Суперспирализация ДНК относится к количеству скручивания в конкретной цепи ДНК , которое определяет количество деформации на ней. Данная цепь может быть «положительно суперспирализованной» или «отрицательно суперспирализованной» (более или менее плотно скрученной). Количество суперспирализации цепи влияет на ряд биологических процессов, таких как уплотнение ДНК и регулирование доступа к генетическому коду (что сильно влияет на метаболизм ДНК и, возможно, экспрессию генов). Некоторые ферменты, такие как топоизомеразы , изменяют количество суперспирализации ДНК для облегчения таких функций, как репликация и транскрипция ДНК . [1] Количество суперспирализации в данной цепи описывается математической формулой, которая сравнивает ее с эталонным состоянием, известным как «расслабленная B-форма» ДНК.
В «расслабленном» сегменте двойной спирали B-ДНК две нити закручиваются вокруг оси спирали один раз на каждые 10,4–10,5 пар оснований последовательности . Добавление или вычитание скручиваний, как это делают некоторые ферменты , накладывает напряжение. Если сегмент ДНК под напряжением скручивания замкнуть в круг, соединив два его конца, а затем позволить ему свободно двигаться, он примет другую форму, например, восьмерку. Такая форма называется суперспиралью . (Форма существительного «суперспираль» часто используется при описании топологии ДНК .)
ДНК большинства организмов обычно отрицательно суперспирализована. Она временно становится положительно суперспирализованной, когда реплицируется или транскрибируется. Эти процессы подавляются (регулируются), если она не расслабляется быстро. Простейшая форма суперспирали — это восьмерка; круговая цепь ДНК принимает эту форму, чтобы вместить больше или меньше спиральных поворотов. Две доли восьмерки будут казаться повернутыми либо по часовой стрелке, либо против часовой стрелки относительно друг друга, в зависимости от того, перекручена или недокручена спираль. Для каждого дополнительного спирального поворота, который вмещается, доли будут показывать еще один поворот вокруг своей оси. [2]
Лобальные искривления кольцевой ДНК, такие как вращение восьмерки выше, называются скручиванием . Приведенный выше пример иллюстрирует, что скручивание и скручивание взаимозаменяемы. Суперспирализация может быть представлена математически суммой скручивания и скручивания. Скручивание — это количество спиральных витков в ДНК, а скручивание — это количество раз, когда двойная спираль пересекает сама себя (это суперспирали). Дополнительные спиральные повороты положительны и приводят к положительной суперспирализации, в то время как вычитающее скручивание вызывает отрицательную суперспирализацию. Многие ферменты топоизомеразы чувствуют суперспирализацию и либо генерируют, либо рассеивают ее, изменяя топологию ДНК.
Отчасти потому, что хромосомы могут быть очень большими, сегменты в середине могут действовать так, как будто их концы закреплены. В результате они могут быть неспособны распределить избыточное скручивание по остальной части хромосомы или поглотить скручивание, чтобы восстановиться после недокручения — сегменты могут стать сверхспирализованными , другими словами. В ответ на сверхспирализацию они примут некоторую степень скручивания, как если бы их концы были соединены.
Суперспиральная ДНК образует две структуры: плектонему или тороид , или их комбинацию. Отрицательно суперспиральная молекула ДНК образует либо однозаходную левую спираль, тороид, либо двухзаходную правую спираль с концевыми петлями, плектонему. Плектонемы, как правило, более распространены в природе, и именно такую форму принимают большинство бактериальных плазмид . Для более крупных молекул обычно образуются гибридные структуры — петля на тороиде может расширяться в плектонему. Если все петли на тороиде расширяются, то он становится точкой разветвления в плектонемической структуре. Суперспирализация ДНК важна для упаковки ДНК во всех клетках и, по-видимому, также играет роль в экспрессии генов. [3] [4]
На основе свойств интеркалирующих молекул, т. е. флуоресценции при связывании с ДНК и раскручивании пар оснований ДНК, в 2016 году была введена одномолекулярная техника для прямой визуализации отдельных плектонем вдоль суперспирализованной ДНК [5] , что в дальнейшем позволит изучать взаимодействия белков, обрабатывающих ДНК, с суперспирализованной ДНК. В этом исследовании Sytox Orange (интеркалирующий краситель) использовался для индукции суперспирализации на молекулах ДНК, связанных с поверхностью.
С помощью этого анализа было обнаружено, что последовательность ДНК кодирует положение плектонемических супервитков. [6] Кроме того, было обнаружено, что супервитки ДНК обогащены в местах начала транскрипции у прокариот .
