stringtranslate.com

Нецелевое редактирование генома

Редактирование генома вне целевого назначения относится к неспецифическим и непреднамеренным генетическим модификациям, которые могут возникнуть в результате использования технологий сконструированных нуклеаз, таких как: кластеризованные, регулярно расположенные, короткие палиндромные повторы ( CRISPR ) - Cas9 , эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции ( TALEN ), мегануклеазы и нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN). [1] Эти инструменты используют различные механизмы для связывания предопределенной последовательности ДНК («цели»), которую они расщепляют (или «разрезают»), создавая двухцепочечный хромосомный разрыв (DSB), который вызывает механизмы репарации ДНК клетки (негомологичное соединение концов ( NHEJ ) и гомологичная рекомбинация ( HR )) и приводит к сайт-специфическим модификациям. [2] Если эти комплексы не связываются с целью, что часто является результатом гомологичных последовательностей и/или толерантности к несоответствию, они будут расщеплять нецелевые DSB и вызывать неспецифические генетические модификации. [3] [4] [5] В частности, нецелевые эффекты состоят из непреднамеренных точечных мутаций , [6] делеций , [7] [8] вставок, [5] инверсий, [5] и транслокаций . [9] [8]

Системы дизайнерских нуклеаз, такие как CRISPR-cas9, становятся все более популярными исследовательскими инструментами в результате их простоты, масштабируемости и доступности. [10] [11] При этом нецелевые генетические модификации встречаются часто и могут изменить функцию в остальном неповрежденных генов. Многочисленные исследования с использованием ранних агентов CRISPR-cas9 показали, что более 50% мутаций, вызванных эндонуклеазой, направляемой РНК, не происходили на мишени. [3] [7] Направляющая РНК Cas9 ( гРНК ) распознает целевую последовательность ДНК из 20 п.н., которую она связывает и расщепляет, чтобы «редактировать» последовательность ДНК. Однако связывание целевой последовательности может допускать несовпадения до нескольких пар оснований, что означает, что часто существуют тысячи возможных участков связывания, которые представляют несколько экспериментальных и безопасных проблем. [12] [3] В исследовательской сфере нецелевые эффекты могут запутать переменные в биологических исследованиях, что приводит к потенциально вводящим в заблуждение и невоспроизводимым результатам. [2] В клинической сфере основные опасения связаны с нарушением жизненно важных кодирующих областей, что приводит к генотоксическим эффектам, таким как рак. [13] Соответственно, улучшение специфичности [14] [15] инструментов редактирования генома и обнаружение [9] [16] нецелевых эффектов являются быстро прогрессирующими областями исследований. Такие исследования включают разработку и открытие дизайнерских нуклеаз [17] , [18] программы и базы данных вычислительного прогнозирования, [19] [20] и высокопроизводительное секвенирование [9] [16] для снижения и прогнозирования возникновения мутаций. Многие инструменты дизайнерских нуклеаз все еще находятся в относительной зачаточном состоянии, и по мере того, как их молекулярные свойства и поведение in vivo будут лучше пониматься, они будут становиться все более точными и предсказуемыми.

Механизмы

Система CRISPR-Cas9 работает как адаптивная иммунная система у бактерий и архей. [21] Когда вирус заражает бактерии, эта система включает сегменты вирусной ДНК в бактериальный геном. При повторном вторжении транскрипты из этих последовательностей направляют нуклеазную активность на ее комплементарную последовательность во вторгающемся вирусе, чтобы уничтожить его. [22] [23] [24]

Для того чтобы экстраполировать этот метод на эукариот для разработки метода редактирования генов, требуются белок Cas9, РНК с распознающей последовательностью и трансактивирующая РНК. Слияние как РНК с распознающей последовательностью CRISPR (crRNA), так и трансактивирующей РНК (tracrRNA) обычно используется в экспериментах и ​​называется одиночной направляющей РНК (sgRNA). [25] Она выполняет обе функции: первые 20 нуклеотидов sgRNA комплементарны целевой последовательности ДНК (функция cr), в то время как следующие нуклеотиды являются частью мотива, смежного с протоспейсером (PAM; функция tracr). [26] [27] [28]

Связывание нецелевой нуклеазы происходит из частичного, но достаточного соответствия целевой последовательности. Механизмы нецелевого связывания можно сгруппировать в две основные формы: толерантность к несовпадению оснований и несовпадение выпуклостей. [29]

Допуск несоответствия базы

В то время как специфичность Cas9, как полагают, контролируется 20-нуклеотидной sgRNA и PAM, нецелевые мутации все еще распространены и могут возникать при несовпадении до 3-5 пар оснований (из 20) между sgRNA и целевой последовательностью ДНК. [25] [30] Кроме того, вторичные структуры sgRNA также могут влиять на расщепление целевых и нецелевых участков. Как упоминалось выше, sgRNA состоит из последовательности (~20 нуклеотидов), которая комплементарна целевым последовательностям, а за ней следует последовательность PAM, которая активирует активность эндонуклеазы . Хотя было показано, что 10-12 нуклеотидов, смежных с PAM (называемых «затравочной последовательностью»), достаточно для специфичности Cas9, Ву и др. показали, что в каталитически мертвом Cas9 для специфичности требуется только 1-5 пар оснований затравочной последовательности. [31] Это было позже доказано и другими исследованиями. На связывание белка Cas9 дополнительно влияет ряд механизмов:

Важно отметить, что метилирование ДНК CpG-сайтов снижает эффективность связывания Cas9 и других факторов в клетках. Следовательно, существует эпигенетическая связь, которая будет более подробно изучена для будущего редактирования эпигенома. [36]

Графическое объяснение выпуклости ДНК и РНК.

