В молекулярной биологии [ 1] [2] [3] репликация ДНК — это биологический процесс создания двух идентичных реплик ДНК из одной исходной молекулы ДНК . [4] Репликация ДНК происходит во всех живых организмах и является наиболее важной частью биологического наследования . Это важно для деления клеток во время роста и восстановления поврежденных тканей, а также гарантирует, что каждая новая клетка получит свою собственную копию ДНК. [5] Клетка обладает отличительным свойством деления, что делает репликацию ДНК необходимой.
ДНК состоит из двойной спирали двух комплементарных цепей . Двойная спираль описывает внешний вид двухцепочечной ДНК, которая, таким образом, состоит из двух линейных нитей, которые идут напротив друг друга и скручиваются вместе, образуя форму. [6] Во время репликации эти цепи разделяются. Каждая цепь исходной молекулы ДНК затем служит матрицей для производства своей копии — процесс, называемый полуконсервативной репликацией . В результате полуконсервативной репликации новая спираль будет состоять из исходной цепи ДНК, а также из вновь синтезированной цепи. [7] Механизмы клеточной корректуры и проверки ошибок обеспечивают практически идеальную точность репликации ДНК. [8] [9]
В клетке репликация ДНК начинается в определенных местах или источниках репликации [10] в геноме [ 11] , который содержит генетический материал организма. [12] Раскручивание ДНК в месте начала и синтез новых цепей, поддерживаемых ферментом, известным как хеликаза , приводит к тому, что репликационные вилки растут в двух направлениях от начала. Ряд белков связан с репликационной вилкой, помогая инициировать и продолжать синтез ДНК . Прежде всего, ДНК-полимераза синтезирует новые цепи, добавляя нуклеотиды , которые дополняют каждую (матрицу) цепь. Репликация ДНК происходит во время S-стадии интерфазы . [13]
Репликация ДНК (амплификация ДНК) также может осуществляться in vitro (искусственно, вне клетки). [14] ДНК-полимеразы, выделенные из клеток, и искусственные ДНК-праймеры можно использовать для запуска синтеза ДНК на известных последовательностях в матричной молекуле ДНК. Примерами являются полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР) и опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА). В марте 2021 года исследователи сообщили о доказательствах, свидетельствующих о том, что предварительной формой транспортной РНК , необходимого компонента трансляции , биологического синтеза новых белков в соответствии с генетическим кодом , могла быть сама молекула-репликатор на самых ранних стадиях развития жизни. или абиогенез . [15] [16]
ДНК существует в виде двухцепочечной структуры, где обе нити скручены вместе, образуя характерную двойную спираль . Каждая отдельная нить ДНК представляет собой цепочку из четырех типов нуклеотидов . Нуклеотиды в ДНК содержат сахар дезоксирибозу , фосфат и азотистое основание . Четыре типа нуклеотидов соответствуют четырем азотистым основаниям аденину , цитозину , гуанину и тимину , обычно обозначаемым сокращенно A, C, G и T. Аденин и гуанин представляют собой пуриновые [17] основания , а цитозин и тимин представляют собой пиримидины . Эти нуклеотиды образуют фосфодиэфирные связи , создавая фосфатно-дезоксирибозный остов двойной спирали ДНК с нуклеиновыми основаниями, направленными внутрь (т. е. к противоположной цепи). Нуклеиновые основания соединяются между цепями посредством водородных связей с образованием пар оснований . Аденин образует пары с тимином (две водородные связи), а гуанин — с цитозином (три водородные связи ). [18]
Нити ДНК имеют направленность , и разные концы одной цепи называются «3' (трехштриховым) концом» и «5' (пятиштриховым) концом». По соглашению, если дана последовательность оснований одной цепи ДНК, левый конец последовательности - это 5'-конец, а правый конец последовательности - это 3'-конец. Нити двойной спирали антипараллельны: одна из них расположена от 5’ к 3’, а противоположная – от 3’ к 5’. Эти термины относятся к атому углерода в дезоксирибозе, к которому присоединяется следующий фосфат в цепи. Направленность имеет последствия при синтезе ДНК, поскольку ДНК-полимераза может синтезировать ДНК только в одном направлении, добавляя нуклеотиды к 3'-концу цепи ДНК.
