Оценка скорости метаболизма путем измерения выработки тепла
Респирометрия — это общий термин, который охватывает ряд методов получения оценок скорости метаболизма позвоночных , беспозвоночных , растений , тканей, клеток или микроорганизмов посредством косвенного измерения выработки тепла ( калориметрии ) .
Скорость метаболизма у всех животных
Метаболизм животного оценивается путем определения скорости выработки углекислого газа (VCO 2 ) и потребления кислорода (VO 2 ) отдельными животными, либо в замкнутой, либо в открытой системе респирометрии. Обычно получают два показателя: стандартный (SMR) или базальный уровень метаболизма (BMR) и максимальный уровень ( VO2max ). SMR измеряется, когда животное находится в состоянии покоя (но не спит) при определенных лабораторных (температура, гидратация) и специфических для субъекта условиях (например, размер или аллометрия [1] ), возрасте, репродуктивном статусе, постабсорбтивном, чтобы избежать термического эффекта пищи ). [2] VO 2 max обычно определяется во время аэробных упражнений на физиологических пределах или вблизи них. [3] Напротив, полевая скорость метаболизма (FMR) относится к скорости метаболизма необузданного, активного животного в природе. [4] Скорость метаболизма всего животного относится к этим показателям без поправки на массу тела. Если значения SMR или BMR делятся на значение массы тела животного, то скорость называется удельной массой. Это та величина удельной массой, которую обычно слышишь при сравнении видов. [5]
Закрытая респирометрия
Респирометрия основана на принципе «то, что входит, должно выходить». [6] Сначала рассмотрим закрытую систему. Представьте, что мы помещаем мышь в герметичный контейнер. Воздух, запечатанный в контейнере, изначально содержит тот же состав и пропорции газов, которые присутствовали в комнате: 20,95% O 2 , 0,04% CO 2 , водяной пар (точное количество зависит от температуры воздуха, см. точку росы ), 78% (приблизительно) N 2 , 0,93% аргона и различные следовые газы, составляющие остальное (см. атмосферу Земли ). С течением времени мышь в камере производит CO 2 и водяной пар, но извлекает O 2 из воздуха пропорционально своим метаболическим потребностям. Следовательно, пока мы знаем объем системы, разница между концентрациями O 2 и CO 2 в начале, когда мы запечатали мышь в камере (базовые или референтные условия), по сравнению с количествами, присутствующими после того, как мышь вдохнула воздух в более позднее время, должна быть количеством CO 2 /O 2, произведенным/потребленным мышью . Азот и аргон являются инертными газами, и поэтому их фракционные количества не изменяются при дыхании мыши. В закрытой системе окружающая среда в конечном итоге станет гипоксической .
Открытая респирометрия
Для открытой системы ограничения конструкции включают характеристики промывки камеры для животных и чувствительность газоанализаторов. [7] [8] Однако основной принцип остается тем же: то, что входит, должно выходить. Основное различие между открытой и закрытой системой заключается в том, что открытая система пропускает воздух через камеру (т. е. воздух проталкивается или вытягивается насосом) со скоростью, которая постоянно пополняет O 2 , истощенный животным, удаляя CO 2 и водяной пар, производимый животным. Объемная скорость потока должна быть достаточно высокой, чтобы гарантировать, что животное никогда не потребляет весь кислород, присутствующий в камере, и в то же время скорость должна быть достаточно низкой, чтобы животное потребляло достаточно O 2 для обнаружения. Для мыши весом 20 г скорость потока около 200 мл/мин через контейнеры объемом 500 мл обеспечит хороший баланс. При этой скорости потока около 40 мл O 2 поступает в камеру, и весь объем воздуха в камере заменяется в течение 5 минут. Для других меньших животных объемы камер могут быть намного меньше, а скорости потока также будут скорректированы. Обратите внимание, что для теплокровных или эндотермических животных ( птиц и млекопитающих ) размеры камер и/или скорости потока будут выбираться с учетом их более высоких скоростей метаболизма.
