Сверхспирализация ДНК относится к величине скручивания конкретной цепи ДНК , которая определяет величину напряжения на ней. Данная прядь может быть «положительно сверхскрученной» или «отрицательно сверхскрученной» (более или менее плотно накрученной). Степень сверхспирализации нити влияет на ряд биологических процессов, таких как уплотнение ДНК и регулирование доступа к генетическому коду (что сильно влияет на метаболизм ДНК и, возможно, на экспрессию генов). Определенные ферменты, такие как топоизомеразы , изменяют степень суперспирализации ДНК, чтобы облегчить такие функции, как репликация и транскрипция ДНК . [1] Степень сверхспирализации в данной цепи описывается математической формулой, которая сравнивает ее с эталонным состоянием, известным как «расслабленная B-форма» ДНК.
В «расслабленном» двухспиральном сегменте B-ДНК две нити закручиваются вокруг оси спирали один раз на каждые 10,4–10,5 пар оснований последовательности . Добавление или удаление скручиваний, как это делают некоторые ферменты , приводит к напряжению. Если сегмент ДНК, находящийся под напряжением скручивания, замкнуть в круг, соединив два его конца, а затем позволить ему свободно двигаться, он примет другую форму, например восьмерку. Эта форма называется суперспиралью . (Форма существительного «суперспираль» часто используется при описании топологии ДНК .)
ДНК большинства организмов обычно имеет отрицательную сверхспираль. Он становится временно положительно сверхспиральным, когда его реплицируют или транскрибируют. Эти процессы тормозятся (регулируются), если его своевременно не расслабить. Самая простая форма суперспирали — восьмерка; кольцевая цепь ДНК принимает эту форму, чтобы вместить больше или меньше спиральных витков. Два лепестка восьмерки будут выглядеть повернутыми по часовой стрелке или против часовой стрелки относительно друг друга, в зависимости от того, перекручена спираль или нет. Для каждого дополнительного спирального поворота лепестки будут совершать еще один оборот вокруг своей оси. [2]
Ломбальные искажения кольцевой ДНК, такие как вращение долей в форме восьмерки выше, называются корчами . Приведенный выше пример показывает, что скручивание и корчение взаимообратимы. Математически суперспирализацию можно представить как сумму скручиваний и изгибов. Скручивание — это количество витков спирали в ДНК, а скручивание — это количество раз, когда двойная спираль пересекается сама с собой (это суперспирали). Дополнительные спиральные скручивания являются положительными и приводят к положительной сверхспирали, тогда как субтрактивная скрутка вызывает отрицательную сверхспираль. Многие ферменты топоизомеразы ощущают сверхспирализацию и либо генерируют, либо рассеивают ее при изменении топологии ДНК.
Отчасти потому, что хромосомы могут быть очень большими, сегменты в середине могут вести себя так, как будто их концы закреплены. В результате они могут быть неспособны распределить избыточное скручивание по остальной части хромосомы или поглотить скручивание, чтобы восстановиться после недостаточного скручивания — другими словами, сегменты могут стать сверхскрученными . В ответ на сверхскручивание они начинают корчиться, как если бы их концы соединились.
Сверхспиральная ДНК образует две структуры; плектонема или тороид , или комбинация того и другого . Молекула ДНК с отрицательной сверхспиралью образует либо однозаходную левую спираль, тороид, либо двухзаходную правую спираль с концевыми петлями, плектонему. Плектонемы обычно более распространены в природе, и именно такую форму принимают большинство бактериальных плазмид . Для более крупных молекул обычно образуются гибридные структуры: петля на тороиде может переходить в плектонему. Если все петли тороида расширяются, то он становится точкой ветвления плектонемической структуры. Сверхспирализация ДНК важна для упаковки ДНК во всех клетках и, по-видимому, также играет роль в экспрессии генов. [3] [4]
На основе свойств интеркалирующих молекул, т.е. флуоресценции при связывании с ДНК и раскручивании пар оснований ДНК, в 2016 году был представлен метод одиночных молекул для непосредственной визуализации отдельных плектонем вдоль сверхспиральной ДНК [5] , что в дальнейшем позволит изучать взаимодействие белков, процессирующих ДНК, со сверхспиральной ДНК. В этом исследовании Sytox Orange (интеркалирующий краситель) использовался для индукции суперспирализации на поверхностных молекулах ДНК.