Спаривание комплементарных оснований в ДНК (посредством водородных связей ) означает, что информация, содержащаяся внутри каждой цепи, является избыточной. Фосфодиэфирные (внутрицепочечные) связи прочнее водородных (межцепочечных). Фактическая работа фосфодиэфирных связей заключается в том, что в полимерах ДНК 5'-атом углерода одного нуклеотида соединяется с 3'-атомом углерода другого нуклеотида, в то время как водородные связи стабилизируют двойные спирали ДНК поперек оси спирали, а не в направлении оси спирали. ось. [19] Это позволяет отделить пряди друг от друга. Таким образом, нуклеотиды одной цепи можно использовать для реконструкции нуклеотидов вновь синтезированной партнерской цепи. [20]
ДНК-полимеразы — это семейство ферментов , которые осуществляют все формы репликации ДНК. [22] ДНК-полимеразы, как правило, не могут инициировать синтез новых цепей, а могут только удлинять существующую цепь ДНК или РНК в паре с цепью матрицы. Чтобы начать синтез, необходимо создать короткий фрагмент РНК, называемый праймером , и соединить его с цепью ДНК-матрицы.
ДНК-полимераза добавляет новую цепь ДНК, удлиняя 3'-конец существующей нуклеотидной цепи, добавляя по одному новые нуклеотиды , соответствующие матричной цепи, посредством создания фосфодиэфирных связей . Энергия для этого процесса полимеризации ДНК поступает от гидролиза высокоэнергетических фосфатных (фосфоангидридных) связей между тремя фосфатами, прикрепленными к каждому невключенному основанию . Свободные основания с присоединенными к ним фосфатными группами называются нуклеотидами ; в частности, основания с тремя присоединенными фосфатными группами называются нуклеозидтрифосфатами . При присоединении нуклеотида к растущей цепи ДНК образование фосфодиэфирной связи между проксимальным фосфатом нуклеотида к растущей цепи сопровождается гидролизом высокоэнергетической фосфатной связи с высвобождением двух дистальных фосфатных групп в виде пирофосфат . Ферментативный гидролиз полученного пирофосфата в неорганический фосфат потребляет вторую высокоэнергетическую фосфатную связь и делает реакцию практически необратимой. [Примечание 1]
В целом ДНК-полимеразы очень точны, их собственная частота ошибок составляет менее одной ошибки на каждые 107 добавленных нуклеотидов. [23] Некоторые ДНК-полимеразы могут также удалять нуклеотиды с конца развивающейся цепи, чтобы исправить несовпадающие основания. Это известно как корректура. Наконец, механизмы пострепликационной репарации несоответствий отслеживают ДНК на наличие ошибок, способные отличать несоответствия во вновь синтезированной цепи ДНК от исходной последовательности цепи. Вместе эти три этапа распознавания обеспечивают точность репликации менее одной ошибки на каждые 10 9 добавленных нуклеотидов. [23]
Скорость репликации ДНК в живой клетке была впервые измерена как скорость удлинения ДНК фага Т4 в инфицированной фагом E. coli . [24] В период экспоненциального роста ДНК при 37 °C скорость составляла 749 нуклеотидов в секунду. Частота мутаций на пару оснований за репликацию во время синтеза ДНК фага Т4 составляет 1,7 на 10 8 . [25]
Репликация ДНК, как и все процессы биологической полимеризации, протекает в три ферментативно катализируемых и скоординированных этапа: инициация, элонгация и терминация.
Чтобы клетка могла делиться , она должна сначала реплицировать свою ДНК. [26] Репликация ДНК — это процесс по принципу «все или ничего»; как только репликация начинается, она завершается. После завершения репликации она больше не повторяется в том же клеточном цикле. Это становится возможным благодаря разделению инициации пререпликационного комплекса .
