Окрашивание — это метод, используемый для усиления контрастности образцов, как правило, на микроскопическом уровне. Окрашиватели и красители часто используются в гистологии (микроскопическое исследование биологических тканей ), цитологии (микроскопическое исследование клеток) и в медицинских областях гистопатологии, гематологии и цитопатологии, которые фокусируются на изучении и диагностике заболеваний на микроскопическом уровне . Окрашивания могут использоваться для определения биологических тканей ( выделение , например, мышечных волокон или соединительной ткани ), популяций клеток (классификация различных клеток крови ) или органелл внутри отдельных клеток.
В биохимии это подразумевает добавление класс-специфического ( ДНК , белки , липиды , углеводы ) красителя к субстрату для квалификации или количественной оценки присутствия определенного соединения. Окрашивание и флуоресцентное мечение могут служить аналогичным целям. Биологическое окрашивание также используется для маркировки клеток в проточной цитометрии и для маркировки белков или нуклеиновых кислот в гель-электрофорезе . Световые микроскопы используются для просмотра окрашенных образцов при большом увеличении, обычно с использованием светлопольного или эпифлуоресцентного освещения.
Окрашивание не ограничивается только биологическими материалами, поскольку его можно использовать и для изучения структуры других материалов, например, пластинчатых структур полукристаллических полимеров или доменных структур блок-сополимеров .
Окрашивание in vivo (также называемое витальным окрашиванием или интравитальным окрашиванием) — это процесс окрашивания живых тканей. Заставляя определенные клетки или структуры приобретать контрастные цвета, можно легко увидеть и изучить их форму ( морфологию ) или положение внутри клетки или ткани. Обычной целью является выявление цитологических деталей, которые в противном случае могли бы быть не видны; однако окрашивание также может показать, где определенные химические вещества или специфические химические реакции происходят внутри клеток или тканей.
Окрашивание in vitro подразумевает окрашивание клеток или структур, которые были удалены из их биологического контекста. Некоторые окраски часто объединяются, чтобы выявить больше деталей и особенностей, чем одна окраска в отдельности. В сочетании со специальными протоколами фиксации и подготовки образцов ученые и врачи могут использовать эти стандартные методы в качестве последовательных, повторяемых диагностических инструментов. Контркраситель — это краситель, который делает клетки или структуры более заметными, когда они не полностью видны при использовании основного красителя.
В то время как ex vivo многие клетки продолжают жить и метаболизировать, пока они не будут «закреплены». Некоторые методы окрашивания основаны на этом свойстве. Те красители, которые исключаются живыми клетками, но поглощаются уже мертвыми клетками, называются витальными красителями (например, трипановый синий или пропидий иодид для эукариотических клеток). Те, которые проникают и окрашивают живые клетки, называются суправитальными красителями (например, новый метиленовый синий и бриллиантовый крезиловый синий для окрашивания ретикулоцитов ). Однако эти красители в конечном итоге токсичны для организма, некоторые более, чем другие. Частично из-за их токсического взаимодействия внутри живой клетки, когда суправитальные красители проникают в живую клетку, они могут давать характерный рисунок окрашивания, отличный от окрашивания уже закрепленной клетки (например, вид «ретикулоцитов» по сравнению с диффузной «полихромазией»). Для достижения желаемых эффектов красители используются в очень разбавленных растворах в диапазоне от 1 : 5 000 до 1 : 500 000 (Howey, 2000). Обратите внимание, что многие красители можно использовать как на живых, так и на фиксированных клетках.
Подготовительные шаги зависят от типа запланированного анализа. Могут потребоваться некоторые или все из следующих процедур.
Влажные препараты используются для просмотра живых организмов и могут быть сделаны с использованием воды и определенных красителей. Жидкость добавляется на предметное стекло перед добавлением организма, а покровное стекло помещается на образец в воде и красителе, чтобы помочь удержать его в поле зрения . [1]
Фиксация , которая сама по себе может состоять из нескольких этапов, направлена на сохранение формы клеток или ткани, вовлеченных в процесс, насколько это возможно. Иногда тепловая фиксация используется для уничтожения, прилипания и изменения образца, чтобы он принимал пятна. Большинство химических фиксаторов (химикатов, вызывающих фиксацию) создают химические связи между белками и другими веществами в образце, увеличивая их жесткость. Распространенные фиксаторы включают формальдегид , этанол , метанол и/или пикриновую кислоту . Кусочки ткани могут быть залиты парафином для повышения их механической прочности и стабильности, а также для облегчения их нарезки на тонкие ломтики. [2]
Протравы — это химические вещества, обладающие способностью окрашивать материалы, которые в противном случае невозможно окрасить.
Протравы подразделяются на две категории:
а) Основная протрава: реагирует с кислотными красителями, например, квасцами, сульфатом железа, хлоридом цетилпиридиния и т. д.
б) Кислотная протрава: реагирует с основными красителями, например, пикриновой кислотой, дубильной кислотой и т. д.
[2] Прямое окрашивание: выполняется без протравы.
Непрямое окрашивание: окрашивание с помощью протравы.
Пермеабилизация подразумевает обработку клеток (обычно) мягким поверхностно-активным веществом . Эта обработка растворяет клеточные мембраны и позволяет более крупным молекулам красителя проникать внутрь клетки.
Монтаж обычно включает в себя прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. В некоторых случаях клетки могут выращиваться непосредственно на предметном стекле. Для образцов свободных клеток (как в случае с мазком крови или мазком Папаниколау ) образец может быть непосредственно нанесен на предметное стекло. Для более крупных фрагментов ткани тонкие срезы (слайсы) изготавливаются с помощью микротома ; затем эти срезы можно монтировать и проверять.
Большинство красителей, обычно используемых в микроскопии, доступны в виде красителей, сертифицированных BSC . Это означает, что образцы партии производителя были протестированы независимым органом, Комиссией по биологическим красителям ( BSC ), и признаны соответствующими или превосходящими определенные стандарты чистоты, содержания красителя и производительности в методах окрашивания, что обеспечивает более точное проведение экспериментов и более надежные результаты. Эти стандарты опубликованы в журнале комиссии Biotechnic & Histochemistry . [3] Многие красители непостоянны по составу от одного поставщика к другому. Использование красителей, сертифицированных BSC, устраняет источник неожиданных результатов. [4]
Некоторые поставщики продают красители, «сертифицированные» ими самими, а не Комиссией по биологическим красителям. Такие продукты могут подходить или не подходить для диагностических и других целей. [5]
Простой метод окрашивания бактерий, который обычно оказывается успешным, даже когда методы позитивного окрашивания терпят неудачу, заключается в использовании негативного окрашивания . Этого можно добиться, размазав образец по предметному стеклу, а затем нанеся нигрозин (черный синтетический краситель) или тушь (водную суспензию частиц углерода). После высыхания микроорганизмы можно рассматривать в микроскопии светлого поля как более светлые включения, хорошо контрастирующие с темной средой, окружающей их. [6] Негативное окрашивание способно окрашивать фон вместо организмов, поскольку клеточная стенка микроорганизмов обычно имеет отрицательный заряд, который отталкивает отрицательно заряженное пятно. Красители, используемые при негативном окрашивании, являются кислыми. [1] Примечание: негативное окрашивание — это мягкий метод, который может не уничтожить микроорганизмы, и поэтому не подходит для изучения патогенов.
В отличие от негативного окрашивания, позитивное окрашивание использует основные красители для окрашивания образца на ярком фоне. Хотя хромофор используется как для негативного, так и для позитивного окрашивания, тип хромофора, используемый в этой технике, представляет собой положительно заряженный ион вместо отрицательного. Отрицательно заряженная клеточная стенка многих микроорганизмов притягивает положительно заряженный хромофор, что заставляет образец поглощать краситель, придавая ему цвет используемого красителя. Положительное окрашивание используется в микробиологии чаще, чем отрицательное. Различные типы положительного окрашивания перечислены ниже. [1]
Простое окрашивание — это метод, при котором на слайде одновременно используется только один тип красителя. Поскольку используется только один краситель, образцы (для положительных окрасок) или фон (для отрицательных окрасок) будут одного цвета. Поэтому простые окраски обычно используются для просмотра только одного организма на слайде. Дифференциальное окрашивание использует несколько красителей на слайде. В зависимости от используемых красителей организмы с разными свойствами будут выглядеть по-разному, что позволяет классифицировать несколько образцов. Дифференциальное окрашивание также может использоваться для окрашивания различных органелл в пределах одного организма, что можно увидеть при окрашивании эндоспор . [1]
Окрашивание по Граму используется для определения статуса Грама для классификации бактерий в целом на основе состава их клеточной стенки . Окрашивание по Граму использует кристаллический фиолетовый для окрашивания клеточных стенок, йод (в качестве протравы) и фуксин или сафранин для контрастного окрашивания (отметить все бактерии). Статус Грама помогает разделить образцы бактерий на две группы, как правило, представляющие их базовую филогению. Эта характеристика в сочетании с другими методами делает его полезным инструментом в клинических микробиологических лабораториях, где он может быть важен для раннего выбора соответствующих антибиотиков . [8]
На большинстве препаратов, окрашенных по Граму, грамотрицательные организмы выглядят красными или розовыми из-за их контрастного окрашивания. Из-за присутствия более высокого содержания липидов после обработки спиртом пористость клеточной стенки увеличивается, поэтому комплекс CVI (кристаллический фиолетовый – йод) может проходить через нее. Таким образом, первичная окраска не сохраняется. Кроме того, в отличие от большинства грамположительных бактерий, грамотрицательные бактерии имеют только несколько слоев пептидогликана и вторичную клеточную мембрану, состоящую в основном из липополисахарида.
Окрашивание эндоспорами используется для определения наличия или отсутствия эндоспор , которые очень затрудняют уничтожение бактерий. Бактериальные споры, как оказалось, трудно окрашивать, поскольку они непроницаемы для водных красящих реагентов. Окрашивание эндоспорами особенно полезно для определения бактериальных патогенов , образующих эндоспоры, таких как Clostridium difficile . До разработки более эффективных методов это окрашивание выполнялось с использованием метода Виртца с термической фиксацией и контрастным окрашиванием. Благодаря использованию малахитового зеленого и разбавленного соотношения карболового фуксина фиксация бактерий в осмиевой кислоте была отличным способом гарантировать отсутствие смешивания красителей. Однако недавно пересмотренные методы окрашивания значительно сократили время, необходимое для создания этих красителей. Этот пересмотр включал замену карболового фуксина водным сафранином в паре с новой разбавленной 5% формулой малахитового зеленого. Этот новый и улучшенный состав красителей был выполнен так же, как и раньше, с использованием термофиксации, промывки и промокания насухо для последующего исследования. При исследовании все бактерии, образующие эндоспоры, будут окрашены в зеленый цвет, а все остальные клетки будут выглядеть красными. [9]
Окраска по Цилю–Нильсену — кислотоустойчивая окраска, используемая для окрашивания видов Mycobacterium tuberculosis , которые не окрашиваются стандартными лабораторными процедурами окрашивания, такими как окраска по Граму.
Окрашивание выполняется с использованием как красного карболового фуксина , который окрашивает бактерии, так и контрастного красителя, такого как метиленовый синий .
Окрашивание гематоксилином и эозином часто используется в гистологии для исследования тонких срезов тканей. [10] Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, тогда как эозин окрашивает цитоплазму, соединительную ткань и другие внеклеточные вещества в розовый или красный цвет. [10] Эозин сильно поглощается эритроцитами , окрашивая их в ярко-красный цвет. В искусно приготовленном препарате H&E эритроциты становятся почти оранжевыми, а коллаген и цитоплазма (особенно мышечная) приобретают различные оттенки розового.
Окрашивание по Папаниколау , или окрашивание по Папаниколау, было разработано для замены тонкоигольной аспирационной цитологии (FNAC) в надежде сократить время окрашивания и стоимость без ущерба для качества. Это окрашивание является часто используемым методом для исследования образцов клеток из различных типов тканей в различных органах. Окрашивание по Папаниколау претерпело несколько модификаций, чтобы стать «подходящей альтернативой» FNAC. Этот переход произошел из-за признания учеными влажных фиксированных мазков, сохраняющих структуру ядер в отличие от непрозрачного вида высушенных на воздухе мазков Романовского. Это привело к созданию гибридного окрашивания влажной фиксации и высушенных на воздухе, известного как сверхбыстрое окрашивание по Папаниколау. Эта модификация включает использование назального физиологического раствора для регидратации клеток с целью повышения прозрачности клеток и сочетается с использованием спиртового формалина для улучшения цвета ядер. Окрашивание по Папаниколау теперь используется вместо цитологического окрашивания во всех типах органов из-за его повышения морфологического качества, сокращения времени окрашивания и снижения стоимости. Его часто используют для окрашивания образцов мазков по Папаниколау . [11] Он использует комбинацию гематоксилина , оранжевого G , эозина Y , светло-зеленого SF желтоватого и иногда бисмарковского коричневого Y. [ 10] [11] [12]
[13] Периодическая кислота-Шифф — это специальный гистологический краситель, используемый для маркировки углеводов ( гликогена , гликопротеина , протеогликанов ). PAS обычно используется на тканях печени, где образуются отложения гликогена, что делается в целях различения различных типов заболеваний, связанных с накоплением гликогена. PAS важен, поскольку он может обнаруживать гранулы гликогена, обнаруженные в опухолях яичников и поджелудочной железы эндокринной системы, а также в мочевом пузыре и почках почечной системы. Базальные мембраны также могут отображаться при окраске PAS и могут быть важны при диагностике заболеваний почек. Из-за большого объема углеводов в клеточной стенке гиф и дрожжевых форм грибов, окраска периодической кислотой-Шиффом может помочь обнаружить эти виды внутри образцов тканей человеческого тела.
Трихром Массона (как следует из названия) представляет собой протокол трехцветного окрашивания. Рецепт развился из оригинальной техники Массона для различных специфических применений, но все они хорошо подходят для различения клеток от окружающей соединительной ткани . Большинство рецептов дают красный кератин и мышечные волокна, синее или зеленое окрашивание коллагена и костей , светло-красное или розовое окрашивание цитоплазмы и черные ядра клеток .
Окрашивание по Романовскому считается эффектом полихромного окрашивания и основано на сочетании эозина плюс (химически восстановленный эозин ) и деметилированного метиленового синего (содержащего продукты его окисления азур А и азур В). Это окрашивание дает различные цвета для всех клеточных структур («эффект Романовского-Гимзы») и, таким образом, использовалось для окрашивания полиморфов нейтрофилов и клеточных ядер. Распространенные варианты включают окрашивание по Райту , окрашивание по Дженнеру , окрашивание по Май-Грюнвальду, окрашивание по Лейшману и окрашивание по Гимзе .
Все они используются для исследования образцов крови или костного мозга . Они предпочтительнее H&E для исследования клеток крови, поскольку можно легко различить различные типы лейкоцитов (белых кровяных клеток). Все они также подходят для исследования крови с целью обнаружения паразитов, передающихся через кровь, таких как малярия . [14]
Окрашивание серебром — это использование серебра для окрашивания гистологических срезов . Этот вид окрашивания важен для демонстрации белков (например, коллагена типа III ) и ДНК . Он используется для демонстрации как веществ внутри, так и снаружи клеток . Окрашивание серебром также используется в электрофорезе в градиенте температуры .
Аргентаффинные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после фиксации формалином . Этот метод был открыт итальянцем Камилло Гольджи с помощью реакции между нитратом серебра и дихроматом калия , что приводит к осаждению хромата серебра в некоторых клетках (см. Метод Гольджи ). Аргирофильные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после воздействия красителя, содержащего восстановитель . Примером этого может служить гидрохинон или формалин.
Окрашивание суданом использует красители суданофильных веществ, часто включая липиды . Часто используются судан III , судан IV , масляный красный O , тетроксид осмия и судан черный B. Окрашивание суданом часто используется для определения уровня фекального жира при диагностике стеатореи .
Окрашивание по Виртцу-Конклину — это специальная техника, разработанная для окрашивания настоящих эндоспор с использованием малахитового зеленого в качестве основного красителя и сафранина в качестве контрового красителя. После окрашивания они не обесцвечиваются. Добавление тепла в процессе окрашивания является огромным способствующим фактором. [15] Тепло помогает открыть мембрану споры, чтобы краситель мог проникнуть внутрь. Основная цель этого окрашивания — показать прорастание бактериальных спор. Если происходит процесс прорастания, то спора станет зеленого цвета из-за малахитового зеленого, а окружающая клетка станет красной из-за сафранина. Это окрашивание также может помочь определить ориентацию споры внутри бактериальной клетки; является ли она терминальной (на кончике), субтерминальной (внутри клетки) или центральной (полностью в середине клетки).
Окрашивание коллагеновым гибридизирующим пептидом (КГП) позволяет легко и напрямую окрашивать денатурированные коллагены любого типа (тип I, II, IV и т. д.) независимо от того, были ли они повреждены или деградировали ферментативным, механическим, химическим или термическим путем. Они работают путем рефолдинга в тройную спираль коллагена с доступными одиночными цепями в ткани. КГП можно визуализировать с помощью простого флуоресцентного микроскопа .
Различные красители реагируют или концентрируются в разных частях клетки или ткани, и эти свойства используются с выгодой для выявления определенных частей или областей. Некоторые из наиболее распространенных биологических красителей перечислены ниже. Если не указано иное, все эти красители могут использоваться с фиксированными клетками и тканями; витальные красители (подходящие для использования с живыми организмами) отмечены.
Акридиновый оранжевый (АО) — это селективный к нуклеиновым кислотам флуоресцентный катионный краситель, полезный для определения клеточного цикла. Он проницаем для клеток и взаимодействует с ДНК и РНК посредством интеркаляции или электростатического притяжения. При связывании с ДНК он очень похож по спектру на флуоресцеин. Как и флуоресцеин, он также полезен в качестве неспецифического красителя для подсветки традиционно окрашенных клеток на поверхности твердого образца ткани (окрашивание с подсветкой флуоресценцией [16] ).
[17] Бисмарк коричневый (также Бисмарк коричневый Y или Манчестер коричневый) придает желтый цвет кислым муцинам и интенсивный коричневый цвет тучным клеткам. Одним из недостатков этого красителя является то, что он затмевает любую другую окружающую его структуру и снижает качество контраста. Его необходимо сочетать с другими красителями, чтобы он был полезным. Некоторые дополнительные красители, используемые вместе с Бисмарк коричневым, — это гематоксилин и толуидиновый синий, которые обеспечивают лучший контраст в гистологическом образце.
Кармин — это интенсивно-красный краситель, используемый для окрашивания гликогена , в то время как карминовые квасцы — ядерный краситель. Для окраски кармином требуется протрава, обычно алюминий .
Кумасси бриллиантовый синий неспецифически окрашивает белки в интенсивный синий цвет. Часто используется в гель-электрофорезе.
Крезиловый фиолетовый окрашивает кислые компоненты нейрональной цитоплазмы в фиолетовый цвет, в частности тельца Ниссля . Часто используется в исследованиях мозга.
Кристаллический фиолетовый в сочетании с подходящим протравителем окрашивает стенки клеток в фиолетовый цвет. Кристаллический фиолетовый — это краситель, используемый при окраске по Граму.
DAPI — это флуоресцентный ядерный краситель, возбуждаемый ультрафиолетовым светом и показывающий сильную синюю флуоресценцию при связывании с ДНК . DAPI связывается с A=T-богатыми повторами хромосом. DAPI также не виден при обычной трансмиссионной микроскопии. Его можно использовать в живых или фиксированных клетках. Клетки, окрашенные DAPI, особенно подходят для подсчета клеток. [18]
Эозин чаще всего используется в качестве контрастного красителя для гематоксилина, придавая розовый или красный цвет цитоплазматическому материалу, клеточным мембранам и некоторым внеклеточным структурам. Он также придает эритроцитам интенсивный красный цвет . Эозин также может использоваться в качестве контрастного красителя в некоторых вариантах окрашивания по Граму и во многих других протоколах. На самом деле существуют два очень близкородственных соединения, обычно называемых эозином. Чаще всего используется эозин Y (также известный как эозин Y ws или эозин желтоватый); он имеет очень легкий желтоватый оттенок. Другое соединение эозина — эозин B (эозин голубоватый или императорский красный); он имеет очень слабый голубоватый оттенок. Эти два красителя взаимозаменяемы, и использование одного или другого — это скорее вопрос предпочтений и традиций.
Бромистый этидий интеркалирует и окрашивает ДНК, обеспечивая флуоресцентное красно-оранжевое окрашивание. Хотя он не окрашивает здоровые клетки, его можно использовать для идентификации клеток, находящихся на последних стадиях апоптоза — такие клетки имеют гораздо более проницаемые мембраны . Следовательно, бромистый этидий часто используется в качестве маркера апоптоза в популяциях клеток и для обнаружения полос ДНК в гель-электрофорезе . Окрашивание также можно использовать в сочетании с акридиновым оранжевым (АО) при подсчете жизнеспособных клеток. Это комбинированное окрашивание EB/AO заставляет живые клетки флуоресцировать зеленым цветом, в то время как апоптотические клетки сохраняют характерную красно-оранжевую флуоресценцию.
Кислый фуксин может использоваться для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрий . Кислый фуксин используется в качестве ядерного и цитоплазматического красителя в трихромном методе Маллори. Кислый фуксин окрашивает цитоплазму в некоторых вариантах трихрома Массона. В пикрофуксине Ван Гизона кислый фуксин придает красный цвет коллагеновым волокнам. Кислый фуксин также является традиционным красителем для митохондрий (метод Альтмана).
Гематоксилин (в Северной Америке гематоксилин) — ядерный краситель. [10] При использовании с протравой гематоксилин окрашивает ядра в сине-фиолетовый или коричневый цвет. [10] Чаще всего его используют с эозином при окрашивании H&E (гематоксилином и эозином), одной из самых распространенных процедур в гистологии . [10]
Hoechst — это производное бис -бензимидазола, которое связывается с малой бороздкой ДНК . Часто используемые во флуоресцентной микроскопии для окрашивания ДНК, красители Hoechst выглядят желтыми при растворении в водных растворах и излучают синий свет при УФ-возбуждении. Существует два основных типа Hoechst : Hoechst 33258 и Hoechst 33342. Эти два соединения функционально схожи, но имеют небольшую разницу в структуре. Hoechst 33258 содержит концевую гидроксильную группу и, таким образом, более растворим в водном растворе, однако эта характеристика снижает его способность проникать через плазматическую мембрану . Hoechst 33342 содержит этильную замену на концевой гидроксильной группе (т. е. этилэфирную группу), что делает его более гидрофобным для более легкого прохождения через плазматическую мембрану
Йод используется в химии в качестве индикатора крахмала . При смешивании крахмала с йодом в растворе образуется интенсивный темно-синий цвет, представляющий собой комплекс крахмала и йода. Крахмал является веществом, общим для большинства растительных клеток, поэтому слабый раствор йода окрасит крахмал, присутствующий в клетках. Йод является одним из компонентов в методе окрашивания, известном как окрашивание по Граму , используемом в микробиологии . Используемый в качестве протравы при окрашивании по Граму, йод усиливает проникновение красителя через поры, присутствующие в клеточной стенке/мембране.
Раствор Люголя или раствор Люголя (ИКИ) представляет собой коричневый раствор, который чернеет в присутствии крахмалов и может использоваться в качестве красителя для клеток, делая ядра клеток более заметными.
Раствор Люголя, используемый с обычным уксусом (уксусной кислотой), используется для выявления предраковых и раковых изменений в тканях шейки матки и влагалища во время контрольных обследований «мазка Папаниколау» в рамках подготовки к биопсии. Уксусная кислота заставляет аномальные клетки бледнеть, в то время как нормальные ткани окрашиваются в коричнево-красный цвет из-за йода. [19]
Малахитовый зеленый (также известный как бриллиантовый зеленый B или виктория зеленый B) может использоваться в качестве сине-зеленого контрастного красителя для сафранина в методе окрашивания бактерий по Хименесу . Его также можно использовать для прямого окрашивания спор .
Метиловый зеленый обычно используется в микроскопах со светлым полем, а также в флуоресцентных микроскопах [20] для окрашивания хроматина клеток, что облегчает их наблюдение.
Метиленовый синий используется для окрашивания клеток животных, таких как клетки щеки человека, чтобы сделать их ядра более заметными. Также используется для окрашивания мазков крови в цитологии.
Нейтральный красный (или толуиленовый красный) окрашивает вещество Ниссля в красный цвет. Обычно используется как контрокраска в сочетании с другими красителями.
Нильский синий (или Нильский синий А) окрашивает ядра в синий цвет. Его можно использовать с живыми клетками.
Нильский красный (также известный как оксазон нильского синего) образуется при кипячении нильского синего с серной кислотой . Это дает смесь нильского красного и нильского синего. Нильский красный — липофильный краситель; он накапливается в липидных глобулах внутри клеток, окрашивая их в красный цвет. Нильский красный можно использовать с живыми клетками. Он сильно флуоресцирует при разделении на липиды, но практически не флуоресцирует в водном растворе.
Тетраоксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими материалами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества.
Пропидий йодид — флуоресцентный интеркалирующий агент, который можно использовать для окрашивания клеток. Пропидий йодид используется в качестве красителя ДНК в проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток или содержания ДНК в анализе клеточного цикла или в микроскопии для визуализации ядра и других органелл, содержащих ДНК. Пропидий йодид не может пересекать мембрану живых клеток, что делает его полезным для дифференциации некротических, апоптотических и здоровых клеток. PI также связывается с РНК, что требует обработки нуклеазами для различения окрашивания РНК и ДНК
Родамин — это флуоресцентный краситель, специфичный для белка, широко используемый во флуоресцентной микроскопии.
Сафранин (или Сафранин О) — красный катионный краситель. Он связывается с ядрами (ДНК) и другими тканевыми полианионами , включая гликозаминогликаны в хрящах и тучных клетках, а также компоненты лигнина и пластид в растительных тканях. [21] Сафранин не следует путать с шафраном, дорогим натуральным красителем, который используется в некоторых методах для придания желтого цвета коллагену, чтобы контрастировать с синими и красными цветами, придаваемыми другими красителями ядрам и цитоплазме в тканях животных (включая человека).
Неправильное написание «сафранин» является общепринятым. Окончание -ин подходит для сафранина О, поскольку этот краситель является амином. [4] [22] [23]
Ткани, которые впитывают красители, называются хроматическими . Хромосомы получили такое название из-за своей способности впитывать фиолетовое пятно.
Положительное сродство к определенному красителю может быть обозначено суффиксом -philic . Например, ткани, которые окрашиваются лазурным красителем, могут называться азурофильными . Это также может использоваться для более общих свойств окрашивания, таких как ацидофильный для тканей, которые окрашиваются кислотными красителями (в первую очередь эозином ), базофильный при окрашивании основными красителями и амфофильный [24] при окрашивании как кислотными, так и основными красителями. Напротив, хромофобные ткани не впитывают цветной краситель легко.
Как и в световой микроскопии, для усиления контрастности в просвечивающей электронной микроскопии можно использовать красители . Обычно используются электронно-плотные соединения тяжелых металлов.
[25] Фосфорновольфрамовая кислота является распространенным негативным красителем для вирусов , нервов , полисахаридов и других биологических тканевых материалов. Она в основном используется в форме 0,5-2% ph, что делает ее нейтральной, и в паре с водой образует водный раствор. Фосфорновольфрамовая кислота наполнена электронно-плотным веществом, которое окрашивает фон, окружающий образец, в темный цвет, а сам образец — в светлый. Этот процесс не является обычной позитивной техникой окрашивания, при которой образец темный, а фон остается светлым.
Тетроксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими материалами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества. Поскольку это тяжелый металл, поглощающий электроны, это, пожалуй, самый распространенный краситель, используемый для морфологии в биологической электронной микроскопии. Он также используется для окрашивания различных полимеров для изучения их морфологии с помощью ТЭМ. OsO
4очень летуч и чрезвычайно токсичен. Это сильный окислитель, поскольку осмий имеет степень окисления +8. Он агрессивно окисляет многие материалы, оставляя после себя осадок нелетучего осмия в более низкой степени окисления.
Тетроксид рутения столь же летуч и даже более агрессивен, чем тетраоксид осмия, и способен окрашивать даже материалы, устойчивые к красителю осмием, например, полиэтилен.
Другие химические вещества, используемые при окрашивании с помощью электронной микроскопии, включают: молибдат аммония , иодид кадмия , карбогидразид , хлорид железа , гексамин , трихлорид индия , нитрат лантана (III) , ацетат свинца , цитрат свинца , нитрат свинца (II) , периодную кислоту , фосфорномолибденовую кислоту , феррицианид калия , ферроцианид калия , рутениевый красный , нитрат серебра , протеинат серебра , хлороаурат натрия, нитрат таллия , тиосемикарбазид , ацетат уранила , нитрат уранила и сульфат ванадила .
