Электрофорез в полиакриламидном геле ( ПААГ ) – метод, широко используемый в биохимии , судебной химии , генетике , молекулярной биологии и биотехнологии для разделения биологических макромолекул , обычно белков или нуклеиновых кислот , в зависимости от их электрофоретической подвижности . Электрофоретическая подвижность зависит от длины, конформации и заряда молекулы. Электрофорез в полиакриламидном геле — мощный инструмент, используемый для анализа образцов РНК. Когда полиакриламидный гель денатурируется после электрофореза, он предоставляет информацию о составе образца видов РНК. [1]
Гидратация акрилонитрила приводит к образованию молекул акриламида ( C 3 H 5 NO ) под действием нитрилгидратазы . [2] Мономер акриламида находится в порошкообразном состоянии до добавления воды. Акриламид токсичен для нервной системы человека, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать все меры безопасности. Акриламид растворим в воде и при добавлении свободнорадикальных инициаторов полимеризуется с образованием полиакриламида. [2] Получать полиакриламидный гель путем гидратации акриламида полезно, поскольку размер пор можно регулировать. Повышенные концентрации акриламида приводят к уменьшению размера пор после полимеризации. Полиакриламидный гель с мелкими порами помогает лучше исследовать более мелкие молекулы, поскольку мелкие молекулы могут проникать в поры и проходить через гель, в то время как крупные молекулы задерживаются в отверстиях пор.
Как и во всех формах гель-электрофореза , молекулы могут работать в их естественном состоянии , сохраняя структуру молекул более высокого порядка. Этот метод называется Native-PAGE. В качестве альтернативы можно добавить химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную молекулу, подвижность которой зависит только от ее длины (поскольку все комплексы белок-ДСН имеют одинаковое соотношение массы к заряду). Эта процедура называется SDS-PAGE . Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) — это метод разделения молекул, основанный на разнице их молекулярной массы. При pH, при котором проводится гель-электрофорез, молекулы ДСН заряжены отрицательно и связываются с белками в заданном соотношении, примерно одна молекула ДСН на каждые 2 аминокислоты. [3] : 164–79 Таким образом, детергент обеспечивает всем белкам одинаковое соотношение заряда к массе. Связываясь с белками, детергент разрушает их вторичную, третичную и/или четвертичную структуру, денатурируя их и превращая в отрицательно заряженные линейные полипептидные цепи. Под воздействием электрического поля в ПААГ отрицательно заряженные полипептидные цепи перемещаются к аноду с различной подвижностью. Их подвижность, или расстояние, которое проходят молекулы, обратно пропорциональна логарифму их молекулярной массы. [4] Сравнивая относительное отношение расстояния, пройденного каждым белком, к длине геля (Rf), можно сделать выводы об относительной молекулярной массе белков, где длина геля определяется расстоянием, пройденным небольшая молекула, подобная следящему красителю. [5]
Для нуклеиновых кислот наиболее часто используемым денатурирующим агентом является мочевина . Что касается белков, додецилсульфат натрия (ДСН) представляет собой анионный детергент, наносимый на образцы белков для покрытия белков с целью придания двух отрицательных зарядов (от каждой молекулы ДСН) каждому двум аминокислотам денатурированного белка. [3] : 161–3 2-Меркаптоэтанол также можно использовать для разрушения дисульфидных связей, обнаруженных между белковыми комплексами, что способствует дальнейшей денатурации белка. В большинстве белков связывание ДСН с полипептидными цепями обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза. Белки с более высоким гидрофобным содержанием (например, многие мембранные белки и те, которые взаимодействуют с поверхностно-активными веществами в их нативной среде) по своей сути труднее точно лечить с помощью этого метода из-за большей вариабельности соотношения связанных ДСН. [6] Совместное использование нативного электрофореза и SDS-PAGE можно использовать для очистки и разделения различных субъединиц белка. Native-PAGE сохраняет олигомерную форму неповрежденной, и на геле появляется полоса, отражающая уровень активности. SDS-PAGE денатурирует и разделит олигомерную форму на мономеры, показывая полосы, соответствующие их молекулярной массе. Эти полосы можно использовать для идентификации и оценки чистоты белка. [3] : 161–3
Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки или нуклеиновые кислоты. Они могут быть получены биологическим путем, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, образцов окружающей среды или очищенных белков. В случае твердых тканей или клеток их часто сначала разрушают механически с помощью блендера (для больших объемов проб), гомогенизатора ( меньшие объемы), ультразвукового аппарата или циклического воздействия высокого давления, а также сочетания биохимических и механические методы, включая различные типы фильтрации и центрифугирования , могут использоваться для разделения различных клеточных компартментов и органелл перед электрофорезом. Синтетические биомолекулы, такие как олигонуклеотиды, также могут использоваться в качестве аналитов.
