Эндоспора — это спящая , жесткая и нерепродуктивная структура, производимая некоторыми бактериями типа Bacillota . [1] [2] Название « эндоспора » предполагает спору или семенную форму ( эндо означает «внутри»), но это не настоящая спора (т. е. не потомок). Это урезанная, спящая форма, до которой бактерия может редуцироваться. Образование эндоспор обычно вызывается недостатком питательных веществ и обычно происходит у грамположительных бактерий . При образовании эндоспор бактерия делится внутри своей клеточной стенки, а затем одна сторона поглощает другую. [3] Эндоспоры позволяют бактериям находиться в состоянии покоя в течение длительных периодов времени, даже столетий. Существует много сообщений о спорах, остающихся жизнеспособными более 10 000 лет, и было заявлено о возрождении спор, возраст которых составляет миллионы лет. Существует одно сообщение о жизнеспособных спорах Bacillus marismortui в соляных кристаллах возрастом около 25 миллионов лет. [4] [5] Когда окружающая среда становится более благоприятной, эндоспора может реактивироваться в вегетативное состояние. Большинство типов бактерий не могут перейти в форму эндоспоры. Примерами видов бактерий , которые могут образовывать эндоспоры, являются Bacillus cereus , Bacillus anthracis , Bacillus thuringiensis , Clostridium botulinum и Clostridium tetani . [6] Образование эндоспор не обнаружено среди архей . [7]
Эндоспора состоит из ДНК бактерии , рибосом и большого количества дипиколиновой кислоты . Дипиколиновая кислота — это специфичное для спор химическое вещество, которое, по-видимому, помогает эндоспорам сохранять состояние покоя. Это химическое вещество составляет до 10% сухого веса споры. [3]
Эндоспоры могут выживать без питательных веществ. Они устойчивы к ультрафиолетовому излучению , высыханию , высокой температуре, экстремальному замораживанию и химическим дезинфицирующим средствам . Впервые термоустойчивые эндоспоры были выдвинуты Фердинандом Коном после изучения роста Bacillus subtilis на сыре после кипячения сыра. Его идея о том, что споры являются репродуктивным механизмом для роста, стала большим ударом по предыдущим предположениям о спонтанном зарождении. Астрофизик Стейнн Сигурдссон сказал: «На Земле были обнаружены жизнеспособные бактериальные споры, которым 40 миллионов лет, и мы знаем, что они очень устойчивы к радиации». [8] Обычные антибактериальные средства, которые работают, разрушая стенки вегетативных клеток, не влияют на эндоспоры. Эндоспоры обычно встречаются в почве и воде, где они могут выживать в течение длительных периодов времени. Различные микроорганизмы образуют «споры» или «цисты», но эндоспоры грамположительных бактерий с низким содержанием G+C являются наиболее устойчивыми к суровым условиям. [3]
Некоторые классы бактерий могут превращаться в экзоспоры, также известные как микробные цисты , вместо эндоспор. Экзоспоры и эндоспоры — это два вида «спящих» или спящих стадий, наблюдаемых у некоторых классов микроорганизмов.