Расчеты
Расчет скоростей VO2 и /или VCO2 требует знания скоростей потоков в камеру и из нее, а также фракционных концентраций газовых смесей в камеру и из нее. В общем, скорости метаболизма рассчитываются из стационарных условий (т. е. предполагается, что скорость метаболизма животного постоянна [9] [10] ). Чтобы узнать скорости потребления кислорода , необходимо знать местоположение расходомера относительно камеры для животных (если он расположен перед камерой, расходомер находится «выше по течению», если он расположен после камеры, расходомер находится «ниже по течению»), а также присутствуют ли реактивные газы (например, CO2 , вода , метан , см. инертный газ ).
Для открытой системы с расходомером на входе, водой (например, безводным сульфатом кальция ) и CO2 , удаленными до анализатора кислорода , подходящим уравнением является
Для открытой системы с расходомером ниже по потоку, водой и CO2 , удаленными до анализатора кислорода , подходящим уравнением является
где
- FR — объемный расход, приведенный к STP (см. Стандартные условия для температуры и давления )
- F в O 2 — это доля кислорода, присутствующего в текущем потоке воздуха (базовый уровень или эталон), и
- F ex O 2 — это доля кислорода, присутствующего в исходящем потоке воздуха (которую животное потребило относительно исходного уровня за единицу времени).
Например, значения BMR для мыши весом 20 г ( Mus musculus ) могут быть FR = 200 мл/мин, а показания фракционной концентрации O 2 от анализатора кислорода составляют F in O 2 = 0,2095, F ex O 2 = 0,2072. Расчетная скорость потребления кислорода составляет 0,58 мл/мин или 35 мл/час. Предполагая, что энтальпия сгорания O 2 составляет 20,1 джоуля на миллилитр, мы затем рассчитаем теплопродукцию (и, следовательно, метаболизм) для мыши как 703,5 Дж/ч.
Оборудование для респирометрии
Для системы открытого потока список оборудования и деталей длинный по сравнению с компонентами закрытой системы, но главное преимущество открытой системы в том, что она позволяет вести непрерывную регистрацию скорости метаболизма. Риск гипоксии также намного меньше в открытой системе.
Насосы для потока воздуха
- Вакуумный насос : насос необходим для нагнетания (т. е. расположения выше по потоку) или втягивания (т. е. расположения ниже по потоку) воздуха в камеру для животных и через проточную систему респирометрии.
- Насос для отбора проб: для прокачки воздуха через анализаторы используется небольшой, стабильный и надежный насос.
Расходомеры и регуляторы расхода
- Расходомеры пузырьков: простой, но очень точный способ измерения расхода заключается в измерении времени перемещения пузырьков мыльной пленки вверх по стеклянным трубкам между отметками известного объема. [11] Стеклянная трубка подключается снизу (для систем проталкивания) или сверху (для систем вытягивания) к воздушному потоку. Небольшая резиновая пипетка, прикрепленная к основанию трубки, действует как резервуар и система доставки мыльных пузырей. Эксплуатация проста. Сначала намочите стеклянную поверхность вдоль пути движения пузырьков (например, нажмите на грушу так, чтобы обильное количество мыла было вытолкнуто вверх по стеклу потоком воздуха), чтобы обеспечить практически свободную от трения поверхность. Во-вторых, сожмите грушу так, чтобы получился один чистый пузырек. С секундомером в руке запишите время, необходимое для перемещения пузырька между отметками на стекле. Обратите внимание на объем, записанный на верхней отметке (например, 125 = 125 мл), разделите объем на время, необходимое для перемещения между отметками, и результат будет скоростью потока (мл/с). Эти инструменты можно приобрести у различных поставщиков, но их также можно изготовить из стеклянных мерных пипеток соответствующего размера .
- Акриловые расходомеры: в некоторых случаях высоких скоростей потока мы можем использовать простые акриловые расходомеры (0–2,5 л/мин) для контроля скоростей потока через метаболические камеры. Расходомеры расположены выше по потоку от метаболических камер. Расходомеры просты в использовании, но их следует калибровать дважды в день для использования в системе респирометрии: один раз перед началом записи (но после того, как животное будет запечатано внутри камеры!!) и еще раз в конце записи (до того, как животное будет извлечено из камеры). Калибровка должна выполняться с помощью пузырькового расходомера, поскольку калибровочные отметки на акриловых счетчиках являются лишь приблизительными. Для правильной калибровки скоростей потока помните, что должны быть зарегистрированы как барометрическое давление, так и температура воздуха, проходящего через расходомер (которую мы предполагаем равной комнатной температуре).
- Расходомеры массы : уравнения, необходимые для расчета скорости потребления кислорода или производства углекислого газа, предполагают, что скорости потока в камеры и из них точно известны. Мы используем расходомеры массы, которые имеют преимущество в том, что дают скорость потока независимо от температуры и давления воздуха. Поэтому эти скорости потока можно считать скорректированными до стандартных условий (стандартная температура и давление). Мы измеряем и контролируем поток только в одном месте — ниже по течению от камеры. Поэтому мы должны предположить, что скорости притока и оттока идентичны. Однако во время построения системы респирометрии скорость потока должна измеряться на всех этапах, через все соединения, чтобы проверить целостность потока.
- Игольчатые клапаны : массовые расходомеры можно приобрести с контроллерами массового расхода , которые позволяют устанавливать скорость потока. Однако они дороги. Исследования респирометрии часто пытаются измерять более одного животного одновременно, что потребует одной камеры на животное и, таким образом, контролируемого потока через каждую камеру. Альтернативный и более экономичный метод управления потоком — использование игольчатых клапанов из нержавеющей или углеродистой стали. Игольчатые клапаны плюс массовые расходомеры обеспечивают экономичный способ достижения желаемой скорости потока. Клапаны стоят около 20 долларов.
Трубки и камеры
- Трубки и соединения: Для соединения компонентов системы респирометрии с камерой для животных и обратно можно использовать различные виды трубок. Могут использоваться различные виды гибких трубок в зависимости от характеристик системы. Ацетиловые, Bev-A-Line, Kynar, нейлоновые, Tygon трубки и соединители можно использовать в областях системы, где окислительная атмосфера низкая (например, только фоновый уровень озона); Тефлоновые трубки рекомендуется использовать, если ожидается присутствие значительных количеств озона, поскольку они инертны к озону. Тефлоновые трубки более дорогие и не обладают гибкостью.
- Метаболические камеры: Камеры могут быть стеклянными банками с резиновыми пробками вместо крышек; цилиндрами шприцов для мелких животных и насекомых; или изготовлены из оргстекла . В идеале камеры должны быть изготовлены из инертных материалов; например, акриловые пластмассы могут поглощать O 2 и могут быть плохим выбором для респирометрии с очень мелкими насекомыми. [12] Камеры должны быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечить быстрое смешивание газов внутри камеры. Простейшей метаболической камерой для небольшого позвоночного может быть стеклянная банка с пробкой. Пробки снабжены двумя портами: короткие удлинители тефлоновой трубки предусмотрены для линейных соединений. Удлинители тефлоновой трубки проталкиваются через переборку, и линейное соединение завершается путем прикрепления небольшого хомута для шланга к основанию удлинителя тефлоновой трубки. Кроме того, должно быть предусмотрено расширение для входного отверстия внутри банки — это гарантирует, что выдыхаемые животным газы не будут вымыты входящим потоком. Животное запечатано внутри, а резиновая пробка удерживается на месте с помощью липких ремней. Если используется система с восходящим потоком, любая утечка метаболической камеры приведет к потере воздуха животным и, следовательно, к недооценке скорости метаболизма животного. Когда вы закрываете животное внутри метаболической камеры, необходимо обратить внимание на уплотнение. Чтобы обеспечить герметичность, перед тем как закрыть крышку, плотно вставьте пробку в банку и убедитесь, что она ровная. Используйте 1–2 ремня (лучше 2) и плотно затяните. Акриловые (плексигласовые) камеры будут сконструированы для некоторых целей, но для обеспечения надлежащей посадки потребуется точная инженерия; прокладки помогут, а разумное использование плотно прилегающих зажимов сведет к минимуму утечки.
- Очистительные трубки: вода до и после камеры для животных должна быть удалена. В одном из вариантов будет использоваться большая акриловая колонна Drierite (8 ячеек (шкала) , т. е. относительно грубая) выше по течению (перед нагнетательным насосом, перед камерой для животных) для осушения входящего воздушного потока и несколько трубок с более мелкой сеткой (10–20, т. е. относительно мелкая) Drierite для удаления воды после камеры для животных. Чтобы подготовить очистительную трубку, убедитесь, что на обоих концах трубки есть небольшое количество ваты, чтобы предотвратить попадание частиц пыли в анализаторы. Используйте небольшое количество ваты, скажем, около 0,005 г, как раз достаточно, чтобы не допустить попадания пыли в трубку. Большое количество хлопка будет блокировать поток воздуха, когда/если она станет влажной. Насыпьте Drierite в трубку с помощью воронки, постучите трубкой по столу, чтобы плотно уплотнить зерна (чтобы увеличить площадь поверхности — воздух + вода проносятся через рыхлый Drierite, требуя частой смены скрубберов), и закройте небольшим количеством ваты. Для удаления углекислого газа] до и после камеры для животных используется аскарит II (аскарит II является зарегистрированной торговой маркой Arthur H. Thomas Co.). Аскарит II содержит NaOH, который является едким (поэтому не допускайте попадания на кожу и держитесь подальше от воды). Промывочная трубка подготавливается путем помещения небольшого количества ваты в конец трубки, заполнения одной трети 10–20 меш Дриеритом, добавления небольшого количества ваты, затем дополнительной трети трубки с аскаритом II, еще одним слоем ваты, затем еще одним Дриеритом и закрытия трубки еще одним небольшим количеством ваты. Постукивайте трубкой по столу по мере добавления каждого слоя, чтобы уплотнить зерна. Примечание: Дриерит можно использовать снова и снова (после нагревания в духовке), хотя указание Дриерита потеряет цвет при повторной сушке; аскарит II используется один раз и будет считаться опасными отходами .
Анализаторы
- Анализатор углекислого газа : Анализаторы CO 2 обычно используют инфракрасные методы обнаружения, чтобы воспользоваться тем фактом, что CO 2 поглощает инфракрасный свет и повторно излучает свет на немного более длинных волнах. Панельный измеритель на анализаторе отображает весь диапазон 0,01–10% CO 2 , а выходное напряжение, пропорциональное концентрации CO 2 , также генерируется для записи данных.
- Анализатор кислорода : Анализаторы кислорода, подходящие для респирометрии, используют различные датчики кислорода , включая гальванические («температура окружающей среды»), парамагнитные , полярографические ( электроды типа Кларка ) и циркониевые («высокотемпературные») датчики. Гальванические анализаторы O 2 используют топливный элемент , содержащий кислотный электролит , анод из тяжелого металла и тонкую газопроницаемую мембрану. Поскольку парциальное давление O 2 вблизи анода равно нулю, O 2 перемещается путем диффузии к аноду через мембрану со скоростью, пропорциональной парциальному давлению O 2 окружающей среды . Топливный элемент вырабатывает напряжение, линейно пропорциональное парциальному давлению O 2 на мембране. Пока температура шкафа стабильна, и при условии, что поток воздуха через топливный элемент стабилен и находится в пределах диапазона, отклик будет составлять 0,01% или лучше в зависимости от поддерживающей электроники, программного обеспечения и других соображений.
Наконец, типичным дополнением к системе будет компьютерная система сбора и управления данными. Вместо самописца непрерывные записи потребления кислорода и/или производства углекислого газа производятся с помощью аналого-цифрового преобразователя, соединенного с компьютером. Программное обеспечение захватывает, фильтрует, преобразует и отображает сигнал в соответствии с потребностями экспериментатора. Различные компании и лица обслуживают сообщество респирометров (например, Sable Systems , Qubit Systems, см. также Warthog Systems).
Скорость метаболизма митохондрий
Внутри организма кислород доставляется в клетки, а в клетках — в митохондрии , где он потребляется в процессе генерации большей части энергии, необходимой организму. Митохондриальная респирометрия измеряет потребление кислорода митохондриями без вовлечения всего живого животного и является основным инструментом для изучения функции митохондрий. [13] Таким респирометрическим исследованиям могут подвергаться три различных типа образцов: изолированные митохондрии (из клеточных культур, животных или растений); пермеабилизированные клетки (из клеточных культур); и пермеабилизированные волокна или ткани (из животных). В последних двух случаях клеточная мембрана становится проницаемой путем добавления химических веществ, выборочно оставляя митохондриальную мембрану нетронутой. Таким образом, химические вещества, которые обычно не могут проникнуть через клеточную мембрану, могут напрямую влиять на митохондрии. Благодаря пермеабилизации клеточной мембраны клетка перестает существовать как живой, определенный организм, оставляя только митохондрии в качестве все еще функциональных структур. В отличие от респирометрии целых животных, митохондриальная респирометрия происходит в растворе, т.е. образец взвешен в среде. Сегодня митохондриальная респирометрия в основном выполняется с использованием подхода закрытой камеры.
Система с закрытой камерой
Образец, взвешенный в подходящей среде, помещается в герметично закрытую метаболическую камеру. Митохондрии приводятся в определенные «состояния» путем последовательного добавления субстратов или ингибиторов. Поскольку митохондрии потребляют кислород, концентрация кислорода падает. Это изменение концентрации кислорода регистрируется кислородным датчиком в камере. Из скорости снижения кислорода (с учетом поправки на диффузию кислорода) можно вычислить частоту дыхания митохондрий. [13]
Приложения
Фундаментальные исследования
Функционирование митохондрий изучается в области биоэнергетики . [14] Функциональные различия между митохондриями разных видов изучаются с помощью респирометрии как аспекта сравнительной физиологии . [15] [16]
Прикладные исследования
Митохондриальная респирометрия используется для изучения функциональности митохондрий при митохондриальных заболеваниях или заболеваниях с (предположительно) сильной связью с митохондриями, например, сахарный диабет 2 типа , [17] [18] ожирение [19] и рак . [20] Другими областями применения являются, например, спортивная наука и связь между функцией митохондрий и старением . [21]
Оборудование
Обычное оборудование включает в себя герметичную метаболическую камеру, датчик кислорода и устройства для записи данных, перемешивания, термостатирования и способа введения химических веществ в камеру. Как описано выше для респирометрии целых животных выбор материалов очень важен. [13] Пластиковые материалы не подходят для камеры из-за их способности накапливать кислород. Когда пластиковые материалы неизбежны (например, для уплотнительных колец, покрытий мешалок или стопоров), можно использовать полимеры с очень низкой проницаемостью для кислорода (например, ПВДФ в отличие от, например, ПТФЭ ). Остаточную диффузию кислорода в материалы камеры или из них можно контролировать, корректируя измеренные потоки кислорода для инструментального фонового потока кислорода. Весь прибор, включающий упомянутые компоненты, часто называют оксиграфом. Компании, поставляющие оборудование для респирометрии целых животных, упомянутые выше, обычно не занимаются митохондриальной респирометрией. Сообщество обслуживается по самым разным ценам и уровням сложности такими компаниями, как Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences или Strathkelvin Instruments.
Смотрите также
Ссылки
- ^ Уайт, CR и RS Seymour. 2005. Аллометрическое масштабирование метаболизма млекопитающих. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1611–1619.
- ^ Blaxter, K. 1989. Энергетический метаболизм у животных и человека . Cambridge University Press. ISBN 0-521-36931-2
- ^ Weibel, ER и H. Hoppeler. 2005. Максимальная скорость метаболизма, вызванная физическими упражнениями, зависит от аэробной способности мышц. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1635–1644.
- ^ Надь, КА 2005. Скорость метаболизма в полевых условиях и размер тела. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1621–1625.
- ^ Макарьева, AM, Горшков, VG, Ли, BL, Чоун, SL, Райх, PB, и Гаврилов, VM (2008). Средние удельные скорости метаболизма поразительно схожи в основных доменах жизни: доказательства метаболического оптимума жизни. Труды Национальной академии наук 105(44):16994-16999.
- ^ Фраппелль, П.Б., Х.А. Блевин и Р.В. Боденетт. 1989. Понимание камер респирометрии: что входит, должно выходить. Журнал теоретической биологии 138(4):479–494. PMID 2593683
- ^ Withers, PC 2001. Проектирование, калибровка и расчет для систем проточной респирометрии. Australian Journal of Zoology 49:445–461.
- ^ Lighton, JRB 2008. Измерение скорости метаболизма: руководство для ученых. Oxford University Press. ISBN 0-19-531061-6 .