Образец для анализа при необходимости смешивают с химическим денатурирующим веществом, обычно с ДСН для белков или мочевиной для нуклеиновых кислот. ДСН представляет собой анионный детергент , который денатурирует вторичные и недисульфидные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Мочевина разрывает водородные связи между парами оснований нуклеиновой кислоты, вызывая разделение составляющих цепей. Нагревание образцов до температуры не менее 60 °C еще больше способствует денатурации. [7] [8] [9] [10]
В дополнение к SDS, белки могут необязательно кратковременно нагреваться почти до кипения в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT) или 2-меркаптоэтанол (бета-меркаптоэтанол/BME) , который дополнительно денатурирует белки за счет восстановления дисульфидных связей. таким образом преодолевая некоторые формы третичной складки белка и разрушая четвертичную структуру белка (олигомерные субъединицы). Это известно как уменьшение SDS-PAGE.
В раствор можно добавить следящий краситель. Обычно он имеет более высокую электрофоретическую подвижность, чем аналиты, что позволяет экспериментатору отслеживать продвижение раствора через гель во время электрофореза.
Гели обычно состоят из акриламида , бисакриламида , необязательного денатуранта (ДСН или мочевины) и буфера с установленным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. Альтернативно, в растворяющийся гель (для белков) после заливки можно добавить бутанол, поскольку бутанол удаляет пузырьки и делает поверхность гладкой. [11] Для инициирования полимеризации добавляют источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED . [12] Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида , который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами акриламида. Соотношение бисакриламида к акриламиду можно варьировать для специальных целей, но обычно оно составляет примерно 1 часть к 35. Концентрация акриламида в геле также может варьироваться, обычно в диапазоне от 5% до 25%. Гели с более низким процентным содержанием лучше подходят для разделения молекул с очень высокой молекулярной массой, в то время как для разделения более мелких белков необходим гораздо более высокий процент акриламида. Средний диаметр пор полиакриламидных гелей определяется общей концентрацией акриламидов (% Т с Т = общая концентрация акриламида и бисакриламида) и концентрацией сшивающего агента бисакриламида (% С с С = концентрация бисакриламида). [13] Размер пор уменьшается пропорционально %T. Что касается %C, то концентрация 5% дает самые маленькие поры, поскольку влияние бисакриламида на размер пор имеет форму параболы с вершиной на уровне 5%.
Гели обычно полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в литейной машине для геля, в которую сверху вставлена гребенка для создания лунок для образцов. После полимеризации геля расческу можно снять и гель готов к электрофорезу.
В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. [9] [14] [15]
Электрическое поле прикладывается к гелю, заставляя отрицательно заряженные белки или нуклеиновые кислоты мигрировать по гелю от отрицательного электрода (который является катодом, поскольку это электролитический, а не гальванический элемент) к положительному электроду (катоду). анод). В зависимости от размера каждая биомолекула по-разному движется через матрицу геля: малым молекулам легче проникнуть через поры геля, а более крупным — с трудом. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрировали на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы перемещаются дальше по гелю, а более крупные остаются ближе к месту происхождения. Таким образом, биомолекулы можно грубо разделить по размеру, который зависит главным образом от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации более высокого порядка в нативных условиях. Подвижность геля определяется как скорость миграции при градиенте напряжения 1 В/см и имеет единицы см 2 /сек/В. [3] : 161–3 В аналитических целях относительная подвижность биомолекул R f , отношение расстояния, пройденного молекулой по гелю, к общему расстоянию, пройденному следящим красителем, отображается на графике в зависимости от молекулярной массы молекулы ( или иногда логарифм MW, или, скорее, M r , молекулярный радиус). Такие типично линейные графики представляют собой стандартные маркеры или калибровочные кривые, которые широко используются для количественной оценки различных размеров биомолекул. [3] : 161–3
Однако некоторые гликопротеины ведут себя аномально на гелях SDS. Кроме того, сообщается, что анализ более крупных белков размером от 250 000 до 600 000 Да является проблематичным из-за того, что такие полипептиды неправильно перемещаются в обычно используемых гелевых системах. [16]
После электрофореза гель можно окрасить (для белков, чаще всего бриллиантовым синим Кумасси R-250 или авторедиографией; для нуклеиновых кислот - бромистым этидием ; или и то, и другое - серебряным пятном ), что позволяет визуализировать разделенные белки, или подвергнуть дальнейшей обработке ( например вестерн-блоттинг ). После окрашивания биомолекулы разных видов выглядят как отдельные полосы внутри геля. Обычно маркеры размера молекулярной массы известной молекулярной массы размещают на отдельной дорожке в геле для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера.