Изменения в последовательности PAM также могут влиять на активность sgRNA, в свою очередь влияя на саму sgRNA. В обычно используемых системах Cas9 мотив PAM представляет собой 5' NGG 3', где N представляет любой из четырех нуклеотидов ДНК. Требование последовательности PAM может вызвать проблемы специфичности, поскольку некоторые регионы будут иметь доступную целевую последовательность для выполнения желаемой генетической модификации. В отчете говорится, что 99,96% сайтов, которые ранее считались уникальными мишенями Cas9 в экзонах человека, могут иметь потенциальные нецелевые эффекты, содержащие NAG или NGG PAM и одно несовпадение оснований в последовательности семян. [37]

Несоответствие выпуклости

Как нецелевые сайты с отсутствующими основаниями (или делециями), так и нецелевые сайты с дополнительными основаниями (или вставками), называемые РНК-выпуклостью и ДНК-выпуклостью соответственно, оказывают влияние на специфичность Cas9 и активность расщепления. Лин и др. имитировали эти выступы, добавляя и удаляя основания из последовательности sgRNA таким образом, что удаление основания в sgRNA приводило к выступу РНК, а вставка основания приводила к выступу ДНК. [7] Изучая скорости мутаций с помощью NHEJ, они пришли к следующим результатам:

Улучшения

Визуальное изображение CRISPR-cas9 с использованием нуклеазы SpCas9 дикого типа
Улучшения в технологии CRISPR-Cas9, которые снижают нецелевые эффекты за счет требуемых i) совместной локализации (никазы Cas9) и ii) димеризации (Fok1-dCas9)

Методы повышения специфичности

Широко используемая нуклеаза Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) эффективна, однако она вызывает нежелательные нецелевые мутации с высокой частотой. Было описано несколько методов инженерии и скрининга в попытке уменьшить нецелевые мутации по всему геному, включая мутацию нуклеазы, модификацию последовательности смежного мотива протоспейсера (PAM), усечение направляющей РНК (гРНК) и открытие новой нуклеазы. [39] Например, в 2013 году Фу и др. сообщили, что при укорочении гРНК с <20 п.н. в длину до 17 или 18 п.н. целевая специфичность нуклеазы увеличилась до 5000 раз, а случаи несоответствия более 3 оснований редки, если вообще случаются. [14]

Cas9 никазы

Нуклеаза spCas9 также может быть мутирована различными способами для улучшения специфичности и контроля. Домены нуклеазы могут быть мутированы независимо друг от друга в то, что известно как Cas9 никазы. Эти нуклеазы имеют один активный и неактивный домен нуклеазы, что приводит к образованию комплекса, который выполняет одноцепочечное расщепление. [4] Cas9 никазы могут использоваться в тандеме (известно как парные никазы), которые выполняют два одноцепочечных «разреза» на альтернативных цепях. [4] Используя эту стратегию, обе Cas9 никазы должны совместно локализоваться, связываться и расщеплять свою цель, что резко снижает вероятность нецелевых инделей . [4] Кроме того, DSB, расщепленные парными никазами, имеют длинные свесы вместо тупых концов, что обеспечивает улучшенный контроль целевых вставок.

Fok1-dCas9 и димеризационные нуклеазы

Поскольку мономерные нуклеазы часто вызывают высокие уровни нецелевых эффектов, димеризация является привлекательной стратегией. В димерной системе обе нуклеазы должны связываться со своими индивидуальными мишенями или «полусайтами», а затем взаимодействовать и димеризоваться, чтобы инициировать расщепление, что значительно снижает вероятность нецелевых эффектов. Был разработан метод, который объединяет надежность доменов нуклеазы FokI , зависящих от димеризации, используемых в ZFN и TALEN, с простотой CRISPR-cas9. [17] Нуклеаза FokI была первоначально обнаружена в Flavobacterium okeanokoites и будет расщеплять ДНК только при условии активации димеризации. По сути, исследователи слили эту нуклеазу с комплексом CRISPR с неактивной нуклеазой Cas9 (Fok1-dCas9). [17] gRNA направляет комплекс CRISPR к целевому сайту, но «разрез» выполняется димеризованным Fok1. Подсчитано, что стратегия Fok1-dCas9 снижает обнаруживаемые нецелевые эффекты в 10 000 раз, что делает ее эффективной для приложений, требующих высокоточного и специфического редактирования генома. [17] [40]

мутация нуклеазы

В дополнение к мишени gRNA, Cas9 требует связывания с определенной последовательностью PAM из 2-6 нуклеотидов. В обычно используемых системах SpCas9 мотив PAM представляет собой 5' NGG 3', где N представляет собой любой из четырех нуклеотидов ДНК. Требование последовательности PAM может вызвать ограничения специфичности, поскольку некоторые регионы не будут иметь доступной целевой последовательности для внесения желаемой генетической модификации. Последовательность PAM может быть отредактирована до неканонических мотивов NAG и NGA, которые не только улучшают специфичность, но и уменьшают нецелевые эффекты. [41] Мутант D1135E, по-видимому, изменяет специфичность PAM. Мутант D1135E уменьшает нецелевые эффекты и увеличивает специфичность SpCas9. [41] Дополнительный вариант, SpCas9-HF1, также приводит к благоприятным улучшениям специфичности Cas9. [42] Было идентифицировано несколько комбинаций замен, которые, как известно, образуют неспецифические контакты ДНК (N497A, R661A, Q695A и Q926A). [42] Четверная замена этих остатков (позже названная SpCas9-HF1) имеет чрезвычайно низкие уровни нецелевых эффектов, как обнаружено экспериментами GUIDE-seq. [42] Такие варианты, как SpCas9-HF1 и D1135E, и другие подобные им, можно комбинировать, тестировать и легко добавлять к существующим векторам SpCas9 для снижения частоты нецелевых мутаций. Кроме того, многие из перечисленных выше инженерных стратегий можно комбинировать для создания все более надежных и надежных инструментов редактирования нуклеазы, управляемой РНК. Направленную эволюцию можно также использовать для снижения активности нуклеазы на определенных целевых последовательностях, что приводит к таким вариантам, как SpartaCas (содержащим мутации D23A, T67L, Y128V и D1251G относительно дикого типа SpCas9). [43]