С помощью этого анализа было обнаружено, что последовательность ДНК кодирует положение плектонемических суперспиралей. [6] Кроме того, было обнаружено, что суперспирали ДНК обогащены сайтами начала транскрипции у прокариот .
Суперспирализация ДНК важна для упаковки ДНК во всех клетках. Поскольку длина ДНК может в тысячи раз превышать длину клетки, упаковка этого генетического материала в клетку или ядро (у эукариот ) является трудной задачей. Суперспирализация ДНК уменьшает пространство и позволяет упаковать ДНК. У прокариот преобладают плектонемические суперспирали из-за кольцевой хромосомы и относительно небольшого количества генетического материала. У эукариот суперспирализация ДНК существует на многих уровнях как плектонемических, так и соленоидальных суперспиралей, причем соленоидальная суперспирализация оказывается наиболее эффективной для уплотнения ДНК. Соленоидальная суперспирализация достигается с помощью гистонов с образованием волокна диаметром 10 нм. Это волокно далее скручивается в волокно толщиной 30 нм и далее наматывается на себя еще много раз.
Упаковка ДНК значительно увеличивается во время митоза , когда дублированные сестринские ДНК разделяются на дочерние клетки. Было показано, что конденсин , большой белковый комплекс, который играет центральную роль в сборке митотических хромосом, индуцирует положительные суперспирали зависимым от гидролиза АТФ образом in vitro . [7] [8] Суперспирализация также может играть важную роль во время интерфазы в формировании и поддержании топологически ассоциированных доменов (TAD). [9]
Суперспирализация также необходима для синтеза ДНК/РНК . Поскольку для действия ДНК/РНК- полимеразы ДНК должна быть размотана , в результате образуются суперспирали. Область перед полимеразным комплексом будет размотана; это напряжение компенсируется положительными супервитками перед комплексом. За комплексом ДНК перематывается и возникают компенсаторные отрицательные суперспирали. Топоизомеразы , такие как ДНК-гираза (топоизомераза типа II), играют роль в снятии части стресса во время синтеза ДНК/РНК. [10]
У многих видов бактерий барьеры на пути диффузии суперспиралей делят геном на ряд топологически изолированных доменов суперспиралей (SD). [11] Эти SD играют важную роль в организации нуклеоида . SD в среднем имеют отрицательную сверхспиральность, но иногда могут иметь и положительную сверхспиральность. Степень суперспирализации может варьироваться в ответ на различные формы стресса и влияет на связывание различных нуклеоид-ассоциированных белков (NAP), которые в дальнейшем организуют бактериальный геном. [12] Например, было показано, что Dps из E. coli связывает сверхспиральную ДНК гораздо быстрее, чем торсионно-релаксированную ДНК. [13]
Специализированные белки могут распаковывать небольшие сегменты молекулы ДНК, когда она реплицируется или транскрибируется в РНК . Но работа, опубликованная в 2015 году, иллюстрирует, как ДНК открывается сама по себе. [3] [4]
Простое скручивание ДНК может обнажить внутренние основания наружу без помощи каких-либо белков. Кроме того, сама транскрипция искажает ДНК в живых клетках человека, сжимая одни части спирали и ослабляя ее в других. Это напряжение вызывает изменения формы, в первую очередь открытие спирали для чтения. К сожалению, эти взаимодействия очень трудно изучать, поскольку биологические молекулы очень легко меняют форму. В 2008 году было отмечено, что транскрипция скручивает ДНК, оставляя за собой след из недоспиральной (или отрицательно сверхспиральной) ДНК. Более того, они обнаружили, что сама последовательность ДНК влияет на то, как молекула реагирует на сверхспирализацию. [3] [4]
Например, исследователи определили определенную последовательность ДНК, которая регулирует скорость транскрипции; По мере того, как количество суперспиралей увеличивается и уменьшается, скорость, с которой молекулярные механизмы считывают ДНК, замедляется или ускоряется. [3] Предполагается, что эти структурные изменения могут вызвать стресс в других местах по всей его длине, что, в свою очередь, может создать триггерные точки для репликации или экспрессии генов. [3] [4] Это означает, что это очень динамичный процесс, в котором и ДНК, и белки влияют на то, как действует и реагирует другой. [3]