Жизненный цикл бактерий не обязательно включает споруляцию. Спорообразование обычно вызывается неблагоприятными условиями окружающей среды, чтобы помочь выживанию бактерии. Эндоспоры не проявляют признаков жизни и, таким образом, могут быть описаны как криптобиотические . Эндоспоры сохраняют жизнеспособность неограниченно долго и могут прорастать в вегетативные клетки при соответствующих условиях. Эндоспоры выживали тысячи лет, пока внешние стимулы не вызвали прорастание. Они были охарактеризованы как самые долговечные клетки, производимые в природе. [9]
Бактерии производят одну эндоспору внутри. Спора иногда окружена тонким покрытием, известным как экзоспорий , который покрывает оболочку споры . Оболочка споры, которая действует как сито , которое исключает крупные токсичные молекулы, такие как лизоцим , устойчива ко многим токсичным молекулам и также может содержать ферменты , которые участвуют в прорастании . В эндоспорах Bacillus subtilus оболочка споры, по оценкам, содержит более 70 белков оболочки, которые организованы во внутренний и внешний слои оболочки. [10] Картина рентгеновской дифракции очищенных эндоспор B. subtilis указывает на присутствие компонента с регулярной периодической структурой, который, как предположили Кадота и Иидзима, может быть образован из кератинподобного белка. [11] Однако после дальнейших исследований эта группа пришла к выводу, что структура белка оболочки споры отличается от кератина. [12] При секвенировании генома B. subtilis не было обнаружено ортолога человеческого кератина. [13] Кортекс лежит под оболочкой споры и состоит из пептидогликана . Стенка ядра лежит под кортексом и окружает протопласт или ядро эндоспоры. Ядро содержит хромосомную ДНК споры, которая заключена в хроматин - подобные белки, известные как SASP (малые кислоторастворимые споровые белки), которые защищают ДНК споры от УФ- излучения и тепла. Ядро также содержит нормальные клеточные структуры, такие как рибосомы и другие ферменты , но не является метаболически активным.
До 20% сухого веса эндоспоры состоит из дипиколината кальция в ядре, который, как полагают, стабилизирует ДНК. Дипиколиновая кислота может быть ответственна за термостойкость споры, а кальций может способствовать устойчивости к теплу и окислителям. Однако были выделены мутанты, устойчивые к теплу, но лишенные дипиколиновой кислоты, что предполагает наличие других механизмов, способствующих термостойкости. [14] В эндоспорах обнаружены небольшие кислоторастворимые белки (SASP). Эти белки прочно связывают и конденсируют ДНК и частично отвечают за устойчивость к ультрафиолетовому излучению и химикатам, повреждающим ДНК. [3]
Визуализация эндоспор под световым микроскопом может быть затруднена из-за непроницаемости стенки эндоспоры для красителей и пятен . В то время как остальная часть бактериальной клетки может окрашиваться, эндоспора остается бесцветной. Чтобы бороться с этим, используется специальная техника окрашивания, называемая окраской Меллера . Она позволяет эндоспоре выглядеть красной, в то время как остальная часть клетки окрашивается в синий цвет. Другой метод окрашивания эндоспор — это окраска Шеффера-Фултона , которая окрашивает эндоспоры в зеленый цвет, а бактериальные тела в красный. Расположение слоев спор следующее:
Положение эндоспор различается у разных видов бактерий и полезно для идентификации. Основными типами внутри клетки являются терминальные, субтерминальные и центрально расположенные эндоспоры. Терминальные эндоспоры видны на полюсах клеток, тогда как центральные эндоспоры находятся более или менее посередине. Субтерминальные эндоспоры находятся между этими двумя крайностями, обычно они видны достаточно далеко по направлению к полюсам, но достаточно близко к центру, чтобы их нельзя было считать ни терминальными, ни центральными. Иногда встречаются латеральные эндоспоры.
Примерами бактерий, имеющих терминальные эндоспоры, являются Clostridium tetani , патоген, вызывающий столбняк . Бактерии, имеющие центрально расположенную эндоспору, включают Bacillus cereus . Иногда эндоспора может быть настолько большой, что клетка может растягиваться вокруг эндоспоры. Это типично для Clostridium tetani .
В условиях голодания, особенно при недостатке источников углерода и азота, внутри некоторых бактерий образуется одна эндоспора в результате процесса, называемого споруляцией. [15]
Когда бактерия обнаруживает, что условия окружающей среды становятся неблагоприятными, она может начать процесс эндоспоруляции, который занимает около восьми часов. ДНК реплицируется, и между ней и остальной частью клетки начинает формироваться мембранная стенка, известная как споровая перегородка . Плазматическая мембрана клетки окружает эту стенку и отщипывается, оставляя двойную мембрану вокруг ДНК, а развивающаяся структура теперь известна как проспора. Дипиколинат кальция, кальциевая соль дипиколиновой кислоты, в это время включается в проспору. Дипиколиновая кислота помогает стабилизировать белки и ДНК в эндоспоре. [16] : 141 Затем между двумя слоями формируется пептидогликановый кортекс, и бактерия добавляет споровую оболочку к внешней стороне проспоры. На последних стадиях формирования эндоспоры новообразующаяся эндоспора обезвоживается и созревает перед высвобождением из материнской клетки. [3] Кортекс — это то, что делает эндоспору такой устойчивой к температуре. Кора содержит внутреннюю мембрану, известную как ядро. Внутренняя мембрана, окружающая это ядро, обеспечивает устойчивость эндоспоры к ультрафиолетовому излучению и агрессивным химикатам, которые обычно уничтожают микробы. [3] Спорообразование теперь завершено, и зрелая эндоспора будет освобождена, когда окружающая вегетативная клетка деградирует.
