Рекомбинация Cre-Lox — это технология сайт-специфической рекомбиназы , используемая для выполнения делеций , вставок , транслокаций и инверсий в определенных участках ДНК клеток. Она позволяет нацеливать модификацию ДНК на определенный тип клеток или запускать ее определенным внешним стимулом. Она реализуется как в эукариотических, так и в прокариотических системах. Система рекомбинации Cre-lox оказалась особенно полезной для нейробиологов в изучении мозга, в котором сложные типы клеток и нейронные цепи объединяются для генерации познания и поведения. NIH Blueprint for Neuroscience Research создала несколько сотен линий мышей-драйверов Cre, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.
Важным применением системы Cre-lox является удаление селективных маркеров при замене генов. Обычно используемые стратегии замены генов вводят селективные маркеры в геном для облегчения отбора генетических мутаций, которые могут вызывать задержку роста. Однако экспрессия маркеров может иметь полярные эффекты на экспрессию генов выше и ниже по течению. Удаление селективных маркеров из генома с помощью рекомбинации Cre-lox является элегантным и эффективным способом обойти эту проблему и поэтому широко используется в растениях, линиях клеток мышей, дрожжах и т. д. [1]
Система состоит из одного фермента, рекомбиназы Cre , которая рекомбинирует пару коротких целевых последовательностей, называемых последовательностями Lox . Эта система может быть реализована без вставки дополнительных поддерживающих белков или последовательностей. Фермент Cre и исходный сайт Lox , называемый последовательностью LoxP , получены из бактериофага P1 .
Размещение последовательностей Lox соответствующим образом позволяет активировать, подавлять или заменять гены другими генами. На уровне ДНК можно проводить множество типов манипуляций. Активность фермента Cre можно контролировать так, чтобы он экспрессировался в определенном типе клеток или запускался внешним стимулом, таким как химический сигнал или тепловой шок. Эти целевые изменения ДНК полезны при отслеживании клеточной линии и когда мутанты летальны, если экспрессируются глобально.
Система Cre-Lox по своему действию и использованию очень похожа на систему рекомбинации FLP-FRT . [2]
Рекомбинация Cre-Lox — это особый тип сайт-специфической рекомбинации, разработанный доктором Брайаном Зауэром и запатентованный компанией DuPont, который действовал как в митотических, так и в немитотических клетках и изначально использовался для активации экспрессии генов в клеточных линиях млекопитающих. [3] [4] [5] Впоследствии исследователи в лаборатории доктора Джейми Марта продемонстрировали, что рекомбинация Cre-Lox может быть использована для удаления последовательностей хромосомной ДНК, фланкированных loxP, с высокой эффективностью в определенных развивающихся Т-клетках трансгенных животных, при этом авторы предположили, что этот подход может быть использован для определения эндогенной функции генов в определенных типах клеток, неизгладимой маркировки предшественников в исследованиях по определению судьбы клеток, индуцирования определенных хромосомных перестроек для биологического и патологического моделирования и определения роли ранних генетических повреждений в поддержании заболевания (и фенотипа). [6]
Вскоре после этого исследователи в лаборатории профессора Клауса Раевского сообщили о производстве плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, несущих целевой ген ДНК-полимеразы, фланкированный loxP (floxed). [7] Объединив эти достижения в сотрудничестве, лаборатории докторов Марта и Раевского сообщили в 1994 году, что рекомбинация Cre-lox может быть использована для условного нацеливания генов. [8] Они наблюдали, что ≈50% гена ДНК-полимеразы бета было удалено в Т-клетках на основе блоттинга ДНК. Было неясно, был ли только один аллель в каждой Т-клетке или 50% Т-клеток имели 100% делецию в обоих аллелях. С тех пор исследователи сообщили о более эффективном условном генном мутагенезе Cre-Lox в развивающихся Т-клетках в лаборатории Marth в 1995 году. [9] Неполное удаление рекомбиназой Cre не является редкостью в клетках, когда существуют две копии последовательностей floxed, и позволяет формировать и изучать химерные ткани. Было показано, что все типы клеток, протестированные на мышах, подвергаются трансгенной рекомбинации Cre.
