Ономологичное соединение концов ( NHEJ ) — это путь восстановления двухцепочечных разрывов ДНК. Его называют «негомологичным», потому что концы разрыва напрямую лигируются без необходимости использования гомологичной матрицы, в отличие от гомологичной репарации (HDR), которая требует гомологичной последовательности для управления репарацией. NHEJ активен как в неделящихся, так и в пролиферирующих клетках, тогда как HDR труднодоступен в неделящихся клетках. [1] Термин «негомологическое соединение концов» был придуман в 1996 году Муром и Хабером. [2]
NHEJ обычно руководствуется короткими гомологичными последовательностями ДНК, называемыми микрогомологиями. Эти микрогомологии часто присутствуют в виде одноцепочечных выступов на концах двухцепочечных разрывов. Если свесы идеально совместимы, NHEJ обычно аккуратно ремонтирует поломку. [2] [3] [4] [5] Также может произойти неточная репарация, приводящая к потере нуклеотидов, но гораздо чаще встречается, когда выступающие части несовместимы. Неправильный NHEJ может привести к транслокациям и слиянию теломер , что является признаком опухолевых клеток. [6]
Предполагается, что реализации NHEJ существуют почти во всех биологических системах, и это преобладающий путь восстановления двухцепочечных разрывов в клетках млекопитающих. [7] Однако у почкующихся дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ) гомологичная рекомбинация доминирует, когда организм выращивается в обычных лабораторных условиях.
Когда путь NHEJ инактивирован, двухцепочечные разрывы могут быть устранены с помощью более подверженного ошибкам пути, называемого микрогомологически-опосредованным соединением концов (MMEJ). В этом случае концевая резекция выявляет короткие микрогомологии по обе стороны от разрыва, которые затем выравниваются для направления восстановления. [8] Это контрастирует с классическим NHEJ, который обычно использует микрогомологии, уже обнаруженные в одноцепочечных выступах на концах DSB. Таким образом, репарация с помощью MMEJ приводит к удалению последовательности ДНК между микрогомологиями.
У многих видов бактерий, включая Escherichia coli , отсутствует путь соединения концов, и поэтому они полностью полагаются на гомологичную рекомбинацию для восстановления двухцепочечных разрывов. Белки NHEJ были идентифицированы у ряда бактерий, включая Bacillus subtilis , Mycobacterium Tuberculosis и Mycobacterium smegmatis . [9] [10] Бактерии используют удивительно компактную версию NHEJ, в которой все необходимые активности содержатся только в двух белках: гомодимере Ku и многофункциональной лигазе/полимеразе/нуклеазе LigD . [11] У микобактерий NHEJ гораздо более подвержен ошибкам, чем у дрожжей, поскольку основания часто добавляются и удаляются с концов двухцепочечных разрывов во время репарации. [10] Многие бактерии, обладающие белками NHEJ, проводят значительную часть своего жизненного цикла в стационарной гаплоидной фазе, в которой матрица для рекомбинации недоступна. [9] NHEJ, возможно, развился, чтобы помочь этим организмам пережить DSB, вызванный во время высыхания. Он предпочтительно использует rNTP (нуклеотиды РНК), что, возможно, выгодно в спящих клетках. [12]
Архейная система NHEJ у Methanocella paludicola имеет гомодимерный Ku, но три функции LigD разбиты на три однодоменных белка, имеющих общий оперон. Все три гена сохраняют значительную гомологию со своими аналогами LigD, а полимераза сохраняет предпочтение rNTP. [13] NHEJ неоднократно терялся и приобретался у бактерий и архей, при этом значительный объем горизонтального переноса генов перетасовывал систему вокруг таксонов. [14]
Corndog и Omega, два родственных микобактериофага Mycobacterium smegmatis , также кодируют гомологи Ku и используют путь NHEJ для рециркуляции своих геномов во время инфекции. [15] В отличие от гомологичной рекомбинации, которая широко изучалась на бактериях, NHEJ был первоначально обнаружен у эукариот и был идентифицирован у прокариот только в последнее десятилетие.