Для белков SDS-PAGE обычно является лучшим методом анализа чистоты из-за его надежности и простоты. Присутствие SDS и стадия денатурации приводят к разделению белков примерно в зависимости от размера, но может произойти аберрантная миграция некоторых белков. Различные белки также могут окрашиваться по-разному, что мешает количественному определению путем окрашивания. ПААГ также можно использовать в качестве препаративного метода очистки белков. Например, препаративный нативный ПААГ — метод разделения нативных металлопротеинов в сложных биологических матрицах.
Полиакриламидный гель (ПАГ) был известен как потенциальная среда для заливки тканей еще в 1964 году, а две независимые группы использовали ПАГ в электрофорезе в 1959 году. [17] [18] Он обладает рядом электрофоретически желательных свойств, которые делают его универсальной средой. . Это синтетический, термостабильный, прозрачный, прочный, химически относительно инертный гель, который можно приготовить с широким диапазоном средних размеров пор. [19] Размер пор геля и воспроизводимость размера пор геля определяются тремя факторами: общим количеством присутствующего акриламида (%T) (T = общая концентрация мономера акриламида и бисакриламида), количеством сшивающего агента. (%C) (C = концентрация бисакриламида) и время полимеризации акриламида (см. QPNC-PAGE). Размер пор уменьшается с увеличением %T; при сшивании 5% C дает наименьший размер пор. Любое увеличение или уменьшение %C от 5% увеличивает размер пор, поскольку размер пор относительно %C представляет собой параболическую функцию с вершиной, равной 5%C. По-видимому, это происходит из-за неоднородного связывания полимерных нитей внутри геля. Этот гелевый материал также может выдерживать высокие градиенты напряжения , поддается различным процедурам окрашивания и обесцвечивания и может расщепляться для извлечения разделенных фракций или сушиться для авторадиографии и постоянной регистрации.
Полиакриламидные гели состоят из укладочного геля и разделительного геля. Укладочные гели имеют более высокую пористость по сравнению с разделительным гелем и позволяют белкам мигрировать в концентрированной области. Кроме того, штабелирующие гели обычно имеют pH 6,8, поскольку нейтральные молекулы глицина обеспечивают более быструю подвижность белка. Разделительные гели имеют pH 8,8, при этом анионный глицин замедляет подвижность белков. Разделительные гели позволяют разделять белки и имеют относительно меньшую пористость. Здесь белки разделяются по размеру (в SDS-PAGE) и размеру/заряду (Native PAGE). [20]
Химический буфер стабилизирует значение pH до желаемого значения внутри самого геля и в буфере для электрофореза. Выбор буфера также влияет на электрофоретическую подвижность противоионов буфера и , следовательно, на разрешение геля. Буфер также должен быть инерционным, не модифицировать и не вступать в реакцию с большинством белков. Различные буферы могут использоваться в качестве катодных и анодных буферов соответственно, в зависимости от применения. В одном геле можно использовать несколько значений pH, например, при DISC-электрофорезе. Общие буферы в PAGE включают Трис , Бис-Трис или имидазол .
Противоион уравновешивает собственный заряд буферного иона, а также влияет на напряженность электрического поля во время электрофореза. Высокозаряженные и подвижные ионы часто избегают использования в катодных буферах для SDS-PAGE, но их можно включать в сам гель, где они мигрируют впереди белка. В таких приложениях, как DISC SDS-PAGE, значения pH внутри геля могут изменяться, чтобы изменить средний заряд противоионов во время анализа и улучшить разрешение. Популярными противоионами являются глицин и трицин . Глицин использовался в качестве источника висячих ионов или медленных ионов, поскольку его pKa составляет 9,69, а подвижность глицината такова, что эффективная подвижность может быть установлена на уровне ниже, чем у самых медленных известных белков с суммарным отрицательным зарядом в диапазоне pH. Минимальный pH этого диапазона составляет примерно 8,0.