В позднем митозе и ранней фазе G1 большой комплекс белков-инициаторов собирается в пререпликационный комплекс в определенных точках ДНК, известных как « оригиналы ». [11] [10] В E. coli основным белком-инициатором является ДНК А ; у дрожжей это комплекс распознавания происхождения . [27] Последовательности, используемые белками-инициаторами, имеют тенденцию быть «богатыми АТ» (богатыми основаниями аденина и тимина), поскольку пары оснований АТ имеют две водородные связи (а не три, образующиеся в паре CG) и, следовательно, их легче связать. -отдельный. [28] У эукариот комплекс распознавания ориджина катализирует сборку белков-инициаторов в пререпликационный комплекс. Кроме того, недавний отчет предполагает, что ORC почкующихся дрожжей димеризуется в зависимости от клеточного цикла, чтобы контролировать лицензирование. [29] [30] В свою очередь, процесс димеризации ORC опосредован зависимым от клеточного цикла циклом димеризации Noc3p in vivo, и эта роль Noc3p отделена от его роли в биогенезе рибосом. Существенный цикл димеризации Noc3p опосредует образование двойного гексамера ORC при лицензировании репликации. ORC и Noc3p постоянно связаны с хроматином на протяжении всего клеточного цикла. [31] Cdc6 и Cdt1 затем связываются со связанным комплексом распознавания источника в источнике, чтобы сформировать более крупный комплекс, необходимый для загрузки комплекса Mcm в ДНК. У эукариот комплекс Mcm представляет собой хеликазу, которая расщепляет спираль ДНК в вилках и началах репликации. Комплекс Mcm рекрутируется на поздней фазе G1 и загружается комплексом ORC-Cdc6-Cdt1 в ДНК посредством АТФ-зависимого ремоделирования белка. Загрузка комплекса Mcm на исходную ДНК знаменует завершение формирования пререпликационного комплекса. [32]
Если условия окружающей среды подходят для поздней фазы G1, активируются комплексы циклин G1 и G1/S - Cdk , которые стимулируют экспрессию генов, которые кодируют компоненты синтетического механизма ДНК. Активация G1/S-Cdk также способствует экспрессии и активации комплексов S-Cdk, которые могут играть роль в активации начала репликации в зависимости от вида и типа клеток. Контроль над этими Cdk варьируется в зависимости от типа клеток и стадии развития. Эту регуляцию лучше всего понять у почкующихся дрожжей , где S-циклины Clb5 и Clb6 в первую очередь ответственны за репликацию ДНК. [33] Комплексы Clb5,6-Cdk1 непосредственно запускают активацию начала репликации и, следовательно, необходимы на протяжении S-фазы для прямой активации каждого начала репликации. [32]
Аналогичным образом Cdc7 также необходим в фазе S для активации начала репликации. Cdc7 не активен на протяжении всего клеточного цикла, и его активация строго рассчитана во избежание преждевременного начала репликации ДНК. В конце G1 активность Cdc7 резко возрастает в результате ассоциации с регуляторной субъединицей DBF4 , которая напрямую связывает Cdc7 и способствует его протеинкиназной активности. Было обнаружено, что Cdc7 является лимитирующим регулятором активности происхождения. Вместе G1/S-Cdks и/или S-Cdks и Cdc7 взаимодействуют, напрямую активируя точки начала репликации, что приводит к инициации синтеза ДНК. [32]
На ранней S-фазе активация S-Cdk и Cdc7 приводит к сборке преинициативного комплекса, массивного белкового комплекса, образующегося в начале. Образование преинициативного комплекса вытесняет Cdc6 и Cdt1 из исходного репликационного комплекса, инактивируя и разбирая пререпликационный комплекс. Загрузка преинициативного комплекса в ориджин активирует хеликазу Mcm, вызывая раскручивание спирали ДНК. Преинициативный комплекс также загружает в ДНК α-примазу и другие ДНК-полимеразы. [32]
После того, как α-примаза синтезирует первые праймеры, соединения праймер-матрица взаимодействуют с загрузчиком зажима, который загружает скользящий зажим на ДНК, чтобы начать синтез ДНК. Компоненты преинициативного комплекса остаются связанными с репликационными вилками по мере их удаления от источника. [32]
ДНК-полимераза обладает 5’–3’-активностью. Все известные системы репликации ДНК требуют свободной 3'- гидроксильной группы, прежде чем можно будет начать синтез (примечание: матрица ДНК считывается в направлении от 3' к 5', тогда как новая цепь синтезируется в направлении от 5' к 3' - это часто смущенный). Выделяют четыре различных механизма синтеза ДНК:
Клеточные организмы используют первый из этих путей, поскольку он наиболее известен. В этом механизме, как только две цепи разделены, примаза добавляет праймеры РНК к нитям матрицы. Ведущая цепь получает один праймер РНК, а отстающая цепь — несколько. Ведущая цепь непрерывно удлиняется от праймера с помощью ДНК-полимеразы с высокой процессивностью , тогда как отстающая цепь удлиняется прерывисто от каждого праймера, образуя фрагменты Оказаки . РНКаза удаляет фрагменты РНК праймера, и для заполнения пробелов входит ДНК-полимераза с низкой процессивностью, отличная от репликативной полимеразы. Когда это будет завершено, можно будет обнаружить одну зазубрину на ведущей нити и несколько зазубрин на отстающей нити. Лигаза заполняет эти разрывы, завершая таким образом новую реплицированную молекулу ДНК.