В отличие от бактерий, NHEJ у эукариот использует ряд белков , которые участвуют в следующих этапах:
У дрожжей комплекс Mre11-Rad50-Xrs2 ( MRX ) рано рекрутируется в DSB и, как полагают, способствует соединению концов ДНК. [16] Соответствующий комплекс Mre11-Rad50- Nbs1 ( MRN ) у млекопитающих также участвует в NHEJ, но он может функционировать на нескольких этапах пути, помимо простого удержания концов в непосредственной близости. [17] Также считается, что DNA-PKcs участвует в соединении концов во время NHEJ млекопитающих. [18]
Эукариотический Ku представляет собой гетеродимер, состоящий из Ku70 и Ku80 , и образует комплекс с ДНК-PKcs, который присутствует у млекопитающих , но отсутствует у дрожжей . Ku представляет собой молекулу в форме корзины, которая скользит по концу ДНК и перемещается внутрь. Ku может функционировать как сайт стыковки для других белков NHEJ и, как известно, взаимодействует с комплексом ДНК-лигазы IV и XLF . [19] [20]
Конечный процессинг включает удаление поврежденных или несовпадающих нуклеотидов нуклеазами и ресинтез ДНК-полимеразами. В этом этапе нет необходимости, если концы уже совместимы и имеют 3'-гидроксильный и 5'-фосфатный концы.
О функции нуклеаз в NHEJ известно немного. Артемида необходима для раскрытия шпилек, образующихся на концах ДНК во время рекомбинации V(D)J , особого типа NHEJ, а также может участвовать в обрезке концов во время общего NHEJ. [21] Mre11 обладает нуклеазной активностью, но, по-видимому, он участвует в гомологичной рекомбинации , а не NHEJ.
ДНК-полимеразы семейства X Pol λ и Pol μ (Pol4 у дрожжей ) заполняют пробелы во время NHEJ. [4] [22] [23] Дрожжи, у которых отсутствует Pol4, не способны соединяться с 3'-выступами, которые требуют заполнения промежутков, но остаются способными заполнять промежутки в 5'-выступах. [24] Это связано с тем, что конец праймера, используемый для инициации синтеза ДНК, менее стабилен на 3'-концах, что требует специализированной полимеразы NHEJ.
Комплекс ДНК-лигазы IV, состоящий из каталитической субъединицы ДНК-лигазы IV и ее кофактора XRCC4 (Dnl4 и Lif1 у дрожжей), выполняет стадию репарации лигирования. [25] XLF , также известный как Cernunnos, гомологичен дрожжевому Nej1 и также необходим для NHEJ. [26] [27] Хотя точная роль XLF неизвестна, он взаимодействует с комплексом XRCC4/ДНК-лигаза IV и, вероятно, участвует в стадии лигирования. [28] Недавние данные свидетельствуют о том, что XLF способствует повторному аденилированию ДНК-лигазы IV после лигирования, перезаряжая лигазу и позволяя ей катализировать второе лигирование. [29]
У дрожжей Sir2 первоначально был идентифицирован как белок NHEJ, но теперь известно, что он необходим для NHEJ только потому, что он необходим для транскрипции Nej1. [30]
NHEJ и термолабильные сайты
Индукция термолабильных участков (HLS) является признаком ионизирующего излучения. Участки кластерного повреждения ДНК состоят из различных типов повреждений ДНК. Некоторые из этих поражений не являются мгновенными DSB, но после нагревания превращаются в DSB. HLS не эволюционируют в DSB при физиологической температуре (370°C). Кроме того, взаимодействие HLS с другими поражениями и их роль в живых клетках пока неясны. Механизмы репарации этих участков до конца не раскрыты. NHEJ является доминирующим путем восстановления ДНК на протяжении всего клеточного цикла. Белок DNA-PKcs является критическим элементом в центре NHEJ. Использование клеточных линий DNA-PKcs KO или ингибирование DNA-PKcs не влияет на способность к репарации HLS. Также блокирование путей восстановления HR и NHEJ ингибитором дактолисиба (NVP-BEZ235) показало, что восстановление HLS не зависит от HR и NHEJ. Эти результаты показали, что механизм репарации HLS не зависит от путей NHEJ и HR [31].
Выбор между NHEJ и гомологичной рекомбинацией для восстановления двухцепочечного разрыва регулируется на начальном этапе рекомбинации - резекции 5'-конца. На этом этапе 5'-цепь разрыва разрушается нуклеазами с образованием длинных 3'-одноцепочечных хвостов. DSB, которые не были удалены, могут быть воссоединены с помощью NHEJ, но резекция даже нескольких нуклеотидов сильно ингибирует NHEJ и эффективно фиксирует разрыв для восстановления путем рекомбинации. [23] NHEJ активен на протяжении всего клеточного цикла, но наиболее важен во время G1 , когда гомологичная матрица для рекомбинации недоступна. Эта регуляция осуществляется циклинзависимой киназой Cdk1 ( Cdc28 у дрожжей), которая отключается в G1 и экспрессируется в S и G2 . Cdk1 фосфорилирует нуклеазу Sae2, позволяя начать резекцию. [32]
NHEJ играет решающую роль в рекомбинации V(D)J , процессе, посредством которого в иммунной системе позвоночных генерируется разнообразие рецепторов B-клеток и T-клеток . [33] При рекомбинации V(D)J двухцепочечные разрывы, блокированные шпилькой, создаются нуклеазой RAG1/RAG2 , которая расщепляет ДНК по сигнальным последовательностям рекомбинации. [34] Эти шпильки затем открываются нуклеазой Артемиды и присоединяются к ним NHEJ. [21] Специализированная ДНК-полимераза, называемая терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT), которая экспрессируется только в лимфатической ткани, добавляет нешаблонные нуклеотиды к концам перед соединением разрыва. [35] [36] Этот процесс объединяет «вариабельные» (V), «разнообразные» (D) и «объединяющиеся» (J) области, которые при сборке вместе создают вариабельную область B-клеточного или Т-клеточного рецептора. ген. В отличие от типичного клеточного NHEJ, при котором точная репарация является наиболее благоприятным исходом, склонная к ошибкам репарация при рекомбинации V(D)J полезна, поскольку она максимизирует разнообразие кодирующей последовательности этих генов. Пациенты с мутациями в генах NHEJ не способны производить функциональные В- и Т-клетки и страдают тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID).
Теломеры обычно защищены «колпачком», который не позволяет распознать их как двухцепочечные разрывы. Потеря кэпирующих белков вызывает укорочение теломер и неправильное соединение NHEJ, в результате чего образуются дицентрические хромосомы, которые затем разрываются во время митоза. Парадоксально, но некоторые белки NHEJ участвуют в покрытии теломер. Например, Ku локализуется в теломерах, а его удаление приводит к укорочению теломер. [37] Ku также необходим для субтеломерного молчания, процесса, посредством которого выключаются гены, расположенные вблизи теломер.
Несколько человеческих синдромов связаны с дисфункциональным NHEJ. [38] Гипоморфные мутации в LIG4 и XLF вызывают синдром LIG4 и XLF-SCID соответственно. Эти синдромы имеют много общих черт, включая клеточную радиочувствительность, микроцефалию и тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) из-за дефектной рекомбинации V(D)J . Мутации потери функции у Artemis также вызывают SCID, но у этих пациентов не обнаруживаются неврологические дефекты, связанные с мутациями LIG4 или XLF. Разницу в степени тяжести можно объяснить ролью мутировавших белков. Артемида является нуклеазой и, как полагают, необходима только для восстановления DSB с поврежденными концами, тогда как ДНК-лигаза IV и XLF необходимы для всех событий NHEJ. Мутации в генах, участвующих в негомологичном соединении концов, приводят к атаксии-телеангиэктазии (ген ATM), анемии Фанкони (множественные гены), а также наследственному раку молочной железы и яичников (ген BRCA1).
У мышей были нокаутированы многие гены NHEJ . Делеция XRCC4 или LIG4 вызывает гибель эмбрионов у мышей, указывая на то, что NHEJ необходим для жизнеспособности млекопитающих. Напротив, мыши, лишенные Ku или DNA-PKcs, жизнеспособны, вероятно, потому, что низкие уровни соединения концов все еще могут возникать в отсутствие этих компонентов. [39] Все мутантные мыши NHEJ демонстрируют фенотип SCID, чувствительность к ионизирующему излучению и апоптоз нейронов.
Была разработана система для измерения эффективности NHEJ у мышей. [40] Эффективность NHEJ можно было сравнить в тканях одной и той же мыши и у мышей разного возраста. Эффективность была выше в фибробластах кожи, легких и почек и ниже в фибробластах сердца и астроцитах головного мозга. Более того, эффективность NHEJ снижалась с возрастом. Снижение составило от 1,8 до 3,8 раз, в зависимости от ткани, у 5-месячных мышей по сравнению с 24-месячными мышами. Снижение способности NHEJ может привести к увеличению количества невосстановленных или неправильно восстановленных двухцепочечных разрывов ДНК, которые затем могут способствовать старению. [41] (Также см. теорию старения, связанную с повреждением ДНК .) Анализ уровня белка NHEJ Ku80 у человека, коровы и мыши показал, что уровни Ku80 резко различаются между видами и что эти уровни сильно коррелируют с видовым долголетием. [42]