494120. Бибкод : 2023PNAS..12005494C. дои : 10.1073/pnas.2305494120. ПМК 10500258 . ПМИД  37669364. 
  15. ^ Смит М.С., Мартин Дж. Х. (февраль 2000 г.). «рентгеновская кристаллография». Молекулярная патология . 53 (1): 8–14. дои :10.1136/mp.53.1.8. ПМЦ 1186895 . ПМИД  10884915. 
  16. ^ Аб Чиу, Ва; Шмид, Майкл Ф.; Пинтилие, Григоре Д.; Лоусон, Кэтрин Л. (январь 2021 г.). «Эволюция стандартизации и распространение крио-ЭМ структур и данных совместно сообществом, PDB и EMDB». Журнал биологической химии . 296 : 100560. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100560 . ISSN  0021-9258. ПМК 8050867 . ПМИД  33744287. 
  17. ^ ab «Разрешение - Протеопедия, жизнь в 3D». сайт proteopedia.org . Проверено 27 октября 2020 г.
  18. ^ Каллауэй Э (февраль 2020 г.). «Революционная крио-ЭМ захватывает структурную биологию». Природа . 578 (7794): 201. Бибкод : 2020Natur.578..201C. дои : 10.1038/d41586-020-00341-9 . ПМИД  32047310.
  19. ^ Люмкис, Дмитрий (29 марта 2019 г.). «Проблемы и возможности криоЭМ одночастичного анализа». Журнал биологической химии . 294 (13): 5181–5197. дои : 10.1074/jbc.rev118.005602 . ISSN  0021-9258. ПМК 6442032 . ПМИД  30804214. 
  20. ^ ab Накане Т., Котеча А., Сенте А., Макмаллан Г., Масиулис С., Браун П.М. и др. (ноябрь 2020 г.). «Одночастичная криоЭМ с атомным разрешением». Природа . 587 (7832): 152–156. Бибкод : 2020Natur.587..152N. дои : 10.1038/s41586-020-2829-0. ПМК 7611073 . ПМИД  33087931. 
  21. ^ Ван HW, Ван JW (январь 2017 г.). «Как криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга». Белковая наука . 26 (1): 32–39. дои : 10.1002/pro.3022. ПМК 5192981 . ПМИД  27543495. 
  22. ^ Шмидт А, Титер М, Векерт Э, Ламзин В.С. (апрель 2011 г.). «Кристаллическая структура небольшого белка крамбина с разрешением 0,48 Å». Акта Кристаллографика. Раздел F. Структурная биология и кристаллизационные связи . 67 (Часть 4): 424–428. дои : 10.1107/S1744309110052607. ПМК 3080141 . ПМИД  21505232. 
  23. ^ Йип К.М., Фишер Н., Пакния Э., Чари А., Старк Х. (ноябрь 2020 г.). «Определение структуры белка с атомным разрешением методом криоЭМ». Природа . 587 (7832): 157–161. Бибкод : 2020Natur.587..157Y. дои : 10.1038/s41586-020-2833-4. PMID  33087927. S2CID  224823207.
  24. ^ Сартори-Рупп А., Кордеро Сервантес Д., Пепе А., Гуссе К., Делаж Э., Корройер-Дульмонт С. и др. (январь 2019 г.). «Корреляционная криоэлектронная микроскопия выявляет структуру ТНТ в нейрональных клетках». Природные коммуникации . 10 (1): 342. Бибкод : 2019NatCo..10..342S. дои : 10.1038/s41467-018-08178-7. ПМК 6341166 . ПМИД  30664666. 
  25. ^ «Открытие Центра визуализации Дубоше (DCI) в кампусах UNIGE, UNIL и EPFL». unige.ch . 30 ноября 2021 г. Проверено 30 апреля 2022 г.
  26. ^ «Ученые раскрывают тайны варианта Омикрона с помощью микроскопов» . Swissinfo.ch . 30 декабря 2021 г. Проверено 30 апреля 2022 г.
  27. ^ Бауэрляйн, Феликс Дж.Б.; Баумайстер, Вольфганг (01 октября 2021 г.). «На пути к визуальной протеомике в высоком разрешении». Журнал молекулярной биологии . От последовательности белка к структуре на сверхскорости: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN  0022-2836. ПМИД  34384780.
  28. ^ Нанненга Б.Л., Ши Д., Лесли А.Г., Гонен Т. (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED». Природные методы . 11 (9): 927–930. дои : 10.1038/nmeth.3043. ПМК 4149488 . ПМИД  25086503. 
  29. ^ Джонс К.Г., Мартынович М.В., Хаттне Дж., Фултон Т.Дж., Штольц Б.М., Родригес Дж.А. и др. (ноябрь 2018 г.). «КриоЭМ-метод MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул». Центральная научная служба ACS . 4 (11): 1587–1592. doi : 10.1021/accentsci.8b00760. ПМК 6276044 . ПМИД  30555912. 
  30. ^ де ла Круз М.Дж., Хаттне Дж., Ши Д., Зейдлер П., Родригес Дж., Рейес Ф.Е. и др. (февраль 2017 г.). «Структуры атомного разрешения из фрагментированных кристаллов белка криоЭМ-методом MicroED». Природные методы . 14 (4): 399–402. дои : 10.1038/nmeth.4178. ПМК 5376236 . ПМИД  28192420. 
  31. ^ Грюен Т., Веннмахер Дж.Т., Заубицер С., Гольштейн Дж.Дж., Хайдлер Дж., Фекто-Лефевр А. и др. (декабрь 2018 г.). «Быстрое определение структуры микрокристаллических молекулярных соединений методом дифракции электронов». Ангеванде Хеми . 57 (50): 16313–16317. дои : 10.1002/anie.201811318. ПМК 6468266 . ПМИД  30325568. 
  32. ^ Ченг Ю (август 2018 г.). «Одночастичная крио-ЭМ-Как она сюда попала и куда пойдет». Наука . 361 (6405): 876–880. Бибкод : 2018Sci...361..876C. doi : 10.1126/science.aat4346. ПМК 6460916 . ПМИД  30166484. 
  33. ^ Сяо, К., Фишер, М.Г., Болотауло, Д.М., Уллоа-Рондо, Н., Авила, Г.А. и Саттл, Калифорния (2017) «Крио-ЭМ-реконструкция капсида вируса Cafeteria roenbergensis предполагает новый путь сборки гигантских вирусов. ". Scientific Reports , 7 : 5484. doi : 10.1038/s41598-017-05824-w.