Независимо от этого Джо З. Циен стал пионером в использовании системы Cre-loxP для манипуляции генами, специфичными для типа клеток и региона, во взрослом мозге, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и известно, что почти все нейроны во взрослом мозге являются постмитотическими. [10] Циен и его коллеги продемонстрировали, что рекомбинация, опосредованная Cre, может происходить в постмитотических пирамидальных нейронах переднего мозга взрослой мыши. [11]
Эти разработки привели к широкому использованию условного мутагенеза в биомедицинских исследованиях, охватывающих многие дисциплины, в которых он становится мощной платформой для определения функции генов в определенных типах клеток и в определенные периоды развития. В частности, четкая демонстрация его полезности в точном определении сложных взаимосвязей между определенными клетками/цепями и поведением для исследований мозга [12] побудила NIH инициировать проект NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver mouse в начале 2000 года. [13] [14] На сегодняшний день проекты NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre создали несколько сотен линий мышей Cre-driver, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.
Рекомбинация Cre-Lox включает в себя нацеливание на определенную последовательность ДНК и ее сплайсинг с помощью фермента, называемого Cre-рекомбиназой . Рекомбинация Cre-Lox обычно используется для обхода эмбриональной летальности, вызванной системной инактивацией многих генов. [15] [16] По состоянию на февраль 2019 года рекомбинация Cre-Lox является мощным инструментом и используется в моделировании трансгенных животных для связи генотипов с фенотипами. [12] [17] [18]
Система Cre-lox используется как генетический инструмент для контроля событий рекомбинации в геномной ДНК. Эта система позволила исследователям манипулировать различными генетически модифицированными организмами для контроля экспрессии генов, удаления нежелательных последовательностей ДНК и изменения архитектуры хромосом.
Белок Cre — это сайт-специфическая ДНК-рекомбиназа, которая может катализировать рекомбинацию ДНК между определенными сайтами в молекуле ДНК. Эти сайты, известные как последовательности loxP , содержат специфические сайты связывания для Cre, которые окружают направленную последовательность ядра, где может происходить рекомбинация.
Когда клетки, в геноме которых есть сайты loxP, экспрессируют Cre, между сайтами loxP может произойти событие рекомбинации . Белки рекомбиназы Cre связываются с первыми и последними 13 парами оснований сайта lox, образуя димер . Затем этот димер связывается с димером на другом сайте lox, образуя тетрамер . Сайты Lox являются направленными, и два сайта, соединенные тетрамером, имеют параллельную ориентацию. Двухцепочечная ДНК разрезается на обоих сайтах loxP белком Cre. Затем нити воссоединяются ДНК-лигазой в быстром и эффективном процессе. Результат рекомбинации зависит от ориентации сайтов loxP . Для двух сайтов lox на одном плече хромосомы инвертированные сайты loxP вызовут инверсию промежуточной ДНК, в то время как прямой повтор сайтов loxP вызовет событие делеции. Если сайты loxP находятся на разных хромосомах, возможно, что события транслокации будут катализироваться рекомбинацией, индуцированной Cre. Две плазмиды могут быть соединены с использованием вариантов сайтов lox 71 и 66. [19]
Cre-рекомбиназа может быть синтезирована соответствующим геном под управлением клеточно-специфичных промоторов, включая промоторы под контролем доксициклина. Дополнительный уровень контроля может быть достигнут с помощью его Cre-рекомбиназы, сконструированной для обратимой активации в присутствии аналога эстрогена 4-гидрокси-тамоксифена. Это дает преимущество, заключающееся в том, что Cre-рекомбиназа активна в течение короткого времени. Это предотвращает неспецифические действия Cre-рекомбиназы. Cre-рекомбиназа может распознавать криптические сайты в геноме хозяина и вызывать несанкционированную рекомбинацию, повреждая ДНК хозяина. Этот инструмент подходит для удаления генов устойчивости к антибиотикам, но, прежде всего, он позволяет условные нокауты, которые могут быть вызваны в определенное время в выбранном типе клеток. Полученные таким образом модели с большей вероятностью имитируют физиологическую ситуацию. [20]
Белок Cre (кодируемый локусом, первоначально названным «Causes recombination», в некоторых источниках встречается «Cyclization recombinase») [21] [22] состоит из 4 субъединиц и двух доменов: большего карбоксильного ( C-концевого ) домена и меньшего амино ( N-концевого ) домена. Всего белок содержит 343 аминокислоты . Домен C по структуре похож на домен в семействе ферментов Integrase , выделенных из фага лямбда . Это также каталитический участок фермента.
