Фаза G 0 описывает клеточное состояние вне репликативного клеточного цикла . Классически [ когда? ] считалось, что клетки входят в G 0 в первую очередь из-за факторов окружающей среды, таких как нехватка питательных веществ, что ограничивало ресурсы, необходимые для пролиферации. Таким образом, это считалось фазой покоя . Теперь известно, что G 0 принимает разные формы и происходит по нескольким причинам. Например, большинство взрослых нейрональных клеток, одни из самых метаболически активных клеток в организме, полностью дифференцированы и находятся в терминальной фазе G 0. Нейроны находятся в этом состоянии не из-за стохастического или ограниченного запаса питательных веществ, а как часть их программы развития.
G 0 впервые было предложено как состояние клетки на основе ранних исследований клеточного цикла. Когда первые исследования определили четыре фазы клеточного цикла с использованием методов радиоактивной маркировки, было обнаружено, что не все клетки в популяции пролиферируют с одинаковой скоростью. [1] «Фракция роста» популяции — или фракция популяции, которая росла — активно пролиферировала, но другие клетки существовали в непролиферативном состоянии. Некоторые из этих непролиферирующих клеток могли реагировать на внешние стимулы и пролиферировать, повторно входя в клеточный цикл. [2] Ранние противоположные взгляды либо считали, что непролиферирующие клетки просто находятся в расширенной фазе G 1 или в фазе клеточного цикла, отличной от G 1 — называемой G 0 . [3] Последующие исследования указали на точку рестрикции (точку R) в G 1 , где клетки могут войти в G 0 до точки R, но привержены митозу после точки R. [4] Эти ранние исследования предоставили доказательства существования состояния G 0 , доступ к которому ограничен. Эти клетки, которые не делятся дальше, выходят из фазы G1 и переходят в неактивную стадию, называемую стадией покоя.
Существуют три состояния G 0 , которые можно классифицировать как обратимые (покоящиеся) или необратимые ( стареющие и дифференцированные ). Каждое из этих трех состояний может быть введено из фазы G 1 до того, как клетка перейдет к следующему раунду клеточного цикла. Покой относится к обратимому состоянию G 0 , в котором субпопуляции клеток находятся в «покоящем» состоянии перед входом в клеточный цикл после активации в ответ на внешние сигналы. Покоящиеся клетки часто идентифицируются по низкому содержанию РНК , отсутствию маркеров пролиферации клеток и повышенному сохранению меток, что указывает на низкий оборот клеток. [5] [6] Старение отличается от покоя, поскольку старение является необратимым состоянием, в которое клетки входят в ответ на повреждение или деградацию ДНК, что делает потомство клетки нежизнеспособным. Такое повреждение ДНК может происходить из- за укорочения теломер в течение многих делений клеток, а также из-за воздействия активных форм кислорода (ROS), активации онкогенов и слияния клеток. Хотя стареющие клетки больше не могут реплицироваться, они остаются способными выполнять многие нормальные клеточные функции. [7] [8] [9] [10] Старение часто является биохимической альтернативой самоуничтожению такой поврежденной клетки путем апоптоза . В отличие от клеточного старения, покой является не реактивным событием, а частью основного программирования нескольких различных типов клеток. Наконец, дифференцированные клетки — это стволовые клетки, которые прошли программу дифференциации, чтобы достичь зрелого — терминально дифференцированного — состояния. Дифференцированные клетки продолжают оставаться в G 0 и выполнять свои основные функции бесконечно.
Транскриптомы нескольких типов покоящихся стволовых клеток, таких как кроветворные , мышечные и волосяные фолликулы, были охарактеризованы с помощью высокопроизводительных методов, таких как микрочип и секвенирование РНК . Хотя существуют вариации в их индивидуальных транскриптомах, большинство покоящихся стволовых клеток тканей имеют общую схему экспрессии генов, которая включает в себя подавление генов прогрессирования клеточного цикла, таких как циклин A2 , циклин B1 , циклин E2 и сурвивин , и повышение регуляции генов, участвующих в регуляции транскрипции и судьбы стволовых клеток, таких как FOXO3 и EZH1 . Понижение митохондриального цитохрома C также отражает низкое метаболическое состояние покоящихся стволовых клеток. [11]
Многие покоящиеся стволовые клетки, особенно взрослые стволовые клетки , также имеют схожие эпигенетические паттерны. Например, H3K4me3 и H3K27me3 — это два основных паттерна метилирования гистонов , которые образуют двухвалентный домен и расположены вблизи участков инициации транскрипции. Было обнаружено, что эти эпигенетические маркеры регулируют решения о происхождении в эмбриональных стволовых клетках, а также контролируют покой в волосяных фолликулах и мышечных стволовых клетках посредством модификации хроматина . [11]
Функциональные гены-супрессоры опухолей , в частности гены p53 и Rb , необходимы для поддержания покоя стволовых клеток и предотвращения истощения пула клеток-предшественников из-за избыточных делений. Например, было показано, что удаление всех трех компонентов семейства белков Rb останавливает покой в гемопоэтических стволовых клетках. Было показано, что отсутствие p53 предотвращает дифференциацию этих стволовых клеток из-за неспособности клеток выйти из клеточного цикла в фазу G 0. В дополнение к p53 и Rb, ингибиторы циклинзависимой киназы (CKI), такие как p21 , p27 и p57 , также важны для поддержания покоя. В гемопоэтических стволовых клетках мышей нокаут p57 и p27 приводит к выходу G 0 через ядерный импорт циклина D1 и последующее фосфорилирование Rb. Наконец, было показано, что сигнальный путь Notch играет важную роль в поддержании покоя. [11]
Было показано, что посттранскрипционная регуляция экспрессии генов посредством синтеза miRNA играет не менее важную роль в поддержании покоя стволовых клеток. Нити miRNA связываются с 3′ нетранслируемой областью ( 3′ UTR ) целевых мРНК , предотвращая их трансляцию в функциональные белки. Длина 3′ UTR гена определяет его способность связываться с нитями miRNA, тем самым позволяя регулировать покой. Некоторые примеры miRNA в стволовых клетках включают miR-126, которая контролирует путь PI3K/AKT/mTOR в гемопоэтических стволовых клетках, miR-489, которая подавляет онкоген DEK в мышечных стволовых клетках, и miR-31, которая регулирует Myf5 в мышечных стволовых клетках. Секвестрация miRNA мРНК в рибонуклеопротеиновых комплексах позволяет покоящимся клеткам хранить мРНК, необходимую для быстрого входа в фазу G1 . [11]
Стволовые клетки, которые долгое время находились в состоянии покоя, часто сталкиваются с различными стрессорами окружающей среды, такими как окислительный стресс . Однако несколько механизмов позволяют этим клеткам реагировать на такие стрессоры. Например, факторы транскрипции FOXO реагируют на присутствие активных форм кислорода (ROS), в то время как HIF1A и LKB1 реагируют на гипоксические состояния. В гемопоэтических стволовых клетках аутофагия индуцируется в ответ на метаболический стресс. [11]
Стволовые клетки — это клетки с уникальной способностью производить дифференцированные дочерние клетки и сохранять свою идентичность стволовых клеток посредством самообновления. [12] У млекопитающих большинство взрослых тканей содержат тканеспецифические стволовые клетки , которые находятся в ткани и размножаются для поддержания гомеостаза на протяжении всей жизни организма. Эти клетки могут подвергаться огромной пролиферации в ответ на повреждение ткани, прежде чем дифференцироваться и участвовать в регенерации. Некоторые тканевые стволовые клетки существуют в обратимом, неподвижном состоянии неопределенно долго, пока не будут активированы внешними стимулами. Существует много различных типов тканевых стволовых клеток, включая мышечные стволовые клетки (MuSCs), нейральные стволовые клетки (NSCs), кишечные стволовые клетки (ISCs) и многие другие.
Недавно было высказано предположение, что состояние покоя стволовых клеток состоит из двух отдельных функциональных фаз: G 0 и фазы «тревоги», называемой G Alert . [13] Считается, что стволовые клетки активно и обратимо переходят между этими фазами, чтобы реагировать на стимулы травмы, и, по-видимому, приобретают улучшенную функцию регенерации тканей в G Alert . Таким образом, переход в G Alert был предложен как адаптивный ответ, который позволяет стволовым клеткам быстро реагировать на травму или стресс, подготавливая их к входу в клеточный цикл. В мышечных стволовых клетках активность mTORC1 была идентифицирована для контроля перехода из G 0 в G Alert вместе с сигнализацией через рецептор HGF cMet . [13]
В то время как обратимое состояние покоя, возможно, наиболее важно для стволовых клеток тканей, чтобы быстро реагировать на стимулы и поддерживать надлежащий гомеостаз и регенерацию, обратимые фазы G 0 можно обнаружить в нестволовых клетках, таких как зрелые гепатоциты. [14] Гепатоциты обычно находятся в состоянии покоя в нормальной печени, но подвергаются ограниченной репликации (менее 2 клеточных делений) во время регенерации печени после частичной гепатэктомии. Однако в некоторых случаях гепатоциты могут испытывать огромную пролиферацию (более 70 клеточных делений), что указывает на то, что их способность к пролиферации не затрудняется существованием в обратимом состоянии покоя. [14]
Часто связанные со старением и возрастными заболеваниями in vivo, стареющие клетки можно обнаружить во многих возобновляемых тканях, включая строму , сосудистую систему , кроветворную систему и многие эпителиальные органы. В результате накопления в течение многих клеточных делений старение часто наблюдается в связанных с возрастом дегенеративных фенотипах. Было обнаружено, что стареющие фибробласты в моделях функции эпителиальных клеток молочной железы нарушают выработку молочного белка из-за секреции матриксных металлопротеиназ . [15] Аналогичным образом стареющие гладкомышечные клетки легочной артерии заставляют соседние гладкомышечные клетки пролиферировать и мигрировать, возможно, способствуя гипертрофии легочных артерий и в конечном итоге легочной гипертензии. [16]
Во время скелетного миогенеза циклические клетки-предшественники, известные как миобласты, дифференцируются и сливаются вместе в нециклические мышечные клетки, называемые миоцитами, которые остаются в терминальной фазе G 0. [17] В результате волокна, составляющие скелетные мышцы (миофибриллы), представляют собой клетки с несколькими ядрами, называемыми миоядрами, поскольку каждое миоядро произошло из одного миобласта. Клетки скелетных мышц продолжают бесконечно обеспечивать сократительную силу посредством одновременных сокращений клеточных структур, называемых саркомерами . Важно отметить, что эти клетки сохраняются в терминальной фазе G 0 , поскольку нарушение структуры мышечного волокна после формирования миофибрилл предотвратит правильную передачу силы по всей длине мышцы. Рост мышц может стимулироваться ростом или травмой и включает в себя набор мышечных стволовых клеток, также известных как сателлитные клетки, из обратимого состояния покоя. Эти стволовые клетки дифференцируются и сливаются, чтобы генерировать новые мышечные волокна как параллельно, так и последовательно, чтобы увеличить способность генерировать силу.
Сердечная мышца также формируется посредством миогенеза, но вместо того, чтобы привлекать стволовые клетки для слияния и формирования новых клеток, клетки сердечной мышцы, известные как кардиомиоциты , просто увеличиваются в размерах по мере увеличения размера сердца. Подобно скелетным мышцам, если бы кардиомиоцитам пришлось продолжать делиться, чтобы добавлять мышечную ткань, сократительные структуры, необходимые для работы сердца, были бы нарушены.
Из четырех основных типов костных клеток остеоциты являются наиболее распространенными и также существуют в терминальной фазе G 0. Остеоциты возникают из остеобластов, которые заключены в самосекретируемую матрицу. Хотя остеоциты также имеют сниженную синтетическую активность, они все еще выполняют функции костей, помимо создания структуры. Остеоциты работают через различные механосенсорные механизмы, чтобы помочь в обычном обороте костной матрицы.