Эндоспоры устойчивы к большинству агентов, которые обычно убивают вегетативные клетки, из которых они образовались. В отличие от клеток-персистеров , эндоспоры являются результатом процесса морфологической дифференциации, вызванного ограничением питательных веществ (голодом) в окружающей среде; эндоспоруляция инициируется чувством кворума внутри «голодающей» популяции. [16] : 141 Большинство дезинфицирующих средств, таких как бытовые чистящие средства, спирты , четвертичные аммониевые соединения и моющие средства, оказывают незначительное воздействие на эндоспоры. Однако стерилизующие алкилирующие агенты, такие как оксид этилена (ETO) и 10% отбеливатель, эффективны против эндоспор. Чтобы убить большинство спор сибирской язвы , стандартный бытовой отбеливатель (с 10% гипохлорита натрия ) должен контактировать со спорами в течение как минимум нескольких минут; очень небольшая часть спор может выживать дольше 10 минут в таком растворе. [17] Более высокие концентрации отбеливателя не более эффективны и могут привести к скоплению некоторых видов бактерий и, таким образом, их выживанию.
Несмотря на значительную устойчивость к теплу и радиации, эндоспоры можно уничтожить путем сжигания или автоклавирования при температуре, превышающей точку кипения воды, 100 °C. Эндоспоры способны выживать при 100 °C в течение нескольких часов, хотя чем больше часов, тем меньше их выживет. Косвенный способ их уничтожения — поместить их в среду, которая реактивирует их до вегетативного состояния. Они прорастут в течение дня или двух при правильных условиях окружающей среды, а затем вегетативные клетки, не такие выносливые, как эндоспоры, можно напрямую уничтожить. Этот косвенный метод называется тиндаллизацией . Это был обычный метод в течение некоторого времени в конце 19 века до появления недорогих автоклавов. Длительное воздействие ионизирующего излучения , такого как рентгеновские лучи и гамма-лучи , также убьет большинство эндоспор.
Эндоспоры определенных типов (обычно непатогенных) бактерий, таких как Geobacillus stearothermophilus , используются в качестве зондов для проверки того, что автоклавируемый предмет стал действительно стерильным: небольшая капсула, содержащая споры, помещается в автоклав вместе с предметами; после цикла содержимое капсулы культивируется, чтобы проверить, вырастет ли из нее что-нибудь. Если ничего не вырастет, то споры были уничтожены, и стерилизация прошла успешно. [18]
В больницах эндоспоры на деликатных инвазивных инструментах, таких как эндоскопы, убиваются низкотемпературными и некоррозионными стерилизаторами на основе оксида этилена. Окись этилена является единственным низкотемпературным стерилизующим средством, останавливающим вспышки на этих инструментах. [19] Напротив, «высокоуровневая дезинфекция» не убивает эндоспоры, но используется для таких инструментов, как колоноскоп, которые не проникают в стерильные полости тела. Этот последний метод использует только теплую воду, ферменты и моющие средства.
Бактериальные эндоспоры устойчивы к антибиотикам, большинству дезинфицирующих средств и физическим агентам, таким как радиация, кипячение и высушивание. Считается, что непроницаемость оболочки споры отвечает за устойчивость эндоспоры к химикатам. Теплостойкость эндоспор обусловлена рядом факторов:
Реактивация эндоспоры происходит, когда условия более благоприятны, и включает активацию , прорастание и рост . Даже если эндоспора находится в изобилии питательных веществ, она может не прорасти, если не произошла активация. Это может быть вызвано нагреванием эндоспоры. Прорастание включает в себя начало метаболической активности спящей эндоспоры и, таким образом, прерывание спячки. Обычно оно характеризуется разрывом или поглощением оболочки споры, набуханием эндоспоры, повышением метаболической активности и потерей устойчивости к стрессу окружающей среды.
Рост следует за прорастанием и включает в себя производство ядром эндоспоры новых химических компонентов и выход из старой оболочки споры для развития в полностью функциональную вегетативную бактериальную клетку, которая может делиться, производя больше клеток.
Эндоспоры содержат в пять раз больше серы, чем вегетативные клетки. Этот избыток серы концентрируется в оболочках спор в виде аминокислоты цистеина . Считается, что макромолекула, ответственная за поддержание состояния покоя, имеет белковую оболочку, богатую цистеином, стабилизированную связями SS. Уменьшение этих связей может изменить третичную структуру, заставляя белок разворачиваться. Считается, что это конформационное изменение в белке отвечает за обнажение активных ферментативных участков, необходимых для прорастания эндоспор. [20]
Эндоспоры могут оставаться в состоянии покоя в течение очень долгого времени. Например, эндоспоры были найдены в гробницах египетских фараонов. При помещении в соответствующую среду и при соответствующих условиях они могли быть реактивированы. В 1995 году Рауль Кано из Калифорнийского политехнического государственного университета обнаружил бактериальные споры в кишечнике окаменелой пчелы, запертой в янтаре с дерева в Доминиканской Республике . Окаменевшей в янтаре пчеле было около 25 миллионов лет. Споры проросли, когда янтарь был раздроблен, а материал из кишечника пчелы был извлечен и помещен в питательную среду. После того, как споры были проанализированы с помощью микроскопии, было установлено, что клетки были очень похожи на Lysinibacillus sphaericus , который сегодня встречается у пчел в Доминиканской Республике. [16]
В качестве упрощенной модели клеточной дифференциации молекулярные детали образования эндоспор были тщательно изучены, в частности, на модельном организме Bacillus subtilis . Эти исследования внесли большой вклад в наше понимание регуляции экспрессии генов , факторов транскрипции и субъединиц сигма-фактора РНК-полимеразы .
Эндоспоры бактерии Bacillus anthracis использовались в атаках сибирской язвы в 2001 году . Порошок, обнаруженный в зараженных почтовых письмах, состоял из эндоспор сибирской язвы. Это преднамеренное распространение привело к 22 известным случаям сибирской язвы (11 ингаляционной и 11 кожной). Уровень летальности среди пациентов с ингаляционной формой сибирской язвы составил 45% (5/11). Шесть других лиц с ингаляционной формой сибирской язвы и все лица с кожной формой сибирской язвы выздоровели. Если бы не антибиотикотерапия, заболело бы гораздо больше людей. [16]
Согласно ветеринарным документам ВОЗ, B. anthracis спорулирует, когда видит кислород вместо углекислого газа, присутствующего в крови млекопитающих. Это сигнал для бактерий о том, что они достигли конца животного, и неактивная диспергируемая морфология полезна.
Для споруляции требуется наличие свободного кислорода. В естественной ситуации это означает, что вегетативные циклы происходят в среде с низким содержанием кислорода инфицированного хозяина, и внутри хозяина организм находится исключительно в вегетативной форме. Оказавшись вне хозяина, споруляция начинается при контакте с воздухом, и споровые формы по сути являются исключительной фазой в окружающей среде. [21] [22]
Споры Bacillus subtilis полезны для экспрессии рекомбинантных белков и, в частности, для поверхностного отображения пептидов и белков в качестве инструмента для фундаментальных и прикладных исследований в области микробиологии, биотехнологии и вакцинации. [23]
Примерами бактерий, образующих эндоспоры, являются следующие роды:
