stringtranslate.com

Рекомбинация Cre-Lox

Рекомбинация Cre-Lox — это технология сайт-специфической рекомбиназы , используемая для выполнения делеций , вставок , транслокаций и инверсий в определенных участках ДНК клеток. Она позволяет нацеливать модификацию ДНК на определенный тип клеток или запускать ее определенным внешним стимулом. Она реализуется как в эукариотических, так и в прокариотических системах. Система рекомбинации Cre-lox оказалась особенно полезной для нейробиологов в изучении мозга, в котором сложные типы клеток и нейронные цепи объединяются для генерации познания и поведения. NIH Blueprint for Neuroscience Research создала несколько сотен линий мышей-драйверов Cre, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.

Важным применением системы Cre-lox является удаление селективных маркеров при замене генов. Обычно используемые стратегии замены генов вводят селективные маркеры в геном для облегчения отбора генетических мутаций, которые могут вызывать задержку роста. Однако экспрессия маркеров может иметь полярные эффекты на экспрессию генов выше и ниже по течению. Удаление селективных маркеров из генома с помощью рекомбинации Cre-lox является элегантным и эффективным способом обойти эту проблему и поэтому широко используется в растениях, линиях клеток мышей, дрожжах и т. д. [1]

Система состоит из одного фермента, рекомбиназы Cre , которая рекомбинирует пару коротких целевых последовательностей, называемых последовательностями Lox . Эта система может быть реализована без вставки дополнительных поддерживающих белков или последовательностей. Фермент Cre и исходный сайт Lox , называемый последовательностью LoxP , получены из бактериофага P1 .

Размещение последовательностей Lox соответствующим образом позволяет активировать, подавлять или заменять гены другими генами. На уровне ДНК можно проводить множество типов манипуляций. Активность фермента Cre можно контролировать так, чтобы он экспрессировался в определенном типе клеток или запускался внешним стимулом, таким как химический сигнал или тепловой шок. Эти целевые изменения ДНК полезны при отслеживании клеточной линии и когда мутанты летальны, если экспрессируются глобально.

Система Cre-Lox по своему действию и использованию очень похожа на систему рекомбинации FLP-FRT . [2]

История

Рекомбинация Cre-Lox — это особый тип сайт-специфической рекомбинации, разработанный доктором Брайаном Зауэром и запатентованный компанией DuPont, который действовал как в митотических, так и в немитотических клетках и изначально использовался для активации экспрессии генов в клеточных линиях млекопитающих. [3] [4] [5] Впоследствии исследователи в лаборатории доктора Джейми Марта продемонстрировали, что рекомбинация Cre-Lox может быть использована для удаления последовательностей хромосомной ДНК, фланкированных loxP, с высокой эффективностью в определенных развивающихся Т-клетках трансгенных животных, при этом авторы предположили, что этот подход может быть использован для определения эндогенной функции генов в определенных типах клеток, неизгладимой маркировки предшественников в исследованиях по определению судьбы клеток, индуцирования определенных хромосомных перестроек для биологического и патологического моделирования и определения роли ранних генетических повреждений в поддержании заболевания (и фенотипа). [6]

Вскоре после этого исследователи в лаборатории профессора Клауса Раевского сообщили о производстве плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, несущих целевой ген ДНК-полимеразы, фланкированный loxP (floxed). [7] Объединив эти достижения в сотрудничестве, лаборатории докторов Марта и Раевского сообщили в 1994 году, что рекомбинация Cre-lox может быть использована для условного нацеливания генов. [8] Они наблюдали, что ≈50% гена ДНК-полимеразы бета было удалено в Т-клетках на основе блоттинга ДНК. Было неясно, был ли только один аллель в каждой Т-клетке или 50% Т-клеток имели 100% делецию в обоих аллелях. С тех пор исследователи сообщили о более эффективном условном генном мутагенезе Cre-Lox в развивающихся Т-клетках в лаборатории Marth в 1995 году. [9] Неполное удаление рекомбиназой Cre не является редкостью в клетках, когда существуют две копии последовательностей floxed, и позволяет формировать и изучать химерные ткани. Было показано, что все типы клеток, протестированные на мышах, подвергаются трансгенной рекомбинации Cre.

Независимо от этого Джо З. Циен стал пионером в использовании системы Cre-loxP для манипуляции генами, специфичными для типа клеток и региона, во взрослом мозге, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и известно, что почти все нейроны во взрослом мозге являются постмитотическими. [10] Циен и его коллеги продемонстрировали, что рекомбинация, опосредованная Cre, может происходить в постмитотических пирамидальных нейронах переднего мозга взрослой мыши. [11]

Эти разработки привели к широкому использованию условного мутагенеза в биомедицинских исследованиях, охватывающих многие дисциплины, в которых он становится мощной платформой для определения функции генов в определенных типах клеток и в определенные периоды развития. В частности, четкая демонстрация его полезности в точном определении сложных взаимосвязей между определенными клетками/цепями и поведением для исследований мозга [12] побудила NIH инициировать проект NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver mouse в начале 2000 года. [13] [14] На сегодняшний день проекты NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre создали несколько сотен линий мышей Cre-driver, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.

Обзор

Рекомбинация Cre-Lox включает в себя нацеливание на определенную последовательность ДНК и ее сплайсинг с помощью фермента, называемого Cre-рекомбиназой . Рекомбинация Cre-Lox обычно используется для обхода эмбриональной летальности, вызванной системной инактивацией многих генов. [15] [16] По состоянию на февраль 2019 года рекомбинация Cre-Lox является мощным инструментом и используется в моделировании трансгенных животных для связи генотипов с фенотипами. [12] [17] [18]

Система Cre-lox используется как генетический инструмент для контроля событий рекомбинации в геномной ДНК. Эта система позволила исследователям манипулировать различными генетически модифицированными организмами для контроля экспрессии генов, удаления нежелательных последовательностей ДНК и изменения архитектуры хромосом.

Белок Cre — это сайт-специфическая ДНК-рекомбиназа, которая может катализировать рекомбинацию ДНК между определенными сайтами в молекуле ДНК. Эти сайты, известные как последовательности loxP , содержат специфические сайты связывания для Cre, которые окружают направленную последовательность ядра, где может происходить рекомбинация.

Диаграмма, описывающая, как можно использовать сайты Lox71 и Lox66 для объединения двух плазмид в одну непрерывную плазмиду.

Когда клетки, в геноме которых есть сайты loxP, экспрессируют Cre, между сайтами loxP может произойти событие рекомбинации . Белки рекомбиназы Cre связываются с первыми и последними 13 парами оснований сайта lox, образуя димер . Затем этот димер связывается с димером на другом сайте lox, образуя тетрамер . Сайты Lox являются направленными, и два сайта, соединенные тетрамером, имеют параллельную ориентацию. Двухцепочечная ДНК разрезается на обоих сайтах loxP белком Cre. Затем нити воссоединяются ДНК-лигазой в быстром и эффективном процессе. Результат рекомбинации зависит от ориентации сайтов loxP . Для двух сайтов lox на одном плече хромосомы инвертированные сайты loxP вызовут инверсию промежуточной ДНК, в то время как прямой повтор сайтов loxP вызовет событие делеции. Если сайты loxP находятся на разных хромосомах, возможно, что события транслокации будут катализироваться рекомбинацией, индуцированной Cre. Две плазмиды могут быть соединены с использованием вариантов сайтов lox 71 и 66. [19]

Cre-рекомбиназа

Cre-рекомбиназа может быть синтезирована соответствующим геном под управлением клеточно-специфичных промоторов, включая промоторы под контролем доксициклина. Дополнительный уровень контроля может быть достигнут с помощью его Cre-рекомбиназы, сконструированной для обратимой активации в присутствии аналога эстрогена 4-гидрокси-тамоксифена. Это дает преимущество, заключающееся в том, что Cre-рекомбиназа активна в течение короткого времени. Это предотвращает неспецифические действия Cre-рекомбиназы. Cre-рекомбиназа может распознавать криптические сайты в геноме хозяина и вызывать несанкционированную рекомбинацию, повреждая ДНК хозяина. Этот инструмент подходит для удаления генов устойчивости к антибиотикам, но, прежде всего, он позволяет условные нокауты, которые могут быть вызваны в определенное время в выбранном типе клеток. Полученные таким образом модели с большей вероятностью имитируют физиологическую ситуацию. [20]

Белок Cre (кодируемый локусом, первоначально названным «Causes recombination», в некоторых источниках встречается «Cyclization recombinase») [21] [22] состоит из 4 субъединиц и двух доменов: большего карбоксильного ( C-концевого ) домена и меньшего амино ( N-концевого ) домена. Всего белок содержит 343 аминокислоты . Домен C по структуре похож на домен в семействе ферментов Integrase , выделенных из фага лямбда . Это также каталитический участок фермента.

loxPсайт

loxP (локус X-over P1) — это сайт на бактериофаге P1, состоящий из 34 п.н. Сайт включает асимметричную последовательность из 8 п.н., вариабельную, за исключением двух средних оснований, между двумя наборами симметричных последовательностей из 13 п.н. Точная последовательность приведена ниже; «N» обозначает основания, которые могут варьироваться, а строчные буквы обозначают основания, которые были мутированы из дикого типа. Последовательности из 13 п.н. являются палиндромными, но спейсер из 8 п.н. — нет, что придает последовательности loxP определенное направление. Обычно сайты loxP поставляются парами для генетических манипуляций. Если два сайта loxP находятся в одинаковой ориентации, то последовательность floxed (последовательность, фланкированная двумя сайтами loxP) вырезается; однако, если два сайта loxP находятся в противоположной ориентации, то последовательность floxed инвертируется. Если существует донорная последовательность floxed, донорную последовательность можно поменять местами с исходной последовательностью. Эта техника называется обменом кассетами, опосредованным рекомбиназой , и является очень удобным и экономящим время способом генетической манипуляции. Однако есть оговорка: реакция рекомбинации может происходить в обратном направлении, делая обмен кассетами неэффективным. Кроме того, вырезание последовательности может происходить в транс-положении вместо обмена кассетами в цис- положении. Мутанты loxP созданы для того, чтобы избежать этих проблем. [23]

Соединения Холлидея и гомологичная рекомбинация

Во время генетической рекомбинации между двумя цепями ДНК образуется соединение Холлидея , а двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК оставляет 3'ОН-конец открытым. Эта реакция сопровождается эндонуклеазной активностью фермента. 5'-фосфатные концы обычно являются субстратами для этой реакции, поэтому остаются расширенные 3'-области. Эта 3'-ОН-группа крайне нестабильна, и цепь, на которой она присутствует, должна найти свой комплемент. Поскольку гомологичная рекомбинация происходит после репликации ДНК, доступны две цепи ДНК, и, таким образом, 3'-ОН-группа должна спариться со своим комплементом, и она это делает с неповрежденной цепью на другом дуплексе. Теперь произошла одна точка кроссинговера, которая называется промежуточным соединением Холлидея.

Конец 3'OH удлиняется (то есть основания добавляются) с помощью ДНК-полимеразы. Спаривание противоположных цепей — это то, что составляет кроссинговер или событие рекомбинации, которое является общим для всех живых организмов, поскольку генетический материал на одной цепи одного дуплекса спарился с одной цепью другого дуплекса и был удлинен ДНК-полимеразой. Дальнейшее расщепление промежуточных продуктов Холлидея приводит к образованию гибридной ДНК.

Это дальнейшее расщепление или «резольвация» осуществляется специальной группой ферментов, называемых резолвазами. RuvC — это всего лишь один из этих резолваз, которые были выделены у бактерий и дрожжей.

В течение многих лет считалось, что при образовании промежуточного соединения Холлидея точка разветвления соединения (где цепи пересекаются) будет расположена в первом месте расщепления. Миграция точки разветвления ко второму месту расщепления затем каким-то образом запустит вторую половину пути. Эта модель предоставила удобное объяснение строгого требования гомологии между рекомбинирующими сайтами, поскольку миграция ветвей остановится при несоответствии и не позволит произойти второму обмену цепями. Однако в последние годы эта точка зрения была подвергнута сомнению, и большинство современных моделей рекомбинации Int, Xer и Flp включают только ограниченную миграцию ветвей (1–3 пары оснований промежуточного соединения Холлидея), сопряженную с событием изомеризации, которое отвечает за переключение специфичности расщепления цепей.

Сайт-специфическая рекомбинация

Сайт-специфическая рекомбинация (SSR) включает в себя определенные сайты для катализирующего действия специальных ферментов, называемых рекомбиназами. Cre, или циклическая рекомбиназа, является одним из таких ферментов. Сайт-специфическая рекомбинация, таким образом, является опосредованным ферментом расщеплением и лигированием двух определенных дезоксинуклеотидных последовательностей.

Ряд консервативных систем сайт-специфической рекомбинации были описаны как в прокариотических, так и в эукариотических организмах. В целом, эти системы используют один или несколько белков и действуют на уникальные асимметричные последовательности ДНК. Продукты события рекомбинации зависят от относительной ориентации этих асимметричных последовательностей. Многие другие белки, помимо рекомбиназы, участвуют в регуляции реакции. Во время сайт-специфической рекомбинации ДНК, которая приводит к генетической перестройке в таких процессах, как вирусная интеграция и вырезание и хромосомная сегрегация, эти ферменты рекомбиназы распознают определенные последовательности ДНК и катализируют взаимный обмен цепями ДНК между этими участками.

Механизм действия

Модельный эксперимент по генетике с использованием системы Cre-lox: преждевременная стоп-последовательность, присутствующая у мышей с флоксом, удаляется только из клеток, экспрессирующих рекомбиназу Cre, когда мышей скрещивают друг с другом

Инициирование сайт-специфической рекомбинации начинается со связывания рекомбинационных белков с соответствующими им ДНК-мишенями. Отдельная рекомбиназа распознает и связывается с каждым из двух сайтов рекомбинации на двух разных молекулах ДНК или в пределах одной цепи ДНК. В данном определенном сайте ДНК гидроксильная группа тирозина в рекомбиназе атакует фосфатную группу в остове ДНК, используя прямой механизм переэтерификации . Эта реакция связывает белок рекомбиназы с ДНК через фосфотирозиновую связь. Это сохраняет энергию фосфодиэфирной связи, позволяя обратить реакцию без участия высокоэнергетического кофактора.

Расщепление другой цепи также вызывает образование фосфотирозиновой связи между ДНК и ферментом. В обоих дуплексах ДНК связывание фосфатной группы с остатками тирозина оставляет 3'-ОН-группу свободной в остове ДНК. Фактически, комплекс фермент-ДНК является промежуточной стадией, за которой следует лигирование 3'-ОН-группы одной цепи ДНК с 5'-фосфатной группой другой цепи ДНК, которая ковалентно связана с остатком тирозина; то есть ковалентная связь между 5'-концом и остатком тирозина разрывается. Эта реакция синтезирует соединение Холлидея, обсуждавшееся ранее.

Таким образом, противоположные цепи ДНК соединяются. Последующее расщепление и повторное соединение заставляют цепи ДНК обмениваться своими сегментами. Белково-белковые взаимодействия управляют и направляют обмен цепями. Энергия не скомпрометирована, поскольку связь белок-ДНК компенсирует потерю фосфодиэфирной связи, которая произошла во время расщепления.

Сайт-специфическая рекомбинация также является важным процессом, который вирусы, такие как бактериофаги, используют для интеграции своего генетического материала в инфицированного хозяина. Вирус, называемый в таком состоянии профагом , выполняет это посредством интеграции и вырезания. Точки, где происходят реакции интеграции и вырезания, называются сайтами прикрепления (att). Сайт attP на фаге обменивается сегментами с сайтом attB на бактериальной ДНК. Таким образом, они являются сайт-специфическими, происходящими только на соответствующих сайтах att. Класс ферментов интегразы катализирует эту конкретную реакцию.

Эффективность действия

Было показано, что два фактора влияют на эффективность вырезания Cre на паре lox. Во-первых, идентичность нуклеотидной последовательности в спейсерной области сайта lox. Сконструированные варианты lox, которые отличаются в спейсерной области, как правило, имеют различную, но в целом более низкую эффективность рекомбинации по сравнению с loxP дикого типа, предположительно, за счет влияния на образование и разрешение промежуточного продукта рекомбинации. [26]

Другим фактором является длина ДНК между парой lox. Увеличение длины ДНК приводит к снижению эффективности рекомбинации Cre/lox, возможно, за счет регулирования динамики реакции. [27] [28] [29] Генетическое расположение последовательности floxed также влияет на эффективность рекомбинации, вероятно, за счет влияния на доступность ДНК рекомбиназой Cre . [29] Выбор драйвера Cre также важен, поскольку низкая экспрессия рекомбиназы Cre имеет тенденцию приводить к непараллельной рекомбинации. Непараллельная рекомбинация особенно проблематична в сценарии картирования судьбы , где одно событие рекомбинации предназначено для манипулирования изучаемым геном, а другое событие рекомбинации необходимо для активации гена-репортера (обычно кодирующего флуоресцентный белок) для отслеживания клеточной линии . [29] Неспособность активировать оба события рекомбинации одновременно затрудняет интерпретацию результатов картирования судьбы клетки .

Временной контроль

Индуцируемая активация Cre достигается с помощью варианта CreER (рецептор эстрогена), который активируется только после доставки тамоксифена . [30] Это делается посредством слияния мутировавшего домена связывания лиганда рецептора эстрогена с рекомбиназой Cre, в результате чего Cre становится специфически активированным тамоксифеном. В отсутствие тамоксифена CreER приведет к перемещению мутировавшей рекомбиназы в цитоплазму. Белок останется в этом месте в своем неактивированном состоянии до тех пор, пока не будет дан тамоксифен. После введения тамоксифена он метаболизируется в 4-гидрокситамоксифен, который затем связывается с ER и приводит к транслокации CreER в ядро, где он затем может расщеплять сайты lox. [31] Важно отметить, что иногда флуоресцентные репортеры могут активироваться в отсутствие тамоксифена из-за утечки нескольких молекул рекомбиназы Cre в ядро, что в сочетании с очень чувствительными репортерами приводит к непреднамеренной маркировке клеток. [32] CreER(T2) был разработан для минимизации тамоксифен-независимой рекомбинации и максимизации чувствительности к тамоксифену.

Условное отслеживание клеточной линии

Клетки изменяют свой фенотип в ответ на многочисленные стимулы окружающей среды и могут потерять экспрессию генов, обычно используемых для маркировки их идентичности, что затрудняет исследование вклада определенных типов клеток в заболевание. Поэтому исследователи часто используют трансгенных мышей, экспрессирующих рекомбиназу CreER t2, индуцированную введением тамоксифена, под контролем промотора гена, который маркирует определенный тип интересующих клеток, с репортером флуоресцентного белка Cre-зависимого. Рекомбиназа Cre слита с мутантной формой рецептора эстрогена, который связывает синтетический эстроген 4-гидрокситамоксифен вместо его естественного лиганда 17β-эстрадиола. CreER(T2) находится в цитоплазме и может транслоцироваться в ядро ​​только после введения тамоксифена, что позволяет осуществлять строгий временной контроль рекомбинации. Флуоресцентная репортерная кассета будет содержать промотор, позволяющий высокую экспрессию флуоресцентного трансгенного репортера (например, промотора CAG) и стоп-кассету, фланкированную loxP, что гарантирует, что экспрессия трансгена зависит от Cre-рекомбиназы и последовательности репортера. После рекомбинации, управляемой Cre, стоп-кассета вырезается, что позволяет репортерным генам экспрессироваться специфически в клетках, в которых экспрессия Cre управляется промотором клеточно-специфического маркера. Поскольку удаление стоп-кассеты является постоянным, репортерные гены экспрессируются во всем потомстве, произведенном исходными клетками, где Cre был когда-то активирован. Такое условное отслеживание линии оказалось чрезвычайно полезным для эффективной и специфичной идентификации сосудистых гладкомышечных клеток (VSMC) и клеток, полученных из VSMC, и использовалось для тестирования эффектов на VSMC и клетки, полученные из VSMC, in vivo. [33] [34] [35] [36] [37] [38]

Естественная функция системы Cre-lox

Фаг P1 — это умеренный фаг, который вызывает либо лизогенный , либо литический цикл при заражении бактерии. В литическом состоянии, как только его вирусный геном вводится в клетку-хозяина, производятся вирусные белки, собираются вирионы, а клетка-хозяин лизируется для высвобождения фагов, продолжая цикл. В лизогенном цикле геном фага реплицируется с остальной частью бактериального генома и передается дочерним клеткам при каждом последующем делении клетки. Он может перейти в литический цикл под действием более позднего события, такого как УФ-излучение или голодание.

Фаги, такие как фаг лямбда, используют свои сайт-специфические рекомбиназы для интеграции своей ДНК в геном хозяина во время лизогении. ДНК фага P1, с другой стороны, существует в хозяине в виде плазмиды . Система Cre-lox выполняет несколько функций в фаге: она закольцовывает ДНК фага в плазмиду, разделяет взаимосвязанные плазмидные кольца, чтобы они передавались обеим дочерним бактериям в равной степени, и может помочь поддерживать число копий с помощью альтернативного способа репликации. [39]

ДНК фага P1 при высвобождении в хозяина из вириона находится в форме линейной двухцепочечной молекулы ДНК. Фермент Cre нацеливается на сайты loxP на концах этой молекулы и циклизует геном. Это также может происходить при отсутствии системы Cre lox [40] с помощью других бактериальных и вирусных белков. Плазмида P1 относительно большая (≈90 Кбн) и, следовательно, существует в небольшом количестве копий — обычно по одной на клетку. Если две дочерние плазмиды сцепляются, одна из дочерних клеток хозяина потеряет плазмиду. Система рекомбинации Cre-lox предотвращает эти ситуации, расцепляя кольца ДНК путем проведения двух событий рекомбинации (связанные кольца -> одно слитое кольцо -> два несвязанных кольца). Также предполагается, что репликация по катящемуся кругу с последующей рекомбинацией позволит плазмиде увеличить количество копий, когда определенные регуляторы (repA) ограничивают. [39]

Реализация нескольких пар сайтов loxP

Классическая стратегия создания вариантов делеции гена основана на двойной перекрестной интеграции нереплицирующихся векторов в геном. Кроме того, широко используются такие системы рекомбинации, как Cre-lox, в основном у эукариот. Универсальные свойства рекомбиназы Cre делают ее идеальной для использования во многих стратегиях генной инженерии. Таким образом, система Cre lox использовалась у самых разных эукариот, включая растения. [41]

Исследователи использовали несколько вариантов loxP [42] , в частности lox2272 и loxN, в сочетании с различными действиями Cre (транзиентными или постоянными) для создания системы « Brainbow », которая позволяет окрашивать мозг мышей в несколько цветов с помощью четырех флуоресцентных белков.

В другом отчете используются две пары вариантов lox, но посредством регулирования длины ДНК в одной паре происходит стохастическая активация генов с регулируемым уровнем разреженности. [27]

Примечания и ссылки

  1. ^ Мецгер, Даниэль; Шамбон, Пьер (2001). «Сайт- и времяспецифическое нацеливание генов у мышей». Методы . 24 (1): 71–80. doi :10.1006/meth.2001.1159. PMID  11327805.
  2. ^ Turan S, Galla M, Ernst E, Qiao J, Voelkel C, Schiedlmeier B и др. (март 2011 г.). «Рекомбиназно-опосредованный обмен кассетами (RMCE): традиционные концепции и текущие проблемы». Журнал молекулярной биологии . 407 (2): 193–221. doi :10.1016/j.jmb.2011.01.004. PMID  21241707.
  3. ^ «Сайт-специфическая рекомбинация ДНК в эукариотических клетках».
  4. ^ Sauer B (июнь 1987). «Функциональная экспрессия системы сайт-специфической рекомбинации cre-lox в дрожжах Saccharomyces cerevisiae». Молекулярная и клеточная биология . 7 (6): 2087–96. doi :10.1128/mcb.7.6.2087. PMC 365329. PMID  3037344 . 
  5. ^ Sauer B, Henderson N (июль 1988 г.). «Сайт-специфическая рекомбинация ДНК в клетках млекопитающих с помощью рекомбиназы Cre бактериофага P1». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (14): 5166–70. Bibcode : 1988PNAS...85.5166S. doi : 10.1073 /pnas.85.14.5166 . PMC 281709. PMID  2839833. 
  6. ^ Orban PC, Chui D, Marth JD (август 1992 г.). «Тканеспецифическая и сайт-специфическая рекомбинация ДНК у трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (15): 6861–5. Bibcode : 1992PNAS...89.6861O. doi : 10.1073 /pnas.89.15.6861 . PMC 49604. PMID  1495975. 
  7. ^ Gu H, Zou YR, Rajewsky K (июнь 1993 г.). «Независимый контроль рекомбинации переключения иммуноглобулина в отдельных областях переключения, подтвержденный посредством опосредованного Cre-loxP генного нацеливания». Cell . 73 (6): 1155–64. doi :10.1016/0092-8674(93)90644-6. PMID  8513499. S2CID  29537406.
  8. ^ Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajewsky K (июль 1994). «Удаление сегмента гена ДНК-полимеразы бета в Т-клетках с использованием специфического для типа клеток нацеливания генов». Science . 265 (5168): 103–6. Bibcode :1994Sci...265..103G. doi :10.1126/science.8016642. PMID  8016642.
  9. ^ Hennet T, Hagen FK, Tabak LA, Marth JD (декабрь 1995 г.). «Т-клеточно-специфическая делеция гена полипептидной N-ацетилгалактозаминилтрансферазы путем сайт-направленной рекомбинации». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (26): 12070–4. Bibcode : 1995PNAS ...9212070H. doi : 10.1073/pnas.92.26.12070 . PMC 40298. PMID  8618846. 
  10. ^ Tsien JZ (2016). «Нейрогенетика Cre-Lox: 20 лет разнообразных приложений в исследованиях мозга и подсчете…». Frontiers in Genetics . 7 : 19. doi : 10.3389/fgene.2016.00019 . PMC 4759636. PMID  26925095. 
  11. ^ Tsien JZ, Chen DF, Gerber D, Tom C, Mercer EH, Anderson DJ и др. (декабрь 1996 г.). «Ограниченный субрегионом и типом клеток нокаут гена в мозге мыши». Cell . 87 (7): 1317–26. doi : 10.1016/s0092-8674(00)81826-7 . PMID  8980237.
  12. ^ ab Tsien JZ, Huerta PT, Tonegawa S (декабрь 1996 г.). «Важнейшая роль синаптической пластичности, зависящей от рецептора NMDA гиппокампа CA1, в пространственной памяти». Cell . 87 (7): 1327–38. doi : 10.1016/s0092-8674(00)81827-9 . PMID  8980238.
  13. ^ Проект NIH для нейронауки: сеть драйверов Cre. http://www.neuroscienceblueprint.nih.gov/factSheet/CreDriver.htm
  14. ^ Проект мозга GENSAT, http://www.gensat.org/index.html
  15. ^ Shen J, Bronson RT, Chen DF, Xia W, Selkoe DJ, Tonegawa S (май 1997). «Дефекты скелета и ЦНС у мышей с дефицитом пресенилина-1». Cell . 89 (4): 629–39. doi : 10.1016/s0092-8674(00)80244-5 . PMID  9160754.
  16. ^ Li Y, Erzurumlu RS, Chen C, Jhaveri S, Tonegawa S (февраль 1994 г.). «Нейрональные паттерны, связанные с усами, не развиваются в ядрах тройничного ствола мозга у мышей с нокаутом NMDAR1». Cell . 76 (3): 427–37. doi :10.1016/0092-8674(94)90108-2. PMID  8313466. S2CID  35342965.
  17. ^ Feng R, Rampon C, Tang YP, Shrom D, Jin J, Kyin M и др. (декабрь 2001 г.). «Дефицит нейрогенеза у мышей с нокаутом пресенилина-1 в переднем мозге связан с уменьшением очистки следов памяти гиппокампа». Neuron . 32 (5): 911–26. doi : 10.1016/s0896-6273(01)00523-2 . ​​PMID  11738035.
  18. ^ «Рекомбинация Cre-Lox».
  19. ^ Hastie AR, Pruitt SC (2007). "Скрининг дрожжевых двухгибридных партнеров по взаимодействию с помощью in vivo Cre-опосредованной генерации бинарных меток взаимодействия". Nucleic Acids Research . 35 (21): e141. doi :10.1093/nar/gkm894. PMC 2189736. PMID  17986461 . 
  20. ^ Мецгер, Даниэль; Шамбон, Пьер (2001). «Сайт- и времяспецифическое нацеливание генов у мышей». Методы . 24 (1): 71–80. doi :10.1006/meth.2001.1159. PMID  11327805.
  21. ^ "Циклизация рекомбиназы [Escherichia coli] - Белок - NCBI".
  22. ^ Sternberg N, Hamilton D (август 1981). «Рекомбинация сайта бактериофага P1. I. Рекомбинация между сайтами loxP». Журнал молекулярной биологии . 150 (4): 467–86. doi :10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID  6276557.
  23. ^ Араки К, Араки М, Ямамура К (февраль 1997 г.). «Целевая интеграция ДНК с использованием мутантных сайтов lox в эмбриональных стволовых клетках». Nucleic Acids Research . 25 (4): 868–72. doi :10.1093/nar/25.4.868. PMC 146486. PMID  9016639 . 
  24. ^ Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA (апрель 2006 г.). «Высокопроизводительный скрининг, идентифицирующий последовательность и характеристики разнородности спейсерной области loxP в рекомбинации, опосредованной Cre». BMC Genomics . 7 : 73. doi : 10.1186/1471-2164-7-73 . PMC 1479339 . PMID  16595017. 
  25. ^ Хёсс, Рональд Х.; Вежбицки, Анна; Абремски, Кеннет (1986). «Роль области theloxPspacer в сайт-специфической рекомбинации PI». Nucleic Acids Research . 14 (5): 2287–2300. doi :10.1093/nar/14.5.2287. ISSN  0305-1048. PMC 339658. PMID  3457367 . 
  26. ^ Ли Г, Сайто И (август 1998 г.). «Роль нуклеотидных последовательностей спейсерной области loxP в рекомбинации, опосредованной Cre». Gene . 216 (1): 55–65. doi :10.1016/s0378-1119(98)00325-4. PMID  9714735.
  27. ^ ab Wang SZ, Liu BH, Tao HW, Xia K, Zhang LI (2009). "Генетическая стратегия стохастической активации генов с регулируемой разреженностью (STARS)". PLOS ONE . ​​4 (1): e4200. Bibcode :2009PLoSO...4.4200W. doi : 10.1371/journal.pone.0004200 . PMC 2615212 . PMID  19145242. 
  28. ^ Zheng B, Sage M, Sheppeard EA, Jurecic V, Bradley A (январь 2000 г.). «Инженерные мышиные хромосомы с Cre-loxP: диапазон, эффективность и соматические применения». Молекулярная и клеточная биология . 20 (2): 648–55. doi :10.1128/mcb.20.2.648-655.2000. PMC 85158. PMID  10611243. 
  29. ^ abc Liu J, Willet SG, Bankaitis ED, Xu Y, Wright CV, Gu G (июнь 2013 г.). «Непараллельная рекомбинация ограничивает репортеров на основе Cre-LoxP как точные индикаторы условных генетических манипуляций». Genesis . 51 (6): 436–42. doi :10.1002/dvg.22384. PMC 3696028 . PMID  23441020. 
  30. ^ Walrath JC, Hawes JJ, Van Dyke T, Reilly KM (2010). «Генетически модифицированные мышиные модели в исследовании рака». Advances in Cancer Research . 106 : 113–64. doi :10.1016/S0065-230X(10)06004-5. ISBN 9780123747716. PMC  3533445 . PMID  20399958.
  31. ^ Kristianto J, Johnson MG, Zastrow RK, Radcliff AB, Blank RD (июнь 2017 г.). «Спонтанная рекомбиназная активность Cre-ERT2 in vivo». Transgenic Research . 26 (3): 411–417. doi :10.1007/s11248-017-0018-1. PMC 9474299. PMID 28409408.  S2CID 4377498  . 
  32. ^ Альварес-Аснар А, Мартинес-Коррал И, Даубель Н, Бетсгольц С, Мякинен Т, Генгель К (февраль 2020 г.). «Линии Т2». Трансгенные исследования . 29 (1): 53–68. дои : 10.1007/s11248-019-00177-8. ПМЦ 7000517 . ПМИД  31641921. 
  33. ^ Harman JL, Dobnikar L, Chappell J, Stokell BG, Dalby A, Foote K и др. (ноябрь 2019 г.). «Эпигенетическая регуляция гладкомышечных клеток сосудов с помощью диметилирования лизина 9 гистона H3 ослабляет индукцию гена-мишени воспалительной сигнализацией». Артериосклероз , тромбоз и сосудистая биология . 39 (11): 2289–2302. doi :10.1161/ATVBAHA.119.312765. PMC 6818986. PMID  31434493. 
  34. ^ Chappell J, Harman JL, Narasimhan VM, Yu H, Foote K, Simons BD и др. (декабрь 2016 г.). «Обширная пролиферация подмножества дифференцированных, но пластичных медиальных сосудистых гладкомышечных клеток способствует формированию неоинтимы в моделях травм и атеросклероза у мышей». Circulation Research . 119 (12): 1313–1323. doi :10.1161/CIRCRESAHA.116.309799. PMC 5149073. PMID  27682618 . 
  35. ^ Herring BP, Hoggatt AM, Burlak C, Offermanns S (2014). «Ранее дифференцированные медиальные сосудистые гладкомышечные клетки способствуют образованию неоинтимы после повреждения сосудов». Vascular Cell . 6 (1): 21. doi : 10.1186/2045-824X-6-21 . PMC 4193961 . PMID  25309723. 
  36. ^ Shankman LS, Gomez D, Cherepanova OA, Salmon M, Alencar GF, Haskins RM и др. (июнь 2015 г.). «KLF4-зависимая фенотипическая модуляция гладкомышечных клеток играет ключевую роль в патогенезе атеросклеротических бляшек». Nature Medicine . 21 (6): 628–37. doi :10.1038/nm.3866. PMC 4552085 . PMID  25985364. 
  37. ^ Albarrán-Juárez J, Kaur H, Grimm M, Offermanns S, Wettschureck N (август 2016 г.). «Отслеживание линий клеток, участвующих в атеросклерозе». Атеросклероз . 251 : 445–453. doi : 10.1016/j.atherosclerosis.2016.06.012 . PMID  27320174.
  38. ^ Dobnikar L, Taylor AL, Chappell J, Oldach P, Harman JL, Oerton E и др. (ноябрь 2018 г.). «Транскрипционные сигнатуры, имеющие отношение к заболеванию, выявленные в отдельных гладкомышечных клетках здоровых сосудов мыши». Nature Communications . 9 (1): 4567. Bibcode :2018NatCo...9.4567D. doi :10.1038/s41467-018-06891-x. PMC 6212435 . PMID  30385745. 
  39. ^ ab Łobocka MB, Rose DJ, Plunkett G, Rusin M, Samojedny A, Lehnherr H, et al. (Ноябрь 2004). "Геном бактериофага P1". Journal of Bacteriology . 186 (21): 7032–68. doi :10.1128/JB.186.21.7032-7068.2004. PMC 523184 . PMID  15489417. 
  40. ^ Стернберг Н., Хёсс Р. (1983). «Молекулярная генетика бактериофага P1». Annual Review of Genetics . 17 (1): 123–54. doi :10.1146/annurev.ge.17.120183.001011. PMID  6364958.
  41. ^ Ламберт, Джоланда М.; Бонгерс, Роджер С.; Клееребезем, Михиль (2007). «Система на основе Crelox для множественных делеций генов и удаления селективных маркеров в Lactobacillus plantarum». Прикладная и экологическая микробиология . 73 (4): 1126–1135. Bibcode : 2007ApEnM..73.1126L. doi : 10.1128/AEM.01473-06. PMC 1828656. PMID 17142375  . 
  42. ^ Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA и др. (ноябрь 2007 г.). «Трансгенные стратегии комбинаторной экспрессии флуоресцентных белков в нервной системе». Редакционное резюме («Over the brainbow»). Nature . 450 (7166): 56–62. Bibcode :2007Natur.450...56L. doi :10.1038/nature06293. PMID  17972876. S2CID  4402093.

Внешние ссылки