Почти половина генов бактерии E. coli, репрессируемых при холодовом шоке, аналогичным образом репрессируется при блокировании гиразы антибиотиком новобиоцином. [14] Более того, во время холодового шока плотность нуклеоидов увеличивается, а протеингираза и нуклеоид колокализуются (что согласуется с уменьшением релаксации ДНК). Это свидетельствует о том, что снижение отрицательной сверхспирализации ДНК является одним из основных механизмов, ответственных за блокировку транскрипции половины генов, осуществляющих программу транскрипционного ответа бактерий на холодовой шок. На основе этого предложена стохастическая модель этого процесса. Эта модель проиллюстрирована на рисунке, где реакции 1 представляют собой транскрипцию и ее блокировку за счет суперспирализации. Между тем, реакции 2–4 моделируют соответственно трансляцию и деградацию РНК и белка. [14]
В природе кольцевая ДНК всегда изолирована в виде спирали высшего порядка, известной как суперспираль . При обсуждении этой темы скрутку Уотсона-Крика называют «вторичной» обмоткой, а суперспирали - «третичной» обмоткой. На рисунке справа обозначена «расслабленная» или «разомкнутая круговая» двойная спираль Уотсона – Крика, а рядом с ней - правая суперспираль. «Расслабленная» структура слева не обнаруживается, пока хромосома не будет надрезана; суперспираль — это форма, обычно встречающаяся в природе.
Для целей математических вычислений правая суперспираль определяется как имеющая «отрицательное» количество витков суперспирали, а левая суперспираль определяется как имеющая «положительное» количество витков суперспирали. На рисунке (показанном справа) как вторичная ( т. е. «Уотсона-Крика») обмотка, так и третичная ( т. е. «суперспиральная») обмотка являются правосторонними, следовательно, суперкрутки отрицательны (–3 в этом примере). ).
Предполагается, что сверхспиральность является результатом недостаточной намотки, а это означает, что существует недостаток количества вторичных скручиваний Уотсона-Крика. Такая хромосома будет растянута так же, как растягивается макроскопическая металлическая пружина, когда ее либо перематывают, либо разматывают. В ДНК, которая таким образом напряжена, возникнут суперзакрутки.
Суперспирализацию ДНК можно описать численно изменениями числа связывания Lk . Число связывания является наиболее информативным свойством сверхспиральной ДНК. Lk o , количество витков в релаксированной (тип В) плазмиде/молекуле ДНК, определяют путем деления общего количества пар оснований молекулы на релаксированную bp /виток, которая в зависимости от ссылки равна 10,4; [15] 10,5; [16] [17] 10.6. [18]
Lk — это количество пересечений одной цепи с другой, которое часто визуализируется как количество скручиваний Уотсона-Крика, обнаруженных в кольцевой хромосоме в (обычно воображаемой) плоской проекции. Это число физически «зафиксировано» в момент ковалентного замыкания хромосомы и не может быть изменено без разрыва цепи.
Топология ДНК описывается приведенным ниже уравнением, в котором число связей эквивалентно сумме Tw , которое представляет собой количество витков или витков двойной спирали, и Wr , которое представляет собой количество витков или «корчей». " Если имеется замкнутая молекула ДНК, сумма Tw и Wr , или число связей, не меняется. Однако возможны дополнительные изменения Tw и Wr без изменения их суммы:
Tw , называемый «поворотом», представляет собой количество поворотов Уотсона-Крика в хромосоме, когда она не ограничена необходимостью лежать в плоскости. Мы уже видели, что нативная ДНК обычно оказывается сверхспиральной. Если обойти суперспирально скрученную хромосому и подсчитать вторичные скручивания Уотсона-Крика, это число будет отличаться от числа, подсчитанного, когда хромосома вынуждена лежать ровно. В целом ожидается, что количество вторичных скручиваний в нативной сверхскрученной хромосоме будет «нормальным» числом витков Уотсона-Крика, что означает один спиральный скручивание из 10 пар оснований на каждые 34 Å длины ДНК.
Wr , называемый «корчеванием», представляет собой количество сверхспиральных витков. Поскольку биологическая кольцевая ДНК обычно не намотана, Lk обычно будет меньше Tw , что означает, что Wr обычно будет отрицательным.