Акриламид ( C 3 H 5 NO ; мВт: 71,08) при растворении в воде происходит медленная, спонтанная автополимеризация акриламида , соединяющая молекулы вместе «голова к хвосту» с образованием длинных одноцепочечных полимеров. Наличие системы, генерирующей свободные радикалы, значительно ускоряет полимеризацию. Этот тип реакции известен как полимеризация присоединения винила . Раствор этих полимерных цепей становится вязким, но не образует геля, поскольку цепи просто скользят друг по другу. Для образования геля необходимо соединение различных цепей вместе. Акриламид является канцерогенным , [ 21] нейротоксином и репродуктивным токсином. [22] Также важно хранить акриламид в темном и сухом прохладном месте, чтобы уменьшить автополимеризацию и гидролиз .
Бисакриламид ( N , N' -метиленбисакриламид ) ( C 7 H 10 N 2 O 2 ; мВт: 154,17) является наиболее часто используемым сшивающим агентом для полиакриламидных гелей. Химически его можно представить как две молекулы акриламида, соединенные лицом к лицу своими нереакционноспособными концами. Бисакриламид может сшивать две полиакриламидные цепи друг с другом, в результате чего образуется гель.
Додецилсульфат натрия (SDS) ( C 12 H 25 NaO 4 S ; мВт: 288,38) (используется только при денатурировании белковых гелей) представляет собой сильный детергент, используемый для денатурации нативных белков до отдельных полипептидов . Эта денатурация, которая называется реконструктивной денатурацией, достигается не за счет полной линеаризации белка, а вместо этого за счет конформационного изменения в результате комбинации случайного клубка и вторичных структур α-спирали. [6] Когда белковая смесь нагревается до 100 °C в присутствии ДСН, детергент обволакивает основную цепь полипептида. Он связывается с полипептидами в постоянном массовом соотношении 1,4 г ДСН/г полипептида. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержнеобразными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть одинаковым суммарным отрицательным зарядом на единицу веса. Электрофоретическая подвижность этих белков является линейной функцией логарифмов их молекулярных масс. Без SDS разные белки с одинаковой молекулярной массой мигрировали бы по-разному из-за различий в соотношении массы и заряда, поскольку каждый белок имеет изоэлектрическую точку и молекулярную массу, характерную для его первичной структуры . Это известно как собственная страница PAGE . Добавление SDS решает эту проблему, поскольку он связывается с белком и разворачивает его, создавая почти однородный отрицательный заряд по длине полипептида.
Мочевина ( CO(NH 2 ) 2 ; мВт: 60,06) представляет собой хаотропный агент , который увеличивает энтропию системы, препятствуя внутримолекулярным взаимодействиям, опосредованным нековалентными силами , такими как водородные связи и силы Ван-дер-Ваальса . Макромолекулярная структура зависит от суммарного эффекта этих сил, поэтому из этого следует, что увеличение количества хаотропных растворенных веществ денатурирует макромолекулы,
Персульфат аммония (АПС) ( N 2 H 8 S 2 O 8 ; мВт: 228,2) является источником свободных радикалов и часто используется в качестве инициатора гелеобразования. Альтернативным источником свободных радикалов является рибофлавин , который генерирует свободные радикалы в фотохимической реакции.
TEMED ( N , N , N ', N' -тетраметилэтилендиамин) ( C 6 H 16 N 2 ; мВт: 116,21) стабилизирует свободные радикалы и улучшает полимеризацию. Скорость полимеризации и свойства образующегося геля зависят от концентрации свободных радикалов. Увеличение количества свободных радикалов приводит к уменьшению средней длины полимерной цепи, увеличению мутности геля и снижению эластичности геля. Уменьшение суммы приводит к обратному эффекту. Следует использовать самые низкие каталитические концентрации, которые позволяют полимеризоваться за разумный период времени. APS и TEMED обычно используются в приблизительно эквимолярных концентрациях в диапазоне от 1 до 10 мМ.
Следующие химикаты и процедуры используются для обработки геля и визуализируемых в нем образцов белка.
Следящий краситель; поскольку белки и нуклеиновые кислоты в основном бесцветны, их продвижение через гель во время электрофореза нелегко проследить. Поэтому анионные красители с известной электрофоретической подвижностью обычно включаются в буфер образца PAGE. Очень распространенным следящим красителем является бромфеноловый синий (BPB, 3',3",5',5" тетрабромфенолсульфонфталеин). Этот краситель окрашен при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду . Будучи высокомобильной молекулой, она опережает большинство белков. По достижении анодного конца электрофорезной среды электрофорез прекращают. Он может слабо связываться с некоторыми белками и придавать синий цвет. Другими распространенными следящими красителями являются ксилолцианол , который имеет меньшую подвижность, и Orange G , который имеет более высокую подвижность.
Погрузочные средства; большинство систем PAGE загружаются сверху в лунки внутри геля. Чтобы образец опустился на дно геля, в буфер для образца добавляют добавки, увеличивающие плотность образца. Эти добавки должны быть неионными и нереактивными по отношению к белкам, чтобы не мешать электрофорезу. Обычными добавками являются глицерин и сахароза .
Кумасси бриллиантовый синий R-250 (CBB) ( C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2 ; мВт: 825,97) является наиболее популярным белковым красителем. Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Структура CBB преимущественно неполярна, и его обычно используют в метанольном растворе, подкисленном уксусной кислотой. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенный в гель, можно удалить путем окрашивания тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются как синие полосы на прозрачном фоне. Поскольку SDS также является анионным, он может мешать процессу окрашивания. Поэтому рекомендуется использовать большой объем окрашивающего раствора, по крайней мере в десять раз превышающий объем геля.
Бромид этидия (EtBr) — популярный краситель нуклеиновых кислот. EtBr позволяет легко визуализировать ДНК или РНК на геле, поскольку EtBr флуоресцирует оранжевым цветом в УФ-свете. [23] Бромид этидия связывает цепи нуклеиновых кислот посредством процесса интеркаляции. [3] Хотя бромид этидия является популярным пятном, важно соблюдать осторожность при использовании EtBr, поскольку он является известным канцерогеном . По этой причине многие исследователи предпочитают использовать такие красители, как SYBR Green и SYBR Safe, которые являются более безопасной альтернативой EtBr. [24] EtBr используется простым добавлением его в гелевую смесь. После того, как гель растекся, его можно просмотреть с помощью системы фотодокументирования. [3]
Окрашивание серебром используется, когда необходим более чувствительный метод обнаружения, поскольку классическое окрашивание Кумасси бриллиантовым синим обычно позволяет обнаружить полосу белка массой 50 нг. Окрашивание серебром обычно увеличивает чувствительность в 10-100 раз. Это основано на химии фотографического проявления. Белки фиксируются на геле разбавленным раствором метанола, затем инкубируются с кислым раствором нитрата серебра. Ионы серебра восстанавливаются до металлической формы формальдегидом при щелочном pH. Кислый раствор, например уксусная кислота, останавливает развитие. [25] Окрашивание серебром было предложено Кереньи и Галлясом как чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях . [26] Этот метод был распространен на изучение других биологических макромолекул , которые были разделены на различных носителях. [27] На интенсивность цвета могут влиять многие переменные , и каждый белок имеет свои собственные характеристики окрашивания; чистая стеклянная посуда, чистые реактивы и вода высочайшей чистоты – залог успешного окрашивания. [28] Морилка серебром была разработана в 14 веке для окраски поверхности стекла. Его широко использовали для этой цели с 16 века. Цвет первых серебряных пятен варьировался от светло-желтого до оранжево-красного. Камилло Гольджи усовершенствовал окрашивание серебром для изучения нервной системы . Метод Гольджи окрашивает ограниченное количество клеток случайным образом целиком. [29]
Ауторадиография, также используемая для обнаружения белковых полос после гель-электрофореза, использует радиоактивные изотопы для мечения белков, которые затем обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки. [30]
Вестерн-блоттинг — это процесс, при котором белки, разделенные в акриламидном геле, электрофоретически переносятся на стабильную мембрану, с которой можно манипулировать, например, мембрану из нитроцеллюлозы , нейлона или ПВДФ . Затем можно применить иммунохимические методы для визуализации перенесенных белков, а также точно определить относительное увеличение или уменьшение количества интересующего белка.
{{cite book}}: |last=имеет общее имя ( справка )