loxP (локус X-over P1) — это сайт на бактериофаге P1, состоящий из 34 п.н. Сайт включает асимметричную последовательность из 8 п.н., вариабельную, за исключением двух средних оснований, между двумя наборами симметричных последовательностей из 13 п.н. Точная последовательность приведена ниже; «N» обозначает основания, которые могут варьироваться, а строчные буквы обозначают основания, которые были мутированы из дикого типа. Последовательности из 13 п.н. являются палиндромными, но спейсер из 8 п.н. — нет, что придает последовательности loxP определенное направление. Обычно сайты loxP поставляются парами для генетических манипуляций. Если два сайта loxP находятся в одинаковой ориентации, то последовательность floxed (последовательность, фланкированная двумя сайтами loxP) вырезается; однако, если два сайта loxP находятся в противоположной ориентации, то последовательность floxed инвертируется. Если существует донорная последовательность floxed, донорную последовательность можно поменять местами с исходной последовательностью. Эта техника называется обменом кассетами, опосредованным рекомбиназой , и является очень удобным и экономящим время способом генетической манипуляции. Однако есть оговорка: реакция рекомбинации может происходить в обратном направлении, делая обмен кассетами неэффективным. Кроме того, вырезание последовательности может происходить в транс-положении вместо обмена кассетами в цис- положении. Мутанты loxP созданы для того, чтобы избежать этих проблем. [23]
Во время генетической рекомбинации между двумя цепями ДНК образуется соединение Холлидея , а двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК оставляет 3'ОН-конец открытым. Эта реакция сопровождается эндонуклеазной активностью фермента. 5'-фосфатные концы обычно являются субстратами для этой реакции, поэтому остаются расширенные 3'-области. Эта 3'-ОН-группа крайне нестабильна, и цепь, на которой она присутствует, должна найти свой комплемент. Поскольку гомологичная рекомбинация происходит после репликации ДНК, доступны две цепи ДНК, и, таким образом, 3'-ОН-группа должна спариться со своим комплементом, и она это делает с неповрежденной цепью на другом дуплексе. Теперь произошла одна точка кроссинговера, которая называется промежуточным соединением Холлидея.
Конец 3'OH удлиняется (то есть основания добавляются) с помощью ДНК-полимеразы. Спаривание противоположных цепей — это то, что составляет кроссинговер или событие рекомбинации, которое является общим для всех живых организмов, поскольку генетический материал на одной цепи одного дуплекса спарился с одной цепью другого дуплекса и был удлинен ДНК-полимеразой. Дальнейшее расщепление промежуточных продуктов Холлидея приводит к образованию гибридной ДНК.
Это дальнейшее расщепление или «резольвация» осуществляется специальной группой ферментов, называемых резолвазами. RuvC — это всего лишь один из этих резолваз, которые были выделены у бактерий и дрожжей.
В течение многих лет считалось, что при образовании промежуточного соединения Холлидея точка разветвления соединения (где цепи пересекаются) будет расположена в первом месте расщепления. Миграция точки разветвления ко второму месту расщепления затем каким-то образом запустит вторую половину пути. Эта модель предоставила удобное объяснение строгого требования гомологии между рекомбинирующими сайтами, поскольку миграция ветвей остановится при несоответствии и не позволит произойти второму обмену цепями. Однако в последние годы эта точка зрения была подвергнута сомнению, и большинство современных моделей рекомбинации Int, Xer и Flp включают только ограниченную миграцию ветвей (1–3 пары оснований промежуточного соединения Холлидея), сопряженную с событием изомеризации, которое отвечает за переключение специфичности расщепления цепей.
Сайт-специфическая рекомбинация (SSR) включает в себя определенные сайты для катализирующего действия специальных ферментов, называемых рекомбиназами. Cre, или циклическая рекомбиназа, является одним из таких ферментов. Сайт-специфическая рекомбинация, таким образом, является опосредованным ферментом расщеплением и лигированием двух определенных дезоксинуклеотидных последовательностей.
Ряд консервативных систем сайт-специфической рекомбинации были описаны как в прокариотических, так и в эукариотических организмах. В целом, эти системы используют один или несколько белков и действуют на уникальные асимметричные последовательности ДНК. Продукты события рекомбинации зависят от относительной ориентации этих асимметричных последовательностей. Многие другие белки, помимо рекомбиназы, участвуют в регуляции реакции. Во время сайт-специфической рекомбинации ДНК, которая приводит к генетической перестройке в таких процессах, как вирусная интеграция и вырезание и хромосомная сегрегация, эти ферменты рекомбиназы распознают определенные последовательности ДНК и катализируют взаимный обмен цепями ДНК между этими участками.
Инициирование сайт-специфической рекомбинации начинается со связывания рекомбинационных белков с соответствующими им ДНК-мишенями. Отдельная рекомбиназа распознает и связывается с каждым из двух сайтов рекомбинации на двух разных молекулах ДНК или в пределах одной цепи ДНК. В данном определенном сайте ДНК гидроксильная группа тирозина в рекомбиназе атакует фосфатную группу в остове ДНК, используя прямой механизм переэтерификации . Эта реакция связывает белок рекомбиназы с ДНК через фосфотирозиновую связь. Это сохраняет энергию фосфодиэфирной связи, позволяя обратить реакцию без участия высокоэнергетического кофактора.
Расщепление другой цепи также вызывает образование фосфотирозиновой связи между ДНК и ферментом. В обоих дуплексах ДНК связывание фосфатной группы с остатками тирозина оставляет 3'-ОН-группу свободной в остове ДНК. Фактически, комплекс фермент-ДНК является промежуточной стадией, за которой следует лигирование 3'-ОН-группы одной цепи ДНК с 5'-фосфатной группой другой цепи ДНК, которая ковалентно связана с остатком тирозина; то есть ковалентная связь между 5'-концом и остатком тирозина разрывается. Эта реакция синтезирует соединение Холлидея, обсуждавшееся ранее.
Таким образом, противоположные цепи ДНК соединяются. Последующее расщепление и повторное соединение заставляют цепи ДНК обмениваться своими сегментами. Белково-белковые взаимодействия управляют и направляют обмен цепями. Энергия не скомпрометирована, поскольку связь белок-ДНК компенсирует потерю фосфодиэфирной связи, которая произошла во время расщепления.
Сайт-специфическая рекомбинация также является важным процессом, который вирусы, такие как бактериофаги, используют для интеграции своего генетического материала в инфицированного хозяина. Вирус, называемый в таком состоянии профагом , выполняет это посредством интеграции и вырезания. Точки, где происходят реакции интеграции и вырезания, называются сайтами прикрепления (att). Сайт attP на фаге обменивается сегментами с сайтом attB на бактериальной ДНК. Таким образом, они являются сайт-специфическими, происходящими только на соответствующих сайтах att. Класс ферментов интегразы катализирует эту конкретную реакцию.
Было показано, что два фактора влияют на эффективность вырезания Cre на паре lox. Во-первых, идентичность нуклеотидной последовательности в спейсерной области сайта lox. Сконструированные варианты lox, которые отличаются в спейсерной области, как правило, имеют различную, но в целом более низкую эффективность рекомбинации по сравнению с loxP дикого типа, предположительно, за счет влияния на образование и разрешение промежуточного продукта рекомбинации. [26]
Другим фактором является длина ДНК между парой lox. Увеличение длины ДНК приводит к снижению эффективности рекомбинации Cre/lox, возможно, за счет регулирования динамики реакции. [27] [28] [29] Генетическое расположение последовательности floxed также влияет на эффективность рекомбинации, вероятно, за счет влияния на доступность ДНК рекомбиназой Cre . [29] Выбор драйвера Cre также важен, поскольку низкая экспрессия рекомбиназы Cre имеет тенденцию приводить к непараллельной рекомбинации. Непараллельная рекомбинация особенно проблематична в сценарии картирования судьбы , где одно событие рекомбинации предназначено для манипулирования изучаемым геном, а другое событие рекомбинации необходимо для активации гена-репортера (обычно кодирующего флуоресцентный белок) для отслеживания клеточной линии . [29] Неспособность активировать оба события рекомбинации одновременно затрудняет интерпретацию результатов картирования судьбы клетки .
Индуцируемая активация Cre достигается с помощью варианта CreER (рецептор эстрогена), который активируется только после доставки тамоксифена . [30] Это делается посредством слияния мутировавшего домена связывания лиганда рецептора эстрогена с рекомбиназой Cre, в результате чего Cre становится специфически активированным тамоксифеном. В отсутствие тамоксифена CreER приведет к перемещению мутировавшей рекомбиназы в цитоплазму. Белок останется в этом месте в своем неактивированном состоянии до тех пор, пока не будет дан тамоксифен. После введения тамоксифена он метаболизируется в 4-гидрокситамоксифен, который затем связывается с ER и приводит к транслокации CreER в ядро, где он затем может расщеплять сайты lox. [31] Важно отметить, что иногда флуоресцентные репортеры могут активироваться в отсутствие тамоксифена из-за утечки нескольких молекул рекомбиназы Cre в ядро, что в сочетании с очень чувствительными репортерами приводит к непреднамеренной маркировке клеток. [32] CreER(T2) был разработан для минимизации тамоксифен-независимой рекомбинации и максимизации чувствительности к тамоксифену.
Клетки изменяют свой фенотип в ответ на многочисленные стимулы окружающей среды и могут потерять экспрессию генов, обычно используемых для маркировки их идентичности, что затрудняет исследование вклада определенных типов клеток в заболевание. Поэтому исследователи часто используют трансгенных мышей, экспрессирующих рекомбиназу CreER t2, индуцированную введением тамоксифена, под контролем промотора гена, который маркирует определенный тип интересующих клеток, с репортером флуоресцентного белка Cre-зависимого. Рекомбиназа Cre слита с мутантной формой рецептора эстрогена, который связывает синтетический эстроген 4-гидрокситамоксифен вместо его естественного лиганда 17β-эстрадиола. CreER(T2) находится в цитоплазме и может транслоцироваться в ядро только после введения тамоксифена, что позволяет осуществлять строгий временной контроль рекомбинации. Флуоресцентная репортерная кассета будет содержать промотор, позволяющий высокую экспрессию флуоресцентного трансгенного репортера (например, промотора CAG) и стоп-кассету, фланкированную loxP, что гарантирует, что экспрессия трансгена зависит от Cre-рекомбиназы и последовательности репортера. После рекомбинации, управляемой Cre, стоп-кассета вырезается, что позволяет репортерным генам экспрессироваться специфически в клетках, в которых экспрессия Cre управляется промотором клеточно-специфического маркера. Поскольку удаление стоп-кассеты является постоянным, репортерные гены экспрессируются во всем потомстве, произведенном исходными клетками, где Cre был когда-то активирован. Такое условное отслеживание линии оказалось чрезвычайно полезным для эффективной и специфичной идентификации сосудистых гладкомышечных клеток (VSMC) и клеток, полученных из VSMC, и использовалось для тестирования эффектов на VSMC и клетки, полученные из VSMC, in vivo. [33] [34] [35] [36] [37] [38]
Фаг P1 — это умеренный фаг, который вызывает либо лизогенный , либо литический цикл при заражении бактерии. В литическом состоянии, как только его вирусный геном вводится в клетку-хозяина, производятся вирусные белки, собираются вирионы, а клетка-хозяин лизируется для высвобождения фагов, продолжая цикл. В лизогенном цикле геном фага реплицируется с остальной частью бактериального генома и передается дочерним клеткам при каждом последующем делении клетки. Он может перейти в литический цикл под действием более позднего события, такого как УФ-излучение или голодание.
Фаги, такие как фаг лямбда, используют свои сайт-специфические рекомбиназы для интеграции своей ДНК в геном хозяина во время лизогении. ДНК фага P1, с другой стороны, существует в хозяине в виде плазмиды . Система Cre-lox выполняет несколько функций в фаге: она закольцовывает ДНК фага в плазмиду, разделяет взаимосвязанные плазмидные кольца, чтобы они передавались обеим дочерним бактериям в равной степени, и может помочь поддерживать число копий с помощью альтернативного способа репликации. [39]
ДНК фага P1 при высвобождении в хозяина из вириона находится в форме линейной двухцепочечной молекулы ДНК. Фермент Cre нацеливается на сайты loxP на концах этой молекулы и циклизует геном. Это также может происходить при отсутствии системы Cre lox [40] с помощью других бактериальных и вирусных белков. Плазмида P1 относительно большая (≈90 Кбн) и, следовательно, существует в небольшом количестве копий — обычно по одной на клетку. Если две дочерние плазмиды сцепляются, одна из дочерних клеток хозяина потеряет плазмиду. Система рекомбинации Cre-lox предотвращает эти ситуации, расцепляя кольца ДНК путем проведения двух событий рекомбинации (связанные кольца -> одно слитое кольцо -> два несвязанных кольца). Также предполагается, что репликация по катящемуся кругу с последующей рекомбинацией позволит плазмиде увеличить количество копий, когда определенные регуляторы (repA) ограничивают. [39]
Классическая стратегия создания вариантов делеции гена основана на двойной перекрестной интеграции нереплицирующихся векторов в геном. Кроме того, широко используются такие системы рекомбинации, как Cre-lox, в основном у эукариот. Универсальные свойства рекомбиназы Cre делают ее идеальной для использования во многих стратегиях генной инженерии. Таким образом, система Cre lox использовалась у самых разных эукариот, включая растения. [41]
Исследователи использовали несколько вариантов loxP [42] , в частности lox2272 и loxN, в сочетании с различными действиями Cre (транзиентными или постоянными) для создания системы « Brainbow », которая позволяет окрашивать мозг мышей в несколько цветов с помощью четырех флуоресцентных белков.
В другом отчете используются две пары вариантов lox, но посредством регулирования длины ДНК в одной паре происходит стохастическая активация генов с регулируемым уровнем разреженности. [27]