Если ДНК недозакручена, то она будет находиться под напряжением, точно так же, как напрягается металлическая пружина при принудительном раскручивании, и что появление сверхскруток позволит хромосоме снять напряжение, приняв на себя отрицательные сверхскрутки, которые корректируют вторичное подкручивание в соответствии с уравнение топологии выше.
Уравнение топологии показывает, что между изменениями Tw и Wr существует взаимосвязь один к одному . Например, если удален вторичный поворот «Уотсона-Крика», то одновременно должен быть удален правый суперповорот (или, если хромосома расслаблена, без суперповоротов, необходимо добавить левый суперповорот).
Изменение числа связывания Δ Lk представляет собой фактическое количество витков в плазмиде/молекуле Lk минус количество витков в релаксированной плазмиде/молекуле Lk o :
Если ДНК отрицательно сверхспиральна, . Отрицательная сверхспирализация означает, что ДНК перекручена.
Стандартным выражением, не зависящим от размера молекулы, является «разница специфического связывания» или «плотность суперспирали», обозначаемая σ , которая представляет собой количество добавленных или удаленных витков по отношению к общему количеству витков в релаксированной молекуле/плазмиде, что указывает на уровень суперспирализация.
Свободная энергия Гиббса, связанная с намоткой, определяется уравнением ниже [19]
Разница в свободной энергии Гиббса между сверхспиральной кольцевой ДНК и развёрнутой кольцевой ДНК с N > 2000 п.н. аппроксимируется формулой:
или 16 кал/б.п.
Поскольку число связей L суперспиральной ДНК равно количеству раз, когда две цепи переплетаются (и обе цепи остаются ковалентно неповрежденными), L не может измениться. Эталонным состоянием (или параметром) L 0 кольцевого дуплекса ДНК является его расслабленное состояние. В этом состоянии его корча W = 0. Поскольку L = T + W , в расслабленном состоянии T = L . Таким образом, если у нас есть расслабленный кольцевой дуплекс ДНК длиной 400 п.н., L ~ 40 (при условии, что в B-ДНК ~10 п.н. на оборот). Тогда Т ~ 40 .
Отрицательные суперспирали способствуют локальному раскручиванию ДНК, обеспечивая такие процессы, как транскрипция , репликация ДНК и рекомбинация . Также считается, что отрицательная сверхспирализация способствует переходу между B-ДНК и Z-ДНК и смягчает взаимодействия ДНК-связывающих белков, участвующих в регуляции генов . [20]
Некоторые стохастические модели были предложены для объяснения эффектов накопления положительной суперспирализации (PSB) в динамике экспрессии генов (например, в экспрессии бактериальных генов), различаясь, например, уровнем детализации. В целом, детализация увеличивается при добавлении процессов, на которые влияет суперспирализация. По мере этого добавления сложность модели возрастает.
Например, в [21] предложены две модели разной сложности. В наиболее подробном из них события моделировались на уровне нуклеотидов, в то время как в другом события моделировались только в области промотора, и, таким образом, для учета требовалось гораздо меньше событий.
Примеры стохастических моделей, изучающих влияние PSB на активность промотора, можно найти в:. [22] [23] Как правило, такие модели включают промотор Pro, который представляет собой участок ДНК, контролирующий транскрипцию и, таким образом, на активность/блокировку которого влияет PSB. Также включены молекулы РНК (продукт транскрипции), РНК-полимеразы (РНКП), которые контролируют транскрипцию, и гиразы (G), которые регулируют PSB. Наконец, должны быть средства для количественного определения PSB на ДНК (т.е. промотора) в любой данный момент. Этого можно добиться, имея в системе некоторый компонент, который вырабатывается с течением времени (например, во время событий транскрипции) и представляет собой положительные суперспирали, и который удаляется под действием гираз. Затем можно установить количество этого компонента, влияющее на скорость транскрипции.
Топологические свойства кольцевой ДНК сложны. В стандартных текстах эти свойства неизменно объясняются с помощью спиральной модели ДНК, но в 2008 году было отмечено, что каждый топоизомер, отрицательный или положительный, принимает уникальное и удивительно широкое распределение трехмерных конформаций. [4]
Когда коэффициент седиментации s кольцевой ДНК определяется в широком диапазоне pH , можно увидеть следующие кривые. Здесь показаны три кривые, представляющие три вида ДНК. Сверху вниз это: «Форма IV» (зеленый), «Форма I» (синий) и «Форма II» (красный).
«Форма I» (синяя кривая) представляет собой традиционную номенклатуру, используемую для нативной формы дуплексной кольцевой ДНК, полученной из вирусов и внутриклеточных плазмид. Форма I ковалентно замкнута, и поэтому любая плектонемическая обмотка, которая может присутствовать, фиксируется. Если в Форму I вводится один или несколько разрывов, становится возможным свободное вращение одной нити относительно другой, и Форма II (красная кривая) виден.
Форма IV (зеленая кривая) представляет собой продукт щелочной денатурации формы I. Ее структура неизвестна, за исключением того, что она устойчиво дуплексная и чрезвычайно плотная.
Между pH 7 и pH 11,5 коэффициент седиментации s для формы I является постоянным. Затем он падает и при pH чуть ниже 12 достигает минимума. При дальнейшем увеличении pH s возвращается к прежнему значению. Однако на этом она не останавливается, а продолжает неуклонно расти. При pH 13 значение s возрастает почти до 50, что в два-три раза превышает значение при pH 7, что указывает на чрезвычайно компактную структуру.
Если затем уровень pH снижается, значение s не восстанавливается. Вместо этого мы видим верхнюю зеленую кривую. ДНК, находящаяся теперь в состоянии, известном как Форма IV, остается чрезвычайно плотной, даже если pH восстанавливается до исходного физиологического диапазона. Как указывалось ранее, структура Формы IV почти полностью неизвестна, и в настоящее время не существует общепринятого объяснения ее необычайной плотности. Практически все, что известно о третичной структуре, это то, что она дуплексная, но не имеет водородных связей между основаниями.
Считается, что такое поведение форм I и IV обусловлено особыми свойствами дуплексной ДНК, которая ковалентно замкнута в двухцепочечный цикл. Если ковалентная целостность нарушается даже одним разрывом в одной из нитей, все такое топологическое поведение прекращается, и можно увидеть нижнюю кривую формы II (Δ). Для формы II изменения pH оказывают очень незначительное влияние на s . Ее физические свойства в целом идентичны свойствам линейной ДНК. При pH 13 цепи формы II просто разделяются, как это делают цепи линейной ДНК. Отделенные одиночные нити имеют немного разные значения s , но не обнаруживают существенных изменений s при дальнейшем увеличении pH.
Полное объяснение этих данных выходит за рамки данной статьи. Короче говоря, изменения в s происходят из-за изменений в сверхспиральности кольцевой ДНК. Эти изменения в сверхспиральности схематически иллюстрируются четырьмя маленькими рисунками, которые стратегически наложены на рисунок выше.
Вкратце, широко распространено мнение, что изменения s , наблюдаемые на приведенной выше кривой титрования pH, обусловлены изменениями в суперспиральной намотке ДНК в условиях повышения pH. До pH 11,5 предполагаемое «недокручивание» приводит к правостороннему («отрицательному») суперповороту. Но по мере того, как pH увеличивается и вторичная спиральная структура начинает денатурировать и раскручиваться, хромосома (если можно говорить антропоморфно) больше не «хочет» иметь полную обмотку Уотсона-Крика, а, скорее, все больше «хочет» быть «подмотка». Поскольку при суперспиральной намотке приходится снимать все меньше и меньше напряжения, суперспирали постепенно исчезают по мере увеличения pH. При pH чуть ниже 12 все стимулы к сверхспиральности исчезают, и хромосома выглядит как расслабленный, открытый круг.
При еще более высоком pH хромосома, которая сейчас серьезно денатурирует, имеет тенденцию полностью раскручиваться, чего она сделать не может (потому что L k ковалентно заперт). В этих условиях то, что когда-то считалось «недостаточным», на самом деле теперь стало «чрезмерным». Снова возникает напряжение, и снова оно (по крайней мере частично) ослабляется сверхспиральностью, но на этот раз в противоположном направлении ( т. е. в левом или «положительном»). Каждый левый третичный суперповорот удаляет один, теперь уже нежелательный правый вторичный поворот Уотсона-Крика.
Титрование заканчивается при pH 13, когда появляется форма IV.
