Криогенная электронная микроскопия ( криоЭМ ) — это метод криомикроскопии , применяемый к образцам, охлажденным до криогенных температур. Для биологических образцов структура сохраняется путем помещения их в среду стекловидного льда . Водный раствор образца наносится на сетку и замораживается погружением в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана . [1] Хотя разработка этого метода началась в 1970-х годах, последние достижения в области детекторных технологий и алгоритмов программного обеспечения позволили определять биомолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [2] Это привлекло широкое внимание к этому подходу как альтернативе рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии для определения структуры макромолекул без необходимости кристаллизации. [3]
В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [4] Компания Nature Methods также назвала криоЭМ «методом года» в 2015 году. [5]
В 1960-е годы использование просвечивающей электронной микроскопии для определения структуры было ограничено из-за радиационного повреждения пучками электронов высокой энергии. Ученые предположили, что исследование образцов при низких температурах уменьшит радиационные повреждения, вызванные лучом. [6] И жидкий гелий (-269 ° C или 4 K или -452,2 ° F ), так и жидкий азот (-195,79 ° C или 77 K или -320 ° F) считались криогенами. В 1980 году Эрвин Кнапек и Жак Дюбоше опубликовали комментарии о повреждении пучка при криогенных температурах, поделившись наблюдениями о том, что:
Было обнаружено, что тонкие кристаллы, закрепленные на углеродной пленке, в 30–300 раз более устойчивы к лучу при 4 К, чем при комнатной температуре... Большую часть наших результатов можно объяснить, предположив, что криозащита в области 4 К сильно зависит от температура. [7]
Однако эти результаты не удалось воспроизвести, и всего два года спустя в журнале Nature были опубликованы поправки , в которых сообщалось, что сопротивление луча было менее значительным, чем первоначально предполагалось. Защита, полученная при 4 К, была ближе «в десять раз для стандартных образцов L- валина » [8] , чем утверждалось ранее.
В 1981 году Аласдер МакДауэлл и Жак Дюбоше, ученые Европейской лаборатории молекулярной биологии , сообщили о первом успешном внедрении криоЭМ. [9] Макдауэлл и Дюбоше остекловали чистую воду в виде тонкой пленки, распылив ее на гидрофильную углеродную пленку, которую быстро погрузили в криоген (жидкий пропан или жидкий этан, охлажденный до 77 К). Тонкий слой аморфного льда имел толщину менее 1 мкм, и электронограмма подтвердила наличие аморфного/стекловидного льда. В 1984 году группа Дюбоше продемонстрировала возможности криоЭМ в структурной биологии с анализом витрифицированного аденовируса типа 2, бактериофага Т4 , вируса леса Семлики , бактериофага CbK и вируса везикулярного стоматита . [10]
2010-е годы ознаменовались резким развитием электронных камер. Примечательно, что усовершенствования, внесенные в детекторы прямых электронов, привели к «революции разрешения» [11] , подтолкнув барьер разрешения ниже критического предела ~ 2-3 Å для определения положения и ориентации аминокислот. [12]
Хендерсон ( Лаборатория молекулярной биологии MRC , Кембридж, Великобритания) сформировал консорциум с инженерами лаборатории Резерфорда Эпплтона и учеными Общества Макса Планка для финансирования и разработки первого прототипа. Затем консорциум объединил усилия с производителем электронных микроскопов FEI , чтобы представить и продать новую конструкцию. Примерно в то же время компания Gatan Inc. из Плезантона, Калифорния, представила аналогичный детектор, разработанный Питером Денесом ( Национальная лаборатория Лоуренса Беркли ) и Дэвидом Агардом ( Калифорнийский университет, Сан-Франциско ). Третий тип камеры был разработан Нгуеном-Хуу Сюонгом в компании Direct Electron ( Сан-Диего, Калифорния ). [11]
В последнее время достижения в использовании каркасов для визуализации на основе белков помогают решить проблемы смещения ориентации образца и ограничения размера. Белки размером менее ~50 кДа обычно имеют недостаточное соотношение сигнал/шум для разрешения белковых частиц на изображении, что затрудняет или делает невозможным трехмерную реконструкцию. [13] Каркасы для визуализации повышают SNR более мелких белков, связывая их с более крупным объектом — каркасом. Группа Йейтса из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе смогла создать более четкое изображение трех вариантов KRAS (размером примерно 19 кДа), используя жесткий каркас для визуализации и используя DARPins в качестве модульного связывающего домена между каркасом и интересующим белком. [14]
В знак признания влияния криоЭМ на биохимию трое учёных, Жак Дюбоше , Иоахим Франк и Ричард Хендерсон , были удостоены Нобелевской премии по химии «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [4]
Традиционно рентгеновская кристаллография была самым популярным методом определения трехмерных структур биологических молекул. [15] Однако вышеупомянутые усовершенствования криоЭМ увеличили ее популярность как инструмента для изучения деталей биологических молекул. С 2010 года ежегодные депозиты криоЭМ-структур опередили рентгеновскую кристаллографию. [16] Хотя рентгеновская кристаллография имеет значительно больше общих депозитов из-за более длительной истории, по прогнозам, общее количество депозитов обоих методов затмится примерно к 2035 году. [16]
Разрешение рентгеновской кристаллографии ограничено однородностью кристаллов, [17] и приведение биологических молекул с неизвестными идеальными условиями кристаллизации в кристаллическое состояние может занять очень много времени, в крайних случаях занимающих месяцы или даже годы. [18] Напротив, подготовка проб в криоЭМ может потребовать нескольких раундов скрининга и оптимизации для преодоления таких проблем, как агрегация белков и предпочтительная ориентация, [19] [20] , но для этого не требуется, чтобы образец образовывал кристалл, а нужны образцы для криоЭМ подвергаются мгновенной заморозке и исследуются в состоянии, близком к нативному. [21]
По данным Proteopedia , среднее разрешение, достигнутое с помощью рентгеновской кристаллографии (по состоянию на 19 мая 2019 г.) в Банке данных белков, составляет 2,05 Å [17] , а самое высокое разрешение, достигнутое за всю историю наблюдений (по состоянию на 30 сентября 2022 г.), составляет 0,48. О. [22] По состоянию на 2020 год большинство белковых структур, определенных с помощью криоЭМ, имеют более низкое разрешение - 3–4 Å. [23] Однако по состоянию на 2020 год лучшее разрешение криоЭМ было зафиксировано при 1,22 Å, [20] что в некоторых случаях делало его конкурентом по разрешению.
В 2019 году корреляционный свет CryoTEM и CryoET использовался для наблюдения туннелирующих нанотрубок (ТНТ) в нейрональных клетках. [24]
Сканирующая электронная криомикроскопия (криоСЭМ) — это метод сканирующей электронной микроскопии с использованием холодного столика сканирующего электронного микроскопа в криогенной камере.
Криогенная трансмиссионная электронная микроскопия (криоТЕМ) — это метод трансмиссионной электронной микроскопии , который используется в структурной биологии и материаловедении . В просторечии термин «криогенная электронная микроскопия» или его сокращение «криоЭМ» по умолчанию относится к криогенной трансмиссионной электронной микроскопии, поскольку подавляющее большинство криоЭМ выполняется в трансмиссионных электронных микроскопах, а не в сканирующих электронных микроскопах.
Федеральный технологический институт , Университет Лозанны и Женевский университет открыли Центр визуализации Дюбоше (DCI) в конце ноября 2021 года с целью применения и дальнейшего развития криоЭМ. [25] Менее чем через месяц после первой идентификации варианта Омикрон SARS-CoV-2 исследователи из DCI смогли определить его структуру, выявить важные мутации, позволяющие обойти отдельные вакцины, и предоставить информацию о новых терапевтических подходах. [26]
Датский национальный криоЭМ-центр, также известный как EMBION, был открыт 1 декабря 2016 года. EMBION — это криоЭМ-консорциум датских университетов (принимающий Орхусский университет и соучредитель Копенгагенского университета).