CRISPRi и CRISPRa

Также были разработаны интерференция CRISPR ( CRISPRi ) и активация CRISPR ( CRISPRa ). [44] Эти системы могут точно изменять транскрипцию генов на уровне ДНК, не вызывая необратимых генетических изменений. [44] Кроме того, напрямую воздействуя на ДНК, они, как правило, более специфичны и предсказуемы по сравнению с РНК-интерференцией . [45] Хотя CRISPRi/a не может заменить редактирование генома во всех экспериментах, в некоторых случаях они могут выступать в качестве эффективной альтернативы. CRISPRi и CRISPRa используют деактивированный фермент Cas9 (dCas9), который не может разрезать ДНК, но может доставлять транскрипционные активаторы и репрессоры для модуляции желаемой экспрессии генов с высокой точностью. [44] В настоящее время нецелевые эффекты CRISPRi минимальны и показывают сниженную реакцию и чувствительность к несовпадениям отдельных оснований. [44] Важно отметить, что когда неспецифические эффекты неизбежно возникают, они обратимы, зависят от времени и менее разрушительны, чем редактирование ДНК, что делает их эффективными альтернативами, которые могут ограничить нагрузку вне целевого назначения, когда это возможно. CRISPR-cas13b, использующий систему CRISPR-Cas типа IV (в отличие от обычно используемого типа II), может нацеливаться и редактировать определенные последовательности РНК. [46] Такая платформа редактирования РНК способна специфически редактировать мРНК и, следовательно, трансляцию белка, не изменяя ДНК. Это представляет собой многообещающую технологию, которая в случае успеха снизит нагрузку необратимых нецелевых мутаций.

Обнаружение

Даже если кто-то может принять осторожные меры, чтобы избежать нецелевых мутаций, и даже если это удастся, необходимо провести подтверждающий скрининг, чтобы проверить на непреднамеренные мутации. В настоящее время существует множество предвзятых и непредвзятых методов для такого скрининга и только два метода in vitro . Все они перечислены ниже:

Целевое, экзомное и полногеномное секвенирование

В случае обычного целевого секвенирования смещенный подход даст результаты только для предполагаемой области захвата, что затрудняет поиск, поскольку на экране не появятся неожиданные мутации. Хотя это просто и дешево, это становится трудоемким и дорогим, как только добавляются еще целевые сайты. Экзомное секвенирование использует экзомный захват для получения кодирующих белок областей генома. Оно беспристрастно, однако не даст нецелевых мутаций в некодирующей области генома. В случае секвенирования всего генома весь геном проверяется на нецелевые мутации. В настоящее время этот метод является дорогостоящим и, как и секвенирование экзома, для всего генома также требуется референтный геном, чтобы делать выводы. [47]

БЛАГОСЛОВИТЬ

Обзор различных методов обнаружения нецелевых мутаций путем редактирования генома. A) BLESS B) GUIDE-seq C) HTGTS D) Digenome-Seq

BLESS — самый простой способ обнаружения и количественной оценки нецелевых мутаций путем скрининга DSB в геноме. Этот метод основан на прямом обогащении маркировки разрывов in situ на стрептавидине. Разработанный в 2013 году, [48] BLESS выполняется путем лигирования концов DSB с биотином, т.е. биотинилирования. За этим следует разделение/сбор указанных лигированных концов с использованием стрептавидина. Связанная последовательность добавляется к биотинилированным последовательностям, и эта окончательная смесь затем секвенируется для получения положения нецелевой мутации. Будучи беспристрастным по своей природе, BLESS дает информацию о месте мутации в геноме, а не о белках, вовлеченных или связанных с DSB. Однако BLESS может обнаруживать только мутации во время эксперимента, а не те, которые были сформированы ранее и были исправлены. [49]

LAM-HTGTS

Линейное опосредованное амплификацией - высокопроизводительное геномное транслокационное секвенирование, или LAM-HTGTS, - это метод, разработанный для отслеживания событий транслокации, вызванных соединением между DSB. [50] Разработанный для обнаружения нецелевых мутаций из TALEN и CRISPR-Cas9, этот метод основан на репарации ДНК путем соединения концов в DSB. После добавления нуклеазы она продолжает производить целевые и нецелевые мутации. Наряду с этим есть последовательность приманки, которая также расщепляется. Поэтому, если другой DSB встречается на хромосоме, отличной от хромосомы последовательности приманки, они оба соединяются, что приводит к транслокации. Поскольку последовательность приманки известна, эта транслоцированная последовательность амплифицируется с помощью праймеров. В случае отсутствия транслокации есть сайт рестрикции, внутри которого происходит расщепление, чтобы предотвратить амплификацию только последовательности приманки. Затем амплифицированная ДНК секвенируется для изучения крупных геномных перестроек, вызванных нецелевыми мутациями. Один из недостатков заключается в том, что он полагается на одновременное присутствие приманки и другого DSB.

РУКОВОДСТВО-Seq

Другим подходом к поиску нецелевых мутаций, вызванных активностью нуклеазы, является метод GUIDE-Seq . GUIDE-seq или Genome Wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing, основан на включении двухцепочечных олигодезоксинуклеотидов (dsODN) в DSB через NHEJ. За его амплификацией следует секвенирование. Поскольку для секвенирования dsODN будут использоваться два праймера, области, фланкирующие DSB вместе с DSB, будут амплифицированы. Таким образом, можно картировать нецелевую мутацию. Этот метод был применен для идентификации всех ранее известных нецелевых участков, а также новых с частотой всего 0,03%. Однако, как и BLESS, GUIDE-seq может обнаруживать только DSB, присутствующие на момент исследования.

Дигеном-Seq

Один из современных методов in vitro , Digenome-Seq, использует свойство Cas9 расщеплять геном для получения беспристрастного профиля всего генома. В этом методе Cas9 добавляется к gDNA, а последствия изучаются с помощью высокопроизводительного секвенирования. Поскольку фрагменты образуются из-за одной и той же нуклеазы, концы этих фрагментов можно картировать выровненными. Два больших преимущества заключаются в том, что его можно использовать для изучения до 10 gRNA одновременно и он может идентифицировать цели с частотой до 0,01%. [9] Однако главное преимущество заключается в том, что этот метод является in vitro, то есть DSB, введенные Cas9, не будут обрабатываться механизмом репарации ДНК (в отличие от BLESS и GUIDE-seq) и, таким образом, будут включать все возможные нецелевые мутации. Однако это может привести к большому количеству ложноположительных результатов. [51]