- ^ Бартоломью, GA, Д. Флек и CM Флек. 1981. Мгновенные измерения потребления кислорода во время предполетного разогрева и послеполетного охлаждения у бражников и сатурнийских молей. Журнал экспериментальной биологии 90(1):17–32.
- ^ Пендар, Х. и Соха, Дж. Дж. (2015). Оценка мгновенного газообмена в проточных респирометрических системах: современный пересмотр метода Z-преобразования Бартоломью. PLOS ONE 10(10): e0139508.
- ^ Леви, А. 1964. Точность метода пузырькового расходомера для измерения расхода газа. Журнал научных приборов 41(7):449–453.
- ^ Стивенс, Э.Д. 1992. Использование пластиковых материалов в системах измерения кислорода. Журнал прикладной физиологии 72:801–804
- ^ abc Gnaiger, E. 2008. Полярографические датчики кислорода, оксиграф и респирометрия высокого разрешения для оценки митохондриальной функции. В: Митохондриальная дисфункция при токсичности, вызванной лекарствами (Dykens JA и Will Y., ред.) John Wiley: 327–352. ISBN 978-0-470-11131-4
- ^ Gnaiger E, ed (2007) "Митохондриальные пути и дыхательный контроль". OROBOROS MiPNet Publications, Инсбрук, Электронное 1-е издание, ISBN 978-3-9502399-0-4
- ^ Хильдебрандт, ТМ и Грисхабер, МК, 2008 Три ферментативных активности катализируют окисление сульфида в тиосульфат в митохондриях млекопитающих и беспозвоночных. FEBS J. (275): 3352–3361.
- ^ Nann A. Fangue NA, Richards JG и Schulte1 PM 2009. «Объясняют ли свойства митохондрий внутривидовые различия в термоустойчивости?». Журнал экспериментальной биологии 212:514–522.
- ^ Филикс Э., Шраувен-Хиндерлинг В.Б., Менсинк М., Ленаерс Э., Микс Р., Хукс Дж., Кои М.Э., Мунен-Корнипс Э., Селс Дж.П., Хесселинк М.К., Шраувен П., 2008 Нижний внутренний АДФ- Стимуляция митохондриального дыхания лежит в основе митохондриальной дисфункции in vivo в мышцах мужчин, больных диабетом 2 типа. Диабет 57 (11): 2943–9.
- ^ Knauf C., Cani PD, Ait-Belgnaoui A., Benani A., Dray C., Cabou C., Colom A., Uldry M., Rastrelli S., Sabatier E., Godet N., Waget A., Pénicaud L., Valet P., Burcelin R., 2008. Сигнализация глюкагоноподобного пептида 1 в мозге контролирует начало резистентности к инсулину, вызванной диетой с высоким содержанием жиров, и снижает расход энергии. Эндокринология 149: 4768–4777.
- ^ Хукс Дж., Бриде Дж. Дж., де Фогель Дж., Шаарт Г., Наббен М., Мунен-Корнипс Э., Хесселинк М.К., Шраувен П., 2008. Митохондриальная функция, содержание и выработка АФК в скелетных мышцах крыс: влияние кормление с высоким содержанием жиров. ФЭБС Летт. 582: 510–516.
- ^ Увеличение митохондриального биогенеза, окислительного стресса и гликолиза в мышиных лимфомах Энрике Сампера, Э., Моргадоб, Л., Эстрадаб, Дж. К., Бернадб, А., Хаббарда, А., Сусана Каденас, С. и Мелова С., 2009. Увеличение митохондриального биогенеза, окислительного стресса и гликолиза в мышиных лимфомах. Free Radical Biology and Medicine 46(3): 387–396.
- ^ Hutter E., Unterluggauer H., Garedew A., Jansen-Durr P. и Gnaiger E. 2006 Высокоразрешающая респирометрия – современный инструмент в исследовании старения. Exp. Gerontol. 41:103–109.
Внешние ссылки
- Эко-окружающая среда Технологии
- Технологии АЕИ
- AquaResp – Бесплатное ПО для акватической респирометрии
- Вызов Технологии
- Системы Лолиго
- Инструменты Ороборос
- Системы Кубита
- ЮАР
- Системы Сейбл
- Бионаука о морских коньках
- Инструменты Страткельвина
- Системы «Бородавочник»
- Система респирометрии ECHO