Суперспирализация ДНК важна для упаковки ДНК во всех клетках. Поскольку длина ДНК может быть в тысячи раз больше длины клетки, упаковка этого генетического материала в клетку или ядро (у эукариот ) является сложной задачей. Суперспирализация ДНК уменьшает пространство и позволяет упаковывать ДНК. У прокариот преобладают плектонемические суперспирали из-за кольцевой хромосомы и относительно небольшого количества генетического материала. У эукариот суперспирализация ДНК существует на многих уровнях как плектонемических, так и соленоидальных суперспиралей, причем соленоидальная суперспирализация оказывается наиболее эффективной для уплотнения ДНК. Соленоидальная суперспирализация достигается с помощью гистонов для формирования волокна 10 нм. Это волокно далее скручивается в волокно 30 нм и далее накручивается само на себя во много раз больше.
Упаковка ДНК значительно увеличивается во время митоза , когда дублированные сестринские ДНК разделяются в дочерние клетки. Было показано, что конденсин , большой белковый комплекс, который играет центральную роль в сборке митотических хромосом, индуцирует положительные суперспирали в зависимости от гидролиза АТФ in vitro . [7] [8] Суперспирализация также может играть важную роль во время интерфазы в формировании и поддержании топологически ассоциированных доменов (TAD). [9]
Суперспирализация также необходима для синтеза ДНК/РНК . Поскольку ДНК должна быть раскручена для действия ДНК/РНК- полимеразы , в результате образуются суперспирали. Область перед комплексом полимеразы будет раскручена; это напряжение компенсируется положительными суперспиралями перед комплексом. За комплексом ДНК перематывается, и будут компенсаторные отрицательные суперспирали. Топоизомеразы, такие как ДНК-гираза (топоизомераза типа II), играют роль в снятии части напряжения во время синтеза ДНК/РНК. [10]
У многих видов бактерий барьеры для диффузии суперспирали делят геном на ряд топологически изолированных доменов суперспирали (SD). [11] Эти SD играют важную роль в организации нуклеоида . SD в среднем отрицательно суперспирализованы, но иногда могут быть и положительно суперспирализованы. Степень суперспирализации может варьироваться в ответ на различные формы стресса и влияет на связывание различных белков, ассоциированных с нуклеоидом (NAP), которые дополнительно организуют бактериальный геном. [12] Например, было показано, что Dps из E. coli связывает суперспирализованную ДНК гораздо быстрее, чем торсионно расслабленную ДНК. [13]
Специализированные белки могут расстегивать небольшие сегменты молекулы ДНК, когда она реплицируется или транскрибируется в РНК . Но работа, опубликованная в 2015 году, иллюстрирует, как ДНК раскрывается сама по себе. [3] [4]
Простое скручивание ДНК может выставить внутренние основания наружу, без помощи каких-либо белков. Кроме того, сама транскрипция искажает ДНК в живых человеческих клетках, сжимая некоторые части спирали и ослабляя ее в других. Этот стресс вызывает изменения в форме, в частности, открывая спираль для считывания. К сожалению, эти взаимодействия очень трудно изучать, поскольку биологические молекулы очень легко меняют форму. В 2008 году было отмечено, что транскрипция скручивает ДНК, оставляя след недоспирализованной (или отрицательно сверхспирализованной) ДНК на своем пути. Более того, они обнаружили, что сама последовательность ДНК влияет на то, как молекула реагирует на сверхспирализацию. [3] [4]
Например, исследователи определили определенную последовательность ДНК, которая регулирует скорость транскрипции; по мере того, как количество суперспирали увеличивается и уменьшается, она замедляет или ускоряет темп, с которым молекулярный аппарат считывает ДНК. [3] Предполагается, что эти структурные изменения могут вызывать стресс в другом месте по всей длине, что, в свою очередь, может обеспечить точки запуска для репликации или экспрессии генов. [3] [4] Это означает, что это очень динамичный процесс, в котором и ДНК, и белки влияют друг на друга, как действуют и реагируют. [3]
Почти половина генов бактерии E. coli, которые репрессируются во время холодового шока, аналогичным образом репрессируются, когда гираза блокируется антибиотиком новобиоцином. [14] Более того, во время холодового шока увеличивается плотность нуклеоидов, а белок гираза и нуклеоид становятся колокализованными (что согласуется с уменьшением релаксации ДНК). Это свидетельствует о том, что уменьшение отрицательной суперспирализации ДНК является одним из основных механизмов, ответственных за блокировку транскрипции половины генов, которые осуществляют программу транскрипционного ответа бактерий на холодовой шок. На основании этого была предложена стохастическая модель этого процесса. Эта модель проиллюстрирована на рисунке, где реакции 1 представляют транскрипцию и ее блокировку из-за суперспирализации. Между тем, реакции 2–4 моделируют, соответственно, трансляцию и деградацию РНК и белка. [14]
В природе кольцевая ДНК всегда изолирована как спираль более высокого порядка-на-спирали, известная как суперспираль . В обсуждениях этой темы скручивание Уотсона-Крика упоминается как «вторичная» обмотка, а суперспирали как «третичная» обмотка. На рисунке справа показана «расслабленная» или «открытая кольцевая» двойная спираль Уотсона-Крика, а рядом с ней — правосторонняя суперспираль. «Расслабленная» структура слева не обнаруживается, если хромосома не надрезана; суперспираль — это форма, обычно встречающаяся в природе.
Для целей математических вычислений правосторонняя суперспираль определяется как имеющая «отрицательное» число суперспиральных витков, а левосторонняя суперспираль определяется как имеющая «положительное» число суперспиральных витков. На рисунке (показанном справа) как вторичная ( т. е. «Уотсон-Криковская») обмотка, так и третичная ( т. е. «суперспиральная») обмотка являются правосторонними, поэтому суперскручивания отрицательны (–3 в этом примере).
Предполагается, что сверхспиральность является результатом недокручения, что означает, что существует дефицит числа вторичных скручиваний Уотсона-Крика. Такая хромосома будет растянута, как растягивается макроскопическая металлическая пружина, когда она либо перекручена, либо раскручена. В ДНК, которая растянута таким образом, появятся сверхскрученности.
Суперспирализация ДНК может быть описана численно с помощью изменений в числе связей Lk . Число связей является наиболее описательным свойством суперспирализованной ДНК. Lk o , число витков в расслабленной (тип B) плазмиде/молекуле ДНК, определяется путем деления общего числа пар оснований молекулы на расслабленное число пар оснований /виток, которое в зависимости от источника составляет 10,4; [15] 10,5; [16] [17] 10,6. [18]
Lk — это число пересечений, которые одна цепь делает с другой, часто визуализируется как число скручиваний Уотсона-Крика, обнаруженных в кольцевой хромосоме в (обычно воображаемой) плоской проекции. Это число физически «запирается» в момент ковалентного замыкания хромосомы и не может быть изменено без разрыва цепи.
Топология ДНК описывается уравнением ниже, в котором число связей эквивалентно сумме Tw , которое является числом изгибов или поворотов двойной спирали, и Wr , которое является числом витков или «извилин». Если есть закрытая молекула ДНК, сумма Tw и Wr , или число связей, не меняется. Однако могут быть дополнительные изменения в Tw и Wr без изменения их суммы:
Tw , называемый «скручиванием», — это число скручиваний Уотсона–Крика в хромосоме, когда она не ограничена лежать в плоскости. Мы уже видели, что нативная ДНК обычно оказывается сверхспиральной. Если обойти сверхспирально скрученную хромосому, подсчитывая вторичные скручивания Уотсона–Крика, это число будет отличаться от числа, подсчитанного, когда хромосома ограничена лежать плоско. В общем, ожидается, что число вторичных скручиваний в нативной сверхскрученной хромосоме будет «нормальным» числом скручиваний Уотсона–Крика, то есть один спиральный скручивание из 10 пар оснований на каждые 34 Å длины ДНК.
Wr , называемый «writhe», — это число сверхспиральных поворотов. Поскольку биологическая кольцевая ДНК обычно недокручена, Lk обычно будет меньше Tw , что означает, что Wr обычно будет отрицательным.
Если ДНК недокручена, она будет находиться под напряжением, точно так же, как растягивается металлическая пружина, если ее раскручивать с усилием, и что появление сверхскручиваний позволит хромосоме снять напряжение, приняв отрицательные сверхскручивания, которые исправляют вторичное недокручение в соответствии с приведенным выше уравнением топологии.
Топологическое уравнение показывает, что существует однозначное соответствие между изменениями Tw и Wr . Например, если удаляется вторичный «Уотсон-Криковский» поворот, то одновременно должен быть удален и правый суперповорот (или, если хромосома расслаблена, без суперповоротов, то должен быть добавлен левый суперповорот).
Изменение числа связей, Δ Lk , представляет собой фактическое число витков в плазмиде/молекуле, Lk , за вычетом числа витков в расслабленной плазмиде/молекуле Lk o :
Если ДНК отрицательно сверхспирализована, . Отрицательная сверхспирализация подразумевает, что ДНК недокручена.
Стандартным выражением, не зависящим от размера молекулы, является «специфическая разность связей» или «плотность суