Направленная дифференциация — это биоинженерная методология на стыке биологии стволовых клеток , биологии развития и тканевой инженерии . [1] По сути, она использует потенциал стволовых клеток, ограничивая их дифференциацию in vitro в направлении определенного типа клеток или интересующей ткани . [2] Стволовые клетки по определению плюрипотентны , способны дифференцироваться в несколько типов клеток, таких как нейроны , [3] кардиомиоциты , гепатоциты и т. д. Эффективная направленная дифференциация требует детального понимания решения о происхождении и судьбе клеток , часто предоставляемого биологией развития. [2] [4]
Во время дифференциации плюрипотентные клетки принимают ряд решений развития, чтобы сначала сформировать три зародышевых слоя ( эктодерму , мезодерму и энтодерму ) эмбриона и промежуточных предшественников, [5] за которыми следуют последующие решения или контрольные точки, дающие начало всем зрелым тканям организма. [4] Процесс дифференциации можно смоделировать как последовательность бинарных решений, основанных на вероятностных или стохастических моделях. Биология развития и эмбриология предоставляют базовые знания о дифференциации типов клеток посредством анализа мутаций , отслеживания родословной, микроманипуляций эмбрионов и исследований экспрессии генов . Дифференциация клеток и органогенез тканей включают ограниченный набор сигнальных путей развития . [4] Таким образом, можно направлять судьбу клеток, контролируя решения клеток посредством внеклеточной сигнализации, имитируя сигналы развития.
Направленная дифференциация в первую очередь применяется к плюрипотентным стволовым клеткам (PSC) млекопитающего происхождения, в частности, к клеткам мыши и человека для биомедицинских исследовательских приложений. [5] С момента открытия эмбриональных стволовых клеток (ES) (1981) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS) (2006) исходный материал потенциально неограничен. [1] [4] [6] Исторически также использовались клетки эмбриональной карциномы (EC). [7] Фибробласты или другие дифференцированные типы клеток использовались для стратегий прямого перепрограммирования . [1]
Дифференциация клеток включает переход от пролиферативного режима к режиму дифференциации. Направленная дифференциация заключается в имитации решений развития (развития эмбриона) in vitro с использованием стволовых клеток в качестве исходного материала. [1] Для этой цели плюрипотентные стволовые клетки (PSC) культивируются в контролируемых условиях, включающих специфический субстрат или внеклеточные матрицы, способствующие адгезии и дифференциации клеток, и определяют составы культуральных сред . [4] Ограниченное количество сигнальных факторов, таких как факторы роста или малые молекулы , контролирующие дифференциацию клеток, применяется последовательно или комбинаторно, в различных дозировках и времени воздействия. [1] Правильная дифференциация интересующего типа клеток проверяется путем анализа специфических маркеров типа клеток , профиля экспрессии генов и функциональных анализов. [1]
Поддерживающие клетки и матрицы обеспечивают сигналы окружающей среды, подобные сигналам развития. [8]
Этот метод заключается в воздействии на клетки специфических модуляторов сигнальных путей и манипулировании условиями культивирования клеток (окружающей среды или экзогенными) для имитации естественной последовательности решений развития для получения заданного типа клеток/ткани. [1] [8] Недостатком этого подхода является необходимость хорошего понимания того, как формируется интересующий тип клеток. [1]
Этот метод, также известный как трансдифференциация или прямая конверсия, заключается в сверхэкспрессии одного или нескольких факторов, обычно факторов транскрипции, введенных в клетки. [1] Исходным материалом могут быть либо плюрипотентные стволовые клетки (PSC), либо любой дифференцированный тип клеток, такой как фибробласты. Принцип был впервые продемонстрирован в 1987 году с миогенными факторами MyoD. [9] Недостатком этого подхода является введение чужеродной нуклеиновой кислоты в клетки и принудительная экспрессия факторов транскрипции, эффекты которых до конца не изучены.
Этот метод заключается в выборе интересующего типа клеток, обычно с устойчивостью к антибиотикам . Для этой цели исходные клетки материала модифицируются так, чтобы они содержали кассету устойчивости к антибиотикам под специфичным для целевого типа клеток промоутером . [10] [11] Только клетки, приверженные интересующей линии, выживают после отбора .
Направленная дифференциация обеспечивает потенциально неограниченный и манипулируемый источник клеток и тканей. Некоторые приложения затруднены незрелым фенотипом типа клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), что ограничивает возможные физиологические и функциональные исследования. [6] Возникло несколько областей применения:
Для фундаментальной науки , в частности биологии развития и клеточной биологии , клетки, полученные из ПСК , позволяют изучать на молекулярном и клеточном уровнях фундаментальные вопросы in vitro, [5] которые в противном случае было бы крайне сложно или невозможно изучать по техническим и этическим причинам in vivo, например, эмбриональное развитие человека. В частности, дифференцирующиеся клетки поддаются количественным и качественным исследованиям. [8] Более сложные процессы также могут быть изучены in vitro, и было описано образование органоидов, включая цереброиды, глазной бокал и почку .
Типы клеток, дифференцированные от плюрипотентных стволовых клеток (PSC), оцениваются как доклинические in vitro модели заболеваний человека. [5] Типы клеток человека в чашке Петри представляют собой альтернативу традиционным доклиническим анализам с использованием животных, бессмертных клеток человека или первичных культур из биопсий , которые имеют свои ограничения. Клинически значимые типы клеток, т. е. типы клеток, затронутые заболеваниями, являются основным направлением исследований, сюда входят гепатоциты , бета-клетки островков Лангерганса , [12] кардиомиоциты и нейроны . Скрининг лекарств проводится на миниатюризированной клеточной культуре в многолуночных планшетах или на чипе. [6]
Клетки, полученные из PSC, от пациентов используются in vitro для воссоздания определенных патологий. [6] Конкретный тип клеток, затронутый патологией, лежит в основе модели. Например, мотонейроны используются для изучения спинальной мышечной атрофии (СМА), а кардиомиоциты [2] используются для изучения аритмии . Это может позволить лучше понять патогенез и разработать новые методы лечения посредством открытия лекарств. [6] Незрелые типы клеток, полученные из PSC, могут созревать in vitro с помощью различных стратегий, таких как старение in vitro, для моделирования возрастных заболеваний in vitro. Основными заболеваниями, моделируемыми с помощью клеток, полученных из ПСК, являются боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), синдром ломкой Х-хромосомы (СФХ), болезнь Хантингтона (БХ), синдром Дауна , спинальная мышечная атрофия (СМА), мышечные дистрофии , [13] [14] муковисцидоз , синдром удлиненного интервала QT и диабет I типа . [6]
Потенциально неограниченный источник клеток и тканей может иметь прямое применение для тканевой инженерии , замены и трансплантации клеток после острых травм и реконструктивной хирургии . [2] [5] Эти приложения ограничены типами клеток, которые могут быть эффективно и безопасно дифференцированы из человеческих ПСК с надлежащим органогенезом . [1] Децеллюляризованные органы также используются в качестве тканевого каркаса для органогенеза. Исходным материалом могут быть нормальные здоровые клетки от другого донора (гетерологичная трансплантация) или генетически скорректированные от того же пациента (аутологичная). Возникли опасения по поводу безопасности пациентов из-за возможности заражения недифференцированных клеток. Первое клиническое исследование с использованием клеток, полученных из hESC, было проведено в 2011 году. [15] Первое клиническое исследование с использованием клеток, полученных из hiPSC, началось в 2014 году в Японии. [16]