CIRCLE-Seq

Последним дополнением к методам in vitro для обнаружения нецелевых мутаций является CIRCLE-seq. Лицензированный Beacon genomics (вместе с GUIDE-seq), [52] CIRCLE-seq направлен на устранение недостатков Digenome-seq, таких как необходимость большого размера выборки и глубины считывания (~400 миллионов считываний) и высокий фон, который затрудняет идентификацию событий расщепления с низкой частотой. [53] Он использует стратегию, независимую от рестриктаз, для создания и выбора преобразования случайно разрезанной ДНК. При расщеплении целевая ДНК образует петлю стебля, к которой можно добавлять адаптеры для секвенирования. Хотя это оказалось возможным, другая возможность дала кратно большую разницу в обнаружении/. Во втором случае последовательность расщепляется с помощью Cas9, и когда она снова расщепляется на половине сайта, доступен круговой разрез (что является причиной названия CIRCLE-seq). Почти все сайты, идентифицированные с помощью циркуляризации, содержат как линейные обнаруженные сайты, так и более новые, что предполагает, что CIRCLE-seq не смещается между разрывами и также получает сильные низкочастотные разрывы. Это также помогает секвенировать сайт разрыва с обеих сторон расщепления по сравнению с другими методами, которые имеют только одну сторону считывания.

Штрихкодированные библиотеки целей

Нуклеазы, такие как Cas9, также могут быть подвергнуты in vitro испытанию рандомизированными библиотеками мишеней. [54] Адаптерное лигирование для количественной оценки расщепленных и нерасщепленных членов библиотеки позволяет проводить беспристрастное измерение профиля специфичности нуклеазы. Измерение расщепления штрихкодированных библиотек мишеней (BLT) с помощью SpCas9 показало, что профили специфичности были специфичны для направляющей последовательности и зависели от самой нуклеазы. Беспристрастные профили специфичности, основанные на каждом конкретном комплексе Cas9-гРНК, затем могут использоваться для построения специфичных для направляющей прогностических моделей для расщепления in vitro .

Значение

генная терапия

Для того чтобы технологии редактирования генов сделали скачок к безопасному и широкому использованию в клинике, скорость нецелевых модификаций должна быть признана устаревшей. Безопасность лечения генной терапией вызывает первостепенную озабоченность, особенно во время клинических испытаний, когда нецелевые модификации могут блокировать дальнейшую разработку продукта-кандидата. [55] Возможно, самым известным примером современной генной терапии является терапия CAR-T, которая используется для лечения В-клеточной лимфомы . Чтобы ограничить скорость нецелевого расщепления, терапия использует высокоспецифичный и тонко настроенный TALEN, который, как было доказано, имеет мало или вообще не имеет фонового нецелевого взаимодействия. [55] Иммунотерапия CAR-T представляет собой процедуру ex vivo , что означает, что иммунные клетки пациента (в данном случае Т-клетки ) извлекаются и редактируются с использованием дизайнерских нуклеаз. [55] Хотя разработка системы TALEN является дорогостоящей и трудоемкой, исследовательские и инженерные модификации резко ограничили ее скорость нецелевого взаимодействия. Тем не менее, пациенты, получающие лечение, по-прежнему часто наблюдаются и будут находиться под наблюдением в течение следующих 15 лет, чтобы можно было проанализировать и учесть побочные эффекты и иммуногенные реакции по мере того, как новые генные терапии будут выходить на клинические испытания. [56]

Испытания аутологичных Т-хелперных клеток, модифицированных CCR5 ZFN

В клиническом исследовании фазы I/II приняли участие 12 пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) для проверки безопасности и эффективности введения аутологичных Т-хелперных клеток, модифицированных ZFN. [57] С помощью целевых делеций индивидуальный ZFN отключает ген рецептора хемокина CC 5 ( CCR5 ), который кодирует корецептор, используемый вирусом ВИЧ для проникновения в клетку. [58] В результате высокой степени гомологии последовательностей между рецепторами хемокина CC этот ZFN также расщепляет CCR2 , что приводит к нецелевым делециям размером ~15 кб и геномным перестройкам. [58] [59] Последствия этих модификаций CCR2 до сих пор неизвестны, и на сегодняшний день не было зарегистрировано никаких побочных эффектов. Однако известно , что CCR2 играет множество критических ролей в нервной и метаболической системах. [60] [61]

Генные Драйвы

Генетические приводы с использованием CRISPR-cas9 в настоящее время тестируются и были предложены в качестве стратегий для устранения инвазивных видов и переносчиков болезней. Генетически модифицируя организм для экспрессии эндогенной последовательности-специфической эндонуклеазы, можно расщепить цель (например, ген фертильности) на противоположной хромосоме. [62] DSB в цели приводит к гомологичной репарации, которая фактически делает организм гомозиготным по желаемой целевой последовательности. Эта стратегия, известная как привод самонаведения, может подавлять популяцию, воздействуя на критический ген или вызывая рецессивную стерильность. Однако, если бы такая система была выпущена в дикую природу, система CRISPR-cas9 продолжала бы функционировать бесконечно. С каждым последующим поколением нецелевые мутации становились бы все более вероятными, и влияние этих мутаций на вид было бы стохастическим. Нецелевые мутации могут отключить подавляющие качества генного привода, сохраняя при этом экспрессию эндонуклеазы. В такой ситуации возникнет повышенный риск потока генов между целевым видом и другими видами, что может привести к нежелательным результатам. [63]

Противоречие

Расширение использования редактирования генома и его последующее внедрение в клиническую практику вызвало споры относительно истинной нецелевой нагрузки этих технологий.

Шефери др.2017

30 мая 2017 года в Nature Methods была опубликована двухстраничная статья, в которой сообщалось о необычно большом количестве нецелевых SNV и инделей после секвенирования мышей, которые ранее участвовали в эксперименте по восстановлению генов in vivo . [64] Предыдущий эксперимент, завершенный той же группой, успешно восстановил зрение слепой линии мышей ( rd1 ) путем исправления мутации Y347X в гене Pde6b с помощью системы CRISPR-cas9. [65] После завершения эксперимента две генетически исправленные мыши были полностью секвенированы и сравнены с контрольными и известными геномами мышей. Было обнаружено более 1600 SNV и 128 инделей, из которых 1397 SNV и 117 инделей были общими для двух отредактированных мышей, что позволяет предположить, что нецелевые эффекты не были случайными. Алгоритмы, пытающиеся предсказать местоположение этих нецелевых мутаций, потерпели неудачу для подавляющего большинства локусов. Для сравнения, исследование по секвенированию всего экзома 2016 года обнаружило 19 SNV и 3 инделя у 5 отредактированных мышей, в то время как Шефер и др. обнаружили 115 экзонных SNV и 9 инделей всего у 2 отредактированных мышей. [66] Многие эксперты не согласились с этой статьей и раскритиковали ее в журнальных статьях [66] и социальных сетях, предположив, что в первоначальной статье использовались необычные методы лечения CRISPR, а размер выборки был слишком мал для значимости (n=2). Nature Methods выпустила две редакционные заметки по статье [67] и позже отозвала ее. [68] Тем не менее, нецелевые показатели постоянно обнаруживаются более частыми in vivo по сравнению с экспериментами на клеточных культурах и, как полагают, особенно распространены у людей. [3] [7]

Ссылки

  1. ^ Costa JR, Bejcek BE, McGee JE, Fogel AI, Brimacombe KR, Ketteler R (2004). «Редактирование генома с использованием сконструированных нуклеаз и их использование в геномном скрининге». В Sittampalam GS, Coussens NP, Brimacombe K, Grossman A, Arkin M, Auld D и др. (ред.). Руководство по анализу. Бетесда (Мэриленд): Eli Lilly & Company и Национальный центр по развитию трансляционных наук. PMID  29165977.
  2. ^ ab Cong L, Zhang F (2015). "Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9". Хромосомный мутагенез . Методы в молекулярной биологии. Т. 1239. С. 197–217. doi :10.1007/978-1-4939-1862-1_10. hdl :1721.1/102943. ISBN 978-1-4939-1861-4. PMC  3969860 . PMID  25408407.
  3. ^ abcd Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD (сентябрь 2013 г.). «Высокочастотный нецелевой мутагенез, индуцированный нуклеазами CRISPR-Cas в клетках человека». Nature Biotechnology . 31 (9): 822–6. doi :10.1038/nbt.2623. PMC 3773023 . PMID  23792628. 
  4. ^ abcd Cho SW, Kim S, Kim Y, Kweon J, Kim HS, Bae S, Kim JS (январь 2014 г.). «Анализ нецелевых эффектов эндонуклеаз и никаз, полученных с помощью РНК CRISPR/Cas». Genome Research . 24 (1): 132–41. doi :10.1101/gr.162339.113. PMC 3875854 . PMID  24253446. 
  5. ^ abc Veres A, Gosis BS, Ding Q, Collins R, Ragavendran A, Brand H, Erdin S, Cowan CA, Talkowski ME, Musunuru K (июль 2014 г.). «Низкая частота нецелевых мутаций в отдельных клонах стволовых клеток человека, нацеленных на CRISPR-Cas9 и TALEN, обнаруженных с помощью секвенирования всего генома». Cell Stem Cell . 15 (1): 27–30. doi :10.1016/j.stem.2014.04.020. PMC 4082799 . PMID  24996167. 
  6. ^ Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (май 2013 г.). «Одношаговое создание мышей, несущих мутации во многих генах, с помощью генной инженерии с использованием CRISPR/Cas». Cell . 153 (4): 910–8. doi :10.1016/j.cell.2013.04.025. PMC 3969854 . PMID  23643243. 
  7. ^ abcd Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, Deshmukh H, Ranjan P, Sarode N, Wile BM, Vertino PM, Stewart FJ, Bao G (июнь 2014 г.). «Системы CRISPR/Cas9 имеют нецелевую активность со вставками или делециями между целевой ДНК и направляющими последовательностями РНК». Nucleic Acids Research . 42 (11): 7473–85. doi :10.1093/nar/gku402. PMC 4066799. PMID  24838573 . 
  8. ^ ab Cradick TJ, Fine EJ, Antico CJ, Bao G (ноябрь 2013 г.). «Системы CRISPR/Cas9, нацеленные на гены β-глобина и CCR5, имеют существенную нецелевую активность». Nucleic Acids Research . 41 (20): 9584–92. doi :10.1093/nar/gkt714. PMC 3814385. PMID  23939622 . 
  9. ^ abcd Kim D, Bae S, Park J, Kim E, Kim S, Yu HR, Hwang J, Kim JI, Kim JS (март 2015 г.). "Digenome-seq: профилирование по всему геному нецелевых эффектов CRISPR-Cas9 в клетках человека". Nature Methods . 12 (3): 237–43, 1 стр. после 243. doi :10.1038/nmeth.3284. PMID  25664545. S2CID  22626843.
  10. ^ Mahfouz MM, Piatek A, Stewart CN (октябрь 2014 г.). «Геномная инженерия с помощью систем TALEN и CRISPR/Cas9: проблемы и перспективы». Plant Biotechnology Journal . 12 (8): 1006–14. doi : 10.1111/pbi.12256 . PMID  25250853.
  11. ^ Pennisi E (август 2013 г.). «Помешательство на CRISPR». Science . 341 (6148): 833–6. Bibcode :2013Sci...341..833P. doi :10.1126/science.341.6148.833. PMID  23970676.
  12. ^ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для генной инженерии». Cell . 157 (6): 1262–78. doi :10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC 4343198 . PMID  24906146. 
  13. ^ Эйд А, Махфуз ММ (октябрь 2016 г.). «Редактирование генома: путь CRISPR/Cas9 от скамейки до клиники». Experimental & Molecular Medicine . 48 (10): e265. doi :10.1038/emm.2016.111. PMC 5099421. PMID  27741224 . 
  14. ^ ab Fu Y, Sander JD, Reyon D, Cascio VM, Joung JK (март 2014 г.). «Улучшение специфичности нуклеазы CRISPR-Cas с использованием усеченных направляющих РНК». Nature Biotechnology . 32 (3): 279–284. doi :10.1038/nbt.2808. PMC 3988262 . PMID  24463574. 
  15. ^ Standage-Beier K, Zhang Q, Wang X (ноябрь 2015 г.). «Целевая крупномасштабная делеция бактериальных геномов с использованием CRISPR-Nickases». ACS Synthetic Biology . 4 (11): 1217–25. doi :10.1021/acssynbio.5b00132. PMC 4655420. PMID  26451892 . 
  16. ^ ab Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, Topkar VV, Aryee MJ, Joung JK (июнь 2017 г.). "CIRCLE-seq: высокочувствительный in vitro скрининг для выявления нецелевых участков нуклеазы CRISPR-Cas9 по всему геному". Nature Methods . 14 (6): 607–614. doi :10.1038/nmeth.4278. PMC 5924695 . PMID  28459458. 
  17. ^ abcd Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK (июнь 2014 г.). «Димерные CRISPR РНК-направляемые FokI нуклеазы для высокоспецифичного редактирования генома». Nature Biotechnology . 32 (6): 569–76. doi :10.1038/nbt.2908. PMC 4090141 . PMID  24770325. 
  18. ^ Ungerer J, Pakrasi HB (декабрь 2016 г.). «Cpf1 — универсальный инструмент для редактирования генома CRISPR среди различных видов цианобактерий». Scientific Reports . 6 : 39681. Bibcode :2016NatSR...639681U. doi :10.1038/srep39681. PMC 5175191 . PMID  28000776. 
  19. ^ Singh R, Kuscu C, Quinlan A, Qi Y, Adli M (октябрь 2015 г.). «Информация о связывании Cas9-хроматина позволяет точнее прогнозировать CRISPR вне мишени». Nucleic Acids Research . 43 (18): e118. doi :10.1093/nar/gkv575. PMC 4605288 . PMID  26032770. 
  20. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (февраль 2015 г.). «GUIDE-seq позволяет проводить профилирование внецелевого расщепления нуклеазами CRISPR-Cas на уровне генома». Nature Biotechnology . 33 (2): 187–197. doi :10.1038/nbt.3117. PMC 4320685 . PMID  25513782. 
  21. ^ Хорват П., Баррангу Р. (январь 2010 г.). «CRISPR/Cas, иммунная система бактерий и архей». Science . 327 (5962): 167–70. Bibcode :2010Sci...327..167H. doi :10.1126/science.1179555. PMID  20056882. S2CID  17960960.
  22. ^ Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V (сентябрь 2012 г.). «Комплекс рибонуклеопротеина Cas9-crRNA опосредует специфическое расщепление ДНК для адаптивного иммунитета у бактерий». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (39): E2579-86. doi : 10.1073/pnas.1208507109 . PMC 3465414. PMID  22949671 . 
  23. ^ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (август 2012 г.). «Программируемая двухРНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете». Science . 337 (6096): 816–21. Bibcode :2012Sci...337..816J. doi :10.1126/science.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  24. ^ Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH (ноябрь 2015 г.). «Внецелевые эффекты в геномной инженерии с использованием CRISPR/Cas9». Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 4 (11): e264. doi :10.1038/mtna.2015.37. PMC 4877446. PMID 26575098  . 
  25. ^ ab Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (февраль 2013 г.). «Мультиплексная генная инженерия с использованием систем CRISPR/Cas». Science . 339 (6121): 819–23. Bibcode :2013Sci...339..819C. doi :10.1126/science.1231143. PMC 3795411 . PMID  23287718. 
  26. ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C (март 2009). «Короткие последовательности мотивов определяют цели прокариотической системы защиты CRISPR». Microbiology . 155 (Pt 3): 733–40. doi : 10.1099/mic.0.023960-0 . PMID  19246744.
  27. ^ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA (март 2014 г.). «Исследование ДНК с помощью эндонуклеазы Cas9, управляемой CRISPR РНК». Nature . 507 (7490): 62–7. Bibcode :2014Natur.507...62S. doi :10.1038/nature13011. PMC 4106473 . PMID  24476820. 
  28. ^ Андерс К, Нивёнер О, Дюрст А, Джинек М (сентябрь 2014 г.). «Структурная основа PAM-зависимого распознавания целевой ДНК эндонуклеазой Cas9». Nature . 513 (7519): 569–73. Bibcode :2014Natur.513..569A. doi :10.1038/nature13579. PMC 4176945 . PMID  25079318. 
  29. ^ Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, Deshmukh H, Ranjan P, Sarode N, Wile BM, Vertino PM, Stewart FJ, Bao G (июнь 2014 г.). «Системы CRISPR/Cas9 имеют нецелевую активность со вставками или делециями между целевой ДНК и направляющими последовательностями РНК». Nucleic Acids Research . 42 (11): 7473–85. doi :10.1093/nar/gku402. PMC 4066799. PMID  24838573 . 
  30. ^ Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, Li Y, Fine EJ, Wu X, Shalem O, Cradick TJ, Marraffini LA, Bao G, Zhang F (сентябрь 2013 г.). "Специфичность РНК-направленного воздействия на ДНК нуклеаз Cas9". Nature Biotechnology . 31 (9): 827–32. doi :10.1038/nbt.2647. PMC 3969858 . PMID  23873081. 
  31. ^ abc Wu X, Scott DA, Kriz AJ, Chiu AC, Hsu PD, Dadon DB, Cheng AW, Trevino AE, Konermann S, Chen S, Jaenisch R, Zhang F, Sharp PA (июль 2014 г.). "Геномное связывание эндонуклеазы CRISPR Cas9 в клетках млекопитающих". Nature Biotechnology . 32 (7): 670–6. doi :10.1038/nbt.2889. PMC 4145672 . PMID  24752079. 
  32. ^ ab Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES (январь 2014 г.). «Генетические скрининги в клетках человека с использованием системы CRISPR-Cas9». Science . 343 (6166): 80–4. Bibcode :2014Sci...343...80W. doi :10.1126/science.1246981. PMC 3972032 . PMID  24336569. 
  33. ^ Рен X, Ян Z, Сюй J, Сунь J, Мао D, Ху Y, Ян SJ, Цяо ХХ, Ван X, Ху Q, Дэн П, Лю LP, Цзи JY, Ли JB, Ni JQ (ноябрь 2014 г.). «Повышенная специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas9 с оптимизированными параметрами sgRNA у дрозофилы». Отчеты по ячейкам . 9 (3): 1151–62. дои : 10.1016/j.celrep.2014.09.044. ПМК 4250831 . ПМИД  25437567. 
  34. ^ Moreno-Mateos MA, Vejnar CE, Beaudoin JD, Fernandez JP, Mis EK, Khokha MK, Giraldez AJ (октябрь 2015 г.). «CRISPRscan: разработка высокоэффективных sgRNAs для нацеливания CRISPR-Cas9 in vivo». Nature Methods . 12 (10): 982–8. doi :10.1038/nmeth.3543. PMC 4589495 . PMID  26322839. 
  35. ^ Ким С, Ким Д, Чо СВ, Ким Дж, Ким ДжС (июнь 2014 г.). «Высокоэффективное редактирование генома под управлением РНК в клетках человека с помощью доставки очищенных рибонуклеопротеинов Cas9». Genome Research . 24 (6): 1012–9. doi : 10.1101/gr.171322.113. PMC 4032847. PMID  24696461. 
  36. ^ Куску С, Арслан С, Сингх Р, Торп Дж, Адли М (июль 2014 г.). «Геномный анализ выявляет характеристики нецелевых участков, связанных эндонуклеазой Cas9». Nature Biotechnology . 32 (7): 677–83. doi :10.1038/nbt.2916. PMID  24837660. S2CID  29285105.
  37. ^ Mali P, Aach J, Stranges PB, Esvelt KM, Moosburner M, Kosuri S, Yang L, Church GM (сентябрь 2013 г.). «CAS9 транскрипционные активаторы для скрининга целевой специфичности и парные никазы для кооперативной генной инженерии». Nature Biotechnology . 31 (9): 833–8. doi :10.1038/nbt.2675. PMC 3818127 . PMID  23907171. 
  38. ^ Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2007). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Garland Science.{{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  39. ^ Kadam US, Shelake RM, Chavhan RL, Suprasanna P (2018). «Опасения относительно «внецелевой» активности эндонуклеаз редактирования генома». Ant Physiology and Biochemistry . 131 : 22–30. Bibcode :2018PlPB..131...22K. doi :10.1016/j.plaphy.2018.03.027. PMID  29653762. S2CID  4846191.
  40. ^ Wyvekens N, Topkar VV, Khayter C, Joung JK, Tsai SQ (июль 2015 г.). «Димерные нуклеазы FokI-dCas9, направляемые CRISPR РНК, направляемые усеченными gRNA для высокоспецифичного редактирования генома». Human Gene Therapy . 26 (7): 425–31. doi :10.1089/hum.2015.084. PMC 4509490 . PMID  26068112. 
  41. ^ ab Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK (июль 2015 г.). "Сконструированные нуклеазы CRISPR-Cas9 с измененной специфичностью PAM". Nature . 523 (7561): 481–5. Bibcode :2015Natur.523..481K. doi :10.1038/nature14592. PMC 4540238 . PMID  26098369. 
  42. ^ abc Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, Tsai SQ, Nguyen NT, Zheng Z, Joung JK (январь 2016 г.). «Высокоточные нуклеазы CRISPR-Cas9 без обнаруживаемых нецелевых эффектов на уровне генома». Nature . 529 (7587): 490–5. Bibcode :2016Natur.529..490K. doi :10.1038/nature16526. PMC 4851738 . PMID  26735016. 
  43. ^ Cerchione, Derek; Loveluck, Katherine; Tillotson, Eric L.; Harbinski, Fred; DaSilva, Jen; Kelley, Chase P.; Keston-Smith, Elise; Fernandez, Cecilia A.; Myer, Vic E.; Jayaram, Hariharan; Steinberg, Barrett E. (16 апреля 2020 г.). «Библиотеки SMOOT и направленная эволюция Cas9, индуцированная фагом, для проектирования сниженной нецелевой активности». PLOS ONE . 15 (4): e0231716. Bibcode : 2020PLoSO..1531716C. doi : 10.1371/journal.pone.0231716 . PMC 7161989. PMID  32298334 . 
  44. ^ abcd Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, Guimaraes C, Panning B, Ploegh HL, Bassik MC, Qi LS, Kampmann M, Weissman JS (октябрь 2014 г.). "Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation". Cell . 159 (3): 647–61. doi :10.1016/j.cell.2014.09.029. PMC 4253859 . PMID  25307932. 
  45. ^ Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (ноябрь 2013 г.). «CRISPR-интерференция (CRISPRi) для последовательно-специфического контроля экспрессии генов». Nature Protocols . 8 (11): 2180–96. doi :10.1038/nprot.2013.132. PMC 3922765 . PMID  24136345. 
  46. ^ Cox DB, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung J, Zhang F (ноябрь 2017 г.). «Редактирование РНК с помощью CRISPR-Cas13». Science . 358 (6366): 1019–1027. Bibcode :2017Sci...358.1019C. doi :10.1126/science.aaq0180. PMC 5793859 . PMID  29070703. 
  47. ^ Zischewski J, Fischer R, Bortesi L (2017). «Обнаружение целевых и нецелевых мутаций, генерируемых CRISPR/Cas9 и другими специфичными для последовательности нуклеазами». Biotechnology Advances . 35 (1): 95–104. doi : 10.1016/j.biotechadv.2016.12.003 . PMID  28011075.
  48. ^ Crosetto N, Mitra A, Silva MJ, Bienko M, Dojer N, Wang Q, Karaca E, Chiarle R, Skrzypczak M, Ginalski K, Pasero P, Rowicka M, Dikic I (апрель 2013 г.). «Картирование двухцепочечных разрывов ДНК с разрешением нуклеотидов с помощью секвенирования следующего поколения». Nature Methods . 10 (4): 361–5. doi :10.1038/nmeth.2408. PMC 3651036 . PMID  23503052. 
  49. ^ Tsai SQ, Joung JK (май 2016 г.). «Определение и улучшение специфичности нуклеаз CRISPR-Cas9 на уровне генома». Nature Reviews Genetics . 17 (5): 300–12. doi :10.1038/nrg.2016.28. PMC 7225572. PMID 27087594  . 
  50. ^ Mallin H, Hestericová M, Reuter R, Ward TR (май 2016 г.). «Проектирование библиотеки и протокол скрининга искусственных металлоферментов на основе технологии биотин-стрептавидин». Nature Protocols . 11 (5): 835–52. doi :10.1038/nprot.2016.019. PMID  27031496. S2CID  22365528.
  51. ^ Fu BX, St Onge RP, Fire AZ, Smith JD (июнь 2016 г.). «Отдельные закономерности толерантности к несоответствию Cas9 in vitro и in vivo». Nucleic Acids Research . 44 (11): 5365–77. doi :10.1093/nar/gkw417. PMC 4914125. PMID  27198218 . 
  52. ^ "Пресс-релиз CIRCLE-Seq". beacongenomics.com . Получено 01.03.2018 .
  53. ^ Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, Topkar VV, Aryee MJ, Joung JK (июнь 2017 г.). «CIRCLE-seq: высокочувствительный in vitro-скрининг для выявления нецелевых участков нуклеазы CRISPR-Cas9 на уровне генома». Nature Methods . 14 (6): 607–614. doi :10.1038/nmeth.4278. PMC 5924695 . PMID  28459458. 
  54. ^ Huston, Nicholas C.; Tycko, Josh; Tillotson, Eric L.; Wilson, Christopher J.; Myer, Vic E.; Jayaram, Hariharan; Steinberg, Barrett E. (1 июня 2019 г.). «Идентификация внутренних детерминант специфичности Cas9». The CRISPR Journal . 2 (3): 172–185. doi : 10.1089/crispr.2019.0009 . ISSN  2573-1599. PMC 6694761. PMID  31225747 . 
  55. ^ abc Gautron AS, Juillerat A, Guyot V, Filhol JM, Dessez E, Duclert A, Duchateau P, Poirot L (декабрь 2017 г.). «Точная и предсказуемая настройка редактирования генов TALEN для улучшения адаптивной иммунотерапии Т-клеток». Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 9 : 312–321. doi :10.1016/j.omtn.2017.10.005. PMC 5684446. PMID  29246309 . 
  56. ^ Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C (март 2017 г.). «Глобальное производство CAR T-клеточной терапии». Молекулярная терапия: методы и клиническая разработка . 4 : 92–101. doi :10.1016/j.omtm.2016.12.006. PMC 5363291 . PMID  28344995. 
  57. ^ Tebas P, Stein D, Tang WW, Frank I, Wang SQ, Lee G, Spratt SK, Surosky RT, Giedlin MA, Nichol G, Holmes MC, Gregory PD, Ando DG, Kalos M, Collman RG, Binder-Scholl G, Plesa G, Hwang WT, Levine BL, June CH (март 2014 г.). «Редактирование гена CCR5 в аутологичных Т-клетках CD4 лиц, инфицированных ВИЧ». The New England Journal of Medicine . 370 (10): 901–10. doi :10.1056/NEJMoa1300662. PMC 4084652. PMID 24597865  . 
  58. ^ ab Lee HJ, Kim E, Kim JS (январь 2010 г.). «Целевые хромосомные делеции в клетках человека с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами». Genome Research . 20 (1): 81–9. doi :10.1101/gr.099747.109. PMC 2798833. PMID 19952142  . 
  59. ^ Lee HJ, Kweon J, Kim E, Kim S, Kim JS (март 2012 г.). «Целевые хромосомные дупликации и инверсии в геноме человека с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами». Genome Research . 22 (3): 539–48. doi : 10.1101/gr.129635.111. PMC 3290789. PMID  22183967. 
  60. ^ Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF (август 1998 г.). «Уменьшение образования поражений у мышей CCR2-/- выявляет роль хемокинов в инициировании атеросклероза». Nature . 394 (6696): 894–7. Bibcode :1998Natur.394..894B. doi :10.1038/29788. PMID  9732872. S2CID  4396768.
  61. ^ El Khoury J, Toft M, Hickman SE, Means TK, Terada K, Geula C, Luster AD (апрель 2007 г.). «Дефицит Ccr2 ухудшает накопление микроглии и ускоряет прогрессирование болезни Альцгеймера». Nature Medicine . 13 (4): 432–8. doi :10.1038/nm1555. PMID  17351623. S2CID  18276692.
  62. ^ Champer J, Buchman A, Akbari OS (март 2016 г.). «Обман эволюции: инженерные генные драйвы для управления судьбой диких популяций». Nature Reviews Genetics . 17 (3): 146–59. doi : 10.1038/nrg.2015.34 . PMID  26875679.
  63. ^ Webber BL, Raghu S, Edwards OR (август 2015 г.). «Мнение: является ли генный привод на основе CRISPR серебряной пулей биологического контроля или глобальной угрозой сохранению?». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (34): 10565–7. doi : 10.1073/pnas.1514258112 . PMC 4553820. PMID  26272924 . 
  64. ^ Schaefer KA, Wu WH, Colgan DF, Tsang SH, Bassuk AG, Mahajan VB (май 2017 г.). «Неожиданные мутации после редактирования CRISPR-Cas9 in vivo». Nature Methods . 14 (6): 547–548. doi :10.1038/nmeth.4293. PMC 5796662 . PMID  28557981. (Отозвано, см. doi :10.1038/nmeth.4293, Retraction Watch)
  65. ^ Wu WH, Tsai YT, Justus S, Lee TT, Zhang L, Lin CS, Bassuk AG, Mahajan VB, Tsang SH (август 2016 г.). «CRISPR Repair Reveals Causative Mutation in a Preclinical Model of Retinitis Pigmentosa». Молекулярная терапия . 24 (8): 1388–94. doi :10.1038/mt.2016.107. PMC 5023380. PMID 27203441  . 
  66. ^ ab Wilson CJ, Fennell T, Bothmer A, Maeder ML, Reyon D, Cotta-Ramusino C, Fernandez CA, Marco E, Barrera LA (2017-07-10). «Экспериментальный дизайн и интерпретация данных в «Неожиданные мутации после редактирования CRISPR Cas9 in vivo» Шефера и др. недостаточны для подтверждения выводов, сделанных авторами». bioRxiv 10.1101/153338 . 
  67. ^ «Спорная статья CRISPR заслуживает второй редакционной заметки». Retraction Watch.
  68. ^ Nakajima K, Kazuno AA, Kelsoe J, Nakanishi M, Takumi T, Kato T (октябрь 2016 г.). "Секвенирование экзома у мышей knockin, полученных с использованием системы CRISPR/Cas". Scientific Reports . 6 : 34703. Bibcode :2016NatSR...634703N. doi :10.1038/srep34703. PMC 5048150 . PMID  27698470. 

Внешние ссылки