Примаза, используемая в этом процессе, существенно различается у бактерий и архей / эукариот . Бактерии используют примазу, принадлежащую к суперсемейству белков DnaG , которая содержит каталитический домен типа складки TOPRIM. [34] Складка TOPRIM содержит ядро α/β с четырьмя консервативными нитями в топологии, подобной Россману . Эта структура также обнаружена в каталитических доменах топоизомеразы Ia, топоизомеразы II, нуклеаз OLD-семейства и белков репарации ДНК, родственных белку RecR.
Примаза, используемая архей и эукариотами, напротив, содержит высокоразвитую версию мотива распознавания РНК (RRM). Эта примаза структурно сходна со многими вирусными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, обратными транскриптазами, циклазами, генерирующими циклические нуклеотиды, и ДНК-полимеразами семейств A/B/Y, которые участвуют в репликации и репарации ДНК. При репликации эукариот примаза образует комплекс с Pol α. [35]
Множественные ДНК-полимеразы играют разные роли в процессе репликации ДНК. В E. coli ДНК Pol III является ферментом полимеразой, главным образом ответственным за репликацию ДНК. Он собирается в репликационный комплекс на репликационной вилке, который демонстрирует чрезвычайно высокую процессивность и остается неизменным на протяжении всего цикла репликации. Напротив, DNA Pol I является ферментом, ответственным за замену праймеров РНК на ДНК. ДНК Pol I обладает экзонуклеазной активностью от 5' до 3' в дополнение к своей полимеразной активности и использует свою экзонуклеазную активность для разрушения праймеров РНК перед ней, поскольку она удлиняет цепь ДНК позади нее в процессе, называемом трансляцией ника . Pol I гораздо менее процессивен, чем Pol III, поскольку его основная функция при репликации ДНК заключается в создании множества коротких участков ДНК, а не нескольких очень длинных участков.
У эукариот фермент с низкой процессивностью Pol α помогает инициировать репликацию, поскольку он образует комплекс с примазой. [36] Считается, что у эукариот синтез ведущей цепи осуществляется Pol ε; однако эта точка зрения недавно была оспорена, предполагая роль Pol δ. [37] Удаление праймера завершается Pol δ [38] , а репарация ДНК во время репликации завершается Pol ε.
По мере продолжения синтеза ДНК исходные нити ДНК продолжают раскручиваться с каждой стороны пузыря, образуя репликационную вилку с двумя зубцами. У бактерий, которые имеют единственный источник репликации на кольцевой хромосоме, этот процесс создает « тета-структуру » (напоминающую греческую букву тета: θ). Напротив, эукариоты имеют более длинные линейные хромосомы и инициируют репликацию в нескольких источниках внутри них. [39]
Репликационная вилка — это структура, которая образуется внутри длинной спирали ДНК во время репликации ДНК. Его производят ферменты, называемые хеликазами, которые разрывают водородные связи, удерживающие цепи ДНК вместе в спирали. Полученная структура имеет два ветвящихся «зубца», каждый из которых состоит из одной цепи ДНК. Эти две цепи служат матрицей для ведущей и отстающей цепей, которые будут создаваться, когда ДНК-полимераза сопоставляет комплементарные нуклеотиды с матрицами; шаблоны можно правильно назвать шаблоном ведущей цепи и шаблоном отстающей цепи.
ДНК считывается ДНК-полимеразой в направлении от 3’ к 5’, что означает, что новая цепь синтезируется в направлении от 5’ к 3’. Поскольку матрицы ведущей и отстающей цепей в репликационной вилке ориентированы в противоположных направлениях, основной вопрос заключается в том, как добиться синтеза новой отстающей цепи ДНК, направление синтеза которой противоположно направлению растущей репликационной вилки.
Ведущая цепь — это цепь новой ДНК, которая синтезируется в том же направлении, что и растущая репликационная вилка. Этот вид репликации ДНК является непрерывным.
Отстающая цепь — это цепь новой ДНК, направление синтеза которой противоположно направлению растущей репликационной вилки. Из-за своей ориентации репликация отстающей цепи более сложна по сравнению с репликацией ведущей цепи. Как следствие, ДНК-полимераза на этой цепи «отстает» от другой цепи.
Отстающая цепь синтезируется короткими отдельными сегментами. На матрице отстающей цепи примаза «читает» ДНК-матрицу и инициирует синтез короткого комплементарного праймера РНК . ДНК-полимераза удлиняет загрунтованные сегменты, образуя фрагменты Оказаки . Затем праймеры РНК удаляются и заменяются ДНК, а фрагменты ДНК соединяются ДНК-лигазой .
Во всех случаях геликаза состоит из шести полипептидов, которые охватывают только одну цепь реплицируемой ДНК. Две полимеразы связаны с гексимером геликазы. У эукариот геликаза обвивает ведущую цепь, а у прокариот – отстающую. [40]
Когда хеликаза раскручивает ДНК в репликационной вилке, ДНК, находящаяся впереди, вынуждена вращаться. Этот процесс приводит к накоплению искривлений в ДНК впереди. [41] Это накопление создает скручивающую нагрузку, которая в конечном итоге остановит репликационную вилку. Топоизомеразы — это ферменты, которые временно разрывают нити ДНК, снимая напряжение, вызванное раскручиванием двух нитей спирали ДНК; топоизомеразы (включая ДНК-гиразу ) достигают этого путем добавления отрицательных суперспиралей к спирали ДНК. [42]
Голая одноцепочечная ДНК имеет тенденцию сворачиваться, образуя вторичные структуры ; эти структуры могут мешать движению ДНК-полимеразы. Чтобы предотвратить это, однонитевые связывающие белки связываются с ДНК до тех пор, пока не будет синтезирована вторая цепь, предотвращая образование вторичной структуры. [43]
Двухцепочечная ДНК намотана вокруг гистонов , которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов, поэтому реплицируемая ДНК должна быть намотана вокруг гистонов в тех же местах, что и исходная ДНК. [44] Чтобы обеспечить это, гистоновые шапероны разбирают хроматин перед его репликацией и заменяют гистоны в нужном месте. Некоторые шаги в этой сборке носят несколько умозрительный характер. [45]
Белки-зажимы действуют как скользящий зажим на ДНК, позволяя ДНК-полимеразе связываться с ее матрицей и способствуя процессивности. Внутренняя поверхность зажима позволяет пропустить через него ДНК. Как только полимераза достигает конца матрицы или обнаруживает двухцепочечную ДНК, скользящий зажим претерпевает конформационные изменения, которые высвобождают ДНК-полимеразу. Белки, загружающие зажим, используются для начальной загрузки зажима, распознавая соединение между матрицей и праймерами РНК. [9] :274-5
В репликационной вилке многие ферменты репликации собираются на ДНК в сложную молекулярную машину, называемую реплисомой . Ниже приводится список основных ферментов репликации ДНК, которые участвуют в реплисоме: [46]
Эксперименты на одной молекуле in vitro (с использованием оптического пинцета и магнитного пинцета ) обнаружили синергетические взаимодействия между ферментами реплисомы ( геликаза , полимераза и одноцепочечный ДНК-связывающий белок ) и с вилкой репликации ДНК, усиливающими раскручивание ДНК и репликацию ДНК. . [14] Эти результаты приводят к разработке кинетических моделей, учитывающих синергетические взаимодействия и их стабильность. [14]
Механизмы репликации состоят из факторов, участвующих в репликации ДНК и появляющихся на матрицах оцДНК. Механизмы репликации включают примозоторы — ферменты репликации; ДНК-полимераза, ДНК-хеликазы, ДНК-зажимы и ДНК-топоизомеразы, а также белки репликации; например, одноцепочечные ДНК-связывающие белки (SSB). В механизмах репликации эти компоненты координируются. У большинства бактерий все факторы, участвующие в репликации ДНК, расположены на репликационных вилках, и комплексы остаются на вилках во время репликации ДНК. Механизмы репликации также называются реплисомами или системами репликации ДНК. Эти термины являются общими терминами для белков, расположенных на репликационных вилках. В эукариотических и некоторых бактериальных клетках реплисомы не образуются.
Поскольку механизмы репликации не перемещаются относительно матричных ДНК, таких как фабрики, их называют фабрикой репликации . [48] На альтернативном рисунке фабрики ДНК подобны проекторам, а ДНК подобны кинематографическим фильмам, постоянно проходящим через проекторы. В модели фабрики репликации после того, как ДНК-хеликазы для ведущих и отстающих цепей загружаются в матричную ДНК, хеликазы перемещаются вдоль ДНК друг в друга. Хеликазы остаются связанными до конца процесса репликации. Питер Мейстер и др. наблюдали сайты прямой репликации у почкующихся дрожжей путем мониторинга ДНК-полимераз α, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP). Они обнаружили репликацию ДНК пар меченых локусов, расположенных симметрично от начала репликации, и обнаружили, что расстояние между парами заметно уменьшается со временем. [49] Это открытие предполагает, что механизм репликации ДНК связан с фабриками ДНК. То есть пары фабрик репликации загружаются в источники репликации и фабрики, связанные друг с другом. Кроме того, матричные ДНК перемещаются на фабрики, где происходит экструзия матричных оцДНК и новых ДНК. Открытие Мейстера является первым прямым доказательством существования модели фабрики репликации. Последующие исследования показали, что ДНК-хеликазы образуют димеры во многих эукариотических клетках, а механизмы репликации бактерий остаются в одном внутриядерном месте во время синтеза ДНК. [48]
Фабрики репликации распутывают сестринские хроматиды. Распутывание необходимо для распределения хроматид по дочерним клеткам после репликации ДНК. Поскольку сестринские хроматиды после репликации ДНК удерживают друг друга кольцами когезина , существует единственный шанс на распутывание при репликации ДНК. Установка механизмов репликации в качестве фабрик репликации может повысить вероятность успеха репликации ДНК. Если репликационные вилки свободно перемещаются в хромосомах, сцепление ядер усугубляется и препятствует митотической сегрегации. [49]
Эукариоты инициируют репликацию ДНК во многих точках хромосомы, поэтому репликационные вилки встречаются и заканчиваются во многих точках хромосомы. Поскольку эукариоты имеют линейные хромосомы, репликация ДНК не может достичь самого конца хромосом. Из-за этой проблемы ДНК теряется в каждом цикле репликации с конца хромосомы. Теломеры — это участки повторяющейся ДНК, расположенные вблизи концов, и помогают предотвратить потерю генов из-за этого укорочения. Укорочение теломер — нормальный процесс в соматических клетках . Это укорачивает теломеры дочерней хромосомы ДНК. В результате клетки могут делиться только определенное количество раз, прежде чем потеря ДНК предотвратит дальнейшее деление. (Это известно как предел Хейфлика .) Внутри линии зародышевых клеток , которая передает ДНК следующему поколению, теломераза удлиняет повторяющиеся последовательности теломерной области, чтобы предотвратить деградацию. Теломераза может ошибочно активироваться в соматических клетках, что иногда приводит к образованию рака . Повышенная теломеразная активность является одним из признаков рака.
Для завершения требуется, чтобы ход репликационной вилки ДНК был остановлен или заблокирован. Терминация в определенном локусе, когда она происходит, включает взаимодействие между двумя компонентами: (1) последовательностью сайта терминации в ДНК и (2) белком, который связывается с этой последовательностью, чтобы физически остановить репликацию ДНК. У различных видов бактерий он называется белком, связывающим сайт терминального конца репликации ДНК, или белком Ter .
Поскольку бактерии имеют кольцевые хромосомы, прекращение репликации происходит, когда две репликационные вилки встречаются на противоположном конце родительской хромосомы. E. coli регулирует этот процесс с помощью терминирующих последовательностей, которые при связывании с белком Tus позволяют проходить только одному направлению репликационной вилки. В результате репликационные вилки вынуждены всегда встречаться в области терминации хромосомы. [50]
У эукариот репликация ДНК контролируется в рамках клеточного цикла . По мере того как клетка растет и делится, она проходит этапы клеточного цикла; Репликация ДНК происходит во время S-фазы (фазы синтеза). Прогресс эукариотической клетки в цикле контролируется контрольными точками клеточного цикла . Прохождение контрольных точек контролируется посредством сложных взаимодействий между различными белками, включая циклины и циклин-зависимые киназы . [51] В отличие от бактерий, эукариотическая ДНК реплицируется в пределах ядра. [52]
Контрольная точка G1/S (или контрольная точка рестрикции) регулирует, вступают ли эукариотические клетки в процесс репликации ДНК и последующего деления. Клетки, не прошедшие эту контрольную точку, остаются на стадии G0 и не реплицируют свою ДНК.
После того, как ДНК прошла тест «G1/S», ее можно скопировать только один раз в каждом клеточном цикле. Когда комплекс Mcm удаляется от источника, пререпликационный комплекс демонтируется. Поскольку новый комплекс Mcm не может быть загружен в точку начала репликации до тех пор, пока субъединицы до репликации не будут повторно активированы, одна точка начала репликации не может использоваться дважды в одном и том же клеточном цикле. [32]
Активация S-Cdks на ранней S-фазе способствует разрушению или ингибированию отдельных компонентов пререпликационного комплекса, предотвращая немедленную повторную сборку. S и M-Cdks продолжают блокировать сборку пререпликационного комплекса даже после завершения фазы S, гарантируя, что сборка не может произойти снова, пока вся активность Cdk не снизится в позднем митозе. [32]
У почкующихся дрожжей ингибирование сборки вызвано Cdk-зависимым фосфорилированием компонентов пререпликационного комплекса. В начале S-фазы фосфорилирование Cdc6 с помощью Cdk1 вызывает связывание Cdc6 с убиквитинпротеинлигазой SCF , что вызывает протеолитическое разрушение Cdc6. Cdk-зависимое фосфорилирование белков Mcm способствует их экспорту из ядра вместе с Cdt1 во время S-фазы, предотвращая загрузку новых комплексов Mcm в источниках в течение одного клеточного цикла. Фосфорилирование Cdk репликативного комплекса также ингибирует сборку пререпликационного комплекса. Индивидуального присутствия любого из этих трех механизмов достаточно, чтобы ингибировать сборку пререпликационного комплекса. Однако мутации всех трех белков в одной и той же клетке вызывают повторную инициацию репликации во многих источниках в пределах одного клеточного цикла. [32] [53]
В клетках животных белок геминин является ключевым ингибитором сборки пререпликационного комплекса. Геминин связывает Cdt1, предотвращая его связывание с комплексом распознавания источника. В G1 уровни геминина поддерживаются на низком уровне с помощью APC, который убиквитинирует геминин, направляя его на деградацию. Когда геминин разрушается, Cdt1 высвобождается, что позволяет ему функционировать в сборке предрепликационного комплекса. В конце G1 APC инактивируется, позволяя геминину накапливаться и связываться с Cdt1. [32]
Репликация хлоропластного и митохондриального геномов происходит независимо от клеточного цикла посредством процесса репликации D-петли .
В клетках позвоночных сайты репликации концентрируются в положениях, называемых фокусами репликации . [49] Сайты репликации могут быть обнаружены путем иммуноокрашивания дочерних цепей и ферментов репликации, а также мониторинга факторов репликации, меченных GFP. С помощью этих методов обнаружено, что в S-фазе деления клеток появляются очаги репликации разного размера и положения, и их количество на ядро намного меньше числа репликационных вилок генома.
П. Хойн и др. , [49] (2001) отслеживали фокусы репликации, меченные GFP, в почкующихся дрожжевых клетках и обнаружили, что точки начала репликации постоянно перемещаются в фазе G1 и S, а динамика значительно снижается в фазе S. [49] Традиционно сайты репликации фиксировались на пространственной структуре хромосом с помощью ядерного матрикса или ламинов . Результаты Хойна опровергают традиционные концепции о том, что у почкующихся дрожжей нет ламинов, и подтверждают, что точки начала репликации самособираются и образуют фокусы репликации.
Путем активации источников репликации, контролируемых в пространстве и времени, регулируется образование фокусов репликации. DA Jackson и др. (1998) обнаружили, что соседние источники активируются одновременно в клетках млекопитающих. [49] Пространственное сопоставление сайтов репликации приводит к кластеризации вилок репликации. Кластеризация спасает остановившиеся вилки репликации и способствует нормальному развитию вилок репликации. Развитие репликационных вилок тормозится многими факторами; столкновение с белками или с комплексами, прочно связывающимися с ДНК, дефицит dNTP, разрывы на матричных ДНК и так далее. Если вилки репликации застревают, а остальные последовательности из застрявших вилок не копируются, то дочерние цепи получают нереплицированные сайты. Нереплицированные сайты на одной родительской цепи удерживают вместе другую цепь, но не дочерние цепи. Следовательно, образующиеся сестринские хроматиды не могут отделиться друг от друга и не могут делиться на 2 дочерние клетки. Когда срабатывают соседние источники и вилка из одного источника останавливается, вилка из другого источника получает доступ в направлении, противоположном застопорившейся вилке, и дублирует нереплицированные сайты. В качестве другого механизма спасения существует применение спящих источников репликации , чтобы лишние источники репликации не активировались при нормальной репликации ДНК.
Большинство бактерий не проходят четко определенного клеточного цикла, а вместо этого постоянно копируют свою ДНК; во время быстрого роста это может привести к одновременному выполнению нескольких раундов репликации. [54] У E. coli , наиболее изученных бактерий, репликация ДНК регулируется с помощью нескольких механизмов, в том числе: гемиметилирования и секвестрации исходной последовательности, соотношения аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ) и уровень белка ДНКА. Все это контролирует связывание белков-инициаторов с исходными последовательностями. [55]
Поскольку E. coli метилирует последовательности ДНК GATC, синтез ДНК приводит к полуметилированным последовательностям. Эта полуметилированная ДНК распознается белком SeqA , который связывает и изолирует исходную последовательность; кроме того, ДНКА (необходимая для инициации репликации) хуже связывается с гемиметилированной ДНК. В результате вновь реплицированные источники не могут немедленно инициировать следующий раунд репликации ДНК. [56]
АТФ накапливается, когда клетка находится в богатой среде, запуская репликацию ДНК, как только клетка достигает определенного размера. АТФ конкурирует с АДФ за связывание с ДНКА, а комплекс ДНКА-АТФ способен инициировать репликацию. Определенное количество белков DnaA также требуется для репликации ДНК — каждый раз, когда копируется источник, количество сайтов связывания для DnaA удваивается, что требует синтеза большего количества DnaA, чтобы обеспечить новую инициацию репликации.
У быстрорастущих бактерий, таких как E. coli , репликация хромосом занимает больше времени, чем деление клетки. Бактерии решают эту проблему, инициируя новый раунд репликации до того, как предыдущий будет завершен. [57] Новый раунд репликации сформирует хромосому клетки, которая рождается через два поколения после делящейся клетки. Этот механизм создает перекрывающиеся циклы репликации.
Существует множество событий, которые способствуют репликационному стрессу, в том числе: [58]
Исследователи обычно реплицируют ДНК in vitro , используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР использует пару праймеров для охвата целевой области матричной ДНК, а затем полимеризует партнерские цепи в каждом направлении от этих праймеров с помощью термостабильной ДНК-полимеразы . Повторение этого процесса в течение нескольких циклов усиливает целевой участок ДНК. В начале каждого цикла смесь матрицы и праймеров нагревается, отделяя вновь синтезированную молекулу и матрицу. Затем, когда смесь остывает, оба они становятся матрицами для отжига новых праймеров, и от них распространяется полимераза. В результате количество копий целевого региона удваивается каждый раунд, увеличиваясь в геометрической прогрессии . [59]