За исключением нескольких нейрогенных ниш в мозге, большинство нейронов полностью дифференцированы и находятся в терминальной фазе G 0. Эти полностью дифференцированные нейроны образуют синапсы , где электрические сигналы передаются аксонами к дендритам близлежащих нейронов. В этом состоянии G 0 нейроны продолжают функционировать до старения или апоптоза. Многочисленные исследования сообщают о накоплении повреждений ДНК с возрастом, в частности окислительных повреждений , в мозге млекопитающих . [18]
Впервые было обнаружено, что Rim15 играет важную роль в инициации мейоза в диплоидных дрожжевых клетках. В условиях низкого содержания глюкозы и азота, которые являются ключевыми питательными веществами для выживания дрожжей, диплоидные дрожжевые клетки инициируют мейоз посредством активации ранних мейотически-специфических генов (EMG). Экспрессия EMG регулируется Ume6. Ume6 привлекает гистондеацетилазы , Rpd3 и Sin3, для подавления экспрессии EMG при высоких уровнях глюкозы и азота, и привлекает фактор транскрипции EMG Ime1 при низких уровнях глюкозы и азота. Rim15, названный так в честь своей роли в регуляции EMG под названием IME2, вытесняет Rpd3 и Sin3, тем самым позволяя Ume6 доставить Ime1 к промоторам EMG для инициации мейоза. [19]
Помимо роли в инициации мейоза, Rim15 также, как было показано, является критическим эффектором для входа дрожжевых клеток в G 0 при наличии стресса. Сигналы от нескольких различных сигнальных путей питательных веществ сходятся на Rim15, который активирует факторы транскрипции Gis1, Msn2 и Msn4. Gis1 связывается с промоторами, содержащими элементы постдиауксического сдвига роста (PDS), и активирует их, в то время как Msn2 и Msn4 связываются с промоторами, содержащими элементы реакции на стресс (STRE), и активируют их. Хотя неясно, как Rim15 активирует Gis1 и Msn2/4, есть некоторые предположения, что он может напрямую фосфорилировать их или участвовать в ремоделировании хроматина. Также было обнаружено, что Rim15 содержит домен PAS на своем N-конце , что делает его недавно обнаруженным членом семейства киназ PAS . Домен PAS является регуляторной единицей белка Rim15, который может играть роль в распознавании окислительного стресса у дрожжей. [19]
Дрожжи растут экспоненциально посредством ферментации глюкозы. Когда уровень глюкозы падает, дрожжи переходят от ферментации к клеточному дыханию , метаболизируя продукты ферментации из своей экспоненциальной фазы роста. Этот сдвиг известен как диауксический сдвиг, после которого дрожжи входят в G 0 . Когда уровень глюкозы в окружающей среде высок, продукция цАМФ через путь RAS-цАМФ-ПКА ( зависимый от цАМФ путь ) повышается, заставляя протеинкиназу А (ПКА) ингибировать свою нисходящую цель Rim15 и разрешать пролиферацию клеток. Когда уровень глюкозы падает, продукция цАМФ снижается, снимая ингибирование ПКА Rim15 и позволяя дрожжевой клетке войти в G 0 . [19]
Помимо глюкозы, для пролиферации дрожжей решающее значение имеет присутствие азота. В условиях низкого содержания азота Rim15 активируется, способствуя остановке клеточного цикла посредством инактивации протеинкиназ TORC1 и Sch9. Хотя TORC1 и Sch9 относятся к двум отдельным путям, а именно путям, индуцированным TOR и ферментируемой средой роста соответственно, обе протеинкиназы действуют, способствуя цитоплазматическому удержанию Rim15. В нормальных условиях Rim15 прикреплен к цитоплазматическому белку 14-3-3 , Bmh2, посредством фосфорилирования его Thr1075. TORC1 инактивирует определенные фосфатазы в цитоплазме, удерживая Rim15 прикрепленным к Bmh2, в то время как считается, что Sch9 способствует цитоплазматическому удержанию Rim15 посредством фосфорилирования другого сайта связывания 14-3-3, близкого к Thr1075. Когда внеклеточный азот низкий, TORC1 и Sch9 инактивируются, что позволяет дефосфорилировать Rim15 и его последующий транспорт в ядро, где он может активировать факторы транскрипции, участвующие в содействии проникновению клеток в G 0 . Также было обнаружено, что Rim15 способствует собственному экспорту из ядра посредством аутофосфорилирования . [19]
Дрожжевые клетки реагируют на низкие уровни внеклеточного фосфата, активируя гены, которые участвуют в производстве и регуляции неорганического фосфата. Путь PHO участвует в регуляции уровней фосфата. В нормальных условиях комплекс циклин-зависимой киназы дрожжей , Pho80-Pho85, инактивирует фактор транскрипции Pho4 посредством фосфорилирования. Однако, когда уровни фосфата падают, Pho81 ингибирует Pho80-Pho85, позволяя Pho4 быть активным. Когда фосфата много, Pho80-Pho85 также ингибирует ядерный пул Rim 15, способствуя фосфорилированию его сайта связывания Thr1075 Bmh2. Таким образом, Pho80-Pho85 действует совместно с Sch9 и TORC1, способствуя цитоплазматическому удержанию Rim15 в нормальных условиях. [19]
Переход из фазы G 1 в фазу S происходит за счет инактивации Rb посредством его прогрессивного гиперфосфорилирования комплексами циклин D/Cdk4 и циклин E /Cdk2 в поздней фазе G 1 . Раннее наблюдение, что потеря Rb способствовала повторному входу в клеточный цикл в клетках G 0 , предполагает, что Rb также необходим для регуляции перехода из G 0 в G 1 в покоящихся клетках. [20] Дальнейшие наблюдения показали, что уровни мРНК циклина C самые высокие, когда клетки человека выходят из фазы G 0 , что предполагает, что циклин C может участвовать в фосфорилировании Rb для содействия повторному входу в клеточный цикл арестованных клеток G 0 . Анализы киназы иммунопреципитации показали, что циклин C обладает активностью киназы Rb. Кроме того, в отличие от циклинов D и E, активность киназы Rb циклина C самая высокая во время ранней фазы G 1 и самая низкая во время поздней фазы G 1 и S , что предполагает, что он может участвовать в переходе из G 0 в G 1 . Использование сортировки клеток с активацией флуоресценции для идентификации клеток G 0 , которые характеризуются высоким соотношением ДНК к РНК по сравнению с клетками G 1 , подтвердило подозрение, что циклин C способствует выходу G 0 , поскольку подавление эндогенного циклина C с помощью РНК-интерференции в клетках млекопитающих увеличивало долю клеток, арестованных в G 0 . Дальнейшие эксперименты, включающие мутацию Rb в определенных сайтах фосфорилирования, показали, что фосфорилирование циклином C Rb в S807/811 необходимо для выхода G 0 . Однако остается неясным, достаточен ли этот паттерн фосфорилирования для выхода G 0 . Наконец, анализы коиммунопреципитации показали, что циклин-зависимая киназа 3 (cdk3) способствует выходу G 0 , образуя комплекс с циклином C для фосфорилирования Rb в S807/811. Интересно, что S807/811 также являются мишенями фосфорилирования циклина D/cdk4 во время перехода G 1 в S. Это может предполагать возможную компенсацию активности cdk3 cdk4, особенно в свете наблюдения, что выход G 0 только задерживается, а не постоянно подавляется в клетках, лишенных cdk3, но функциональных в cdk4. Несмотря на перекрытие целей фосфорилирования, кажется, что cdk3 все еще необходим для наиболее эффективного перехода от G 0 к G 1 . [21]
Исследования показывают, что репрессия Rb семейства факторов транскрипции E2F регулирует переход из G 0 в G 1 так же, как и переход из G 1 в S. Активирующие комплексы E2F связаны с привлечением гистоновых ацетилтрансфераз , которые активируют экспрессию генов, необходимую для входа в G 1 , в то время как комплексы E2F4 привлекают гистоновые деацетилазы, которые подавляют экспрессию генов. Фосфорилирование Rb комплексами Cdk позволяет ему диссоциировать от факторов транскрипции E2F и последующую экспрессию генов, необходимых для выхода из G 0. Было обнаружено, что другие члены семейства белков кармана Rb , такие как p107 и p130, также участвуют в остановке G 0. Уровни p130 повышаются в G 0 и, как было обнаружено, связываются с комплексами E2F-4 для подавления транскрипции целевых генов E2F. Между тем, было обнаружено, что p107 спасает фенотип клеточного ареста после потери Rb, даже несмотря на то, что p107 экспрессируется на сравнительно низких уровнях в клетках G 0. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что подавление Rb факторов транскрипции E2F способствует клеточному аресту, в то время как фосфорилирование Rb приводит к выходу из G 0 посредством дерепрессии целевых генов E2F. [20] В дополнение к регуляции E2F, Rb также подавляет РНК-полимеразу I и РНК-полимеразу III , которые участвуют в синтезе рРНК . Таким образом, фосфорилирование Rb также позволяет активировать синтез рРНК, что имеет решающее значение для синтеза белка при входе в G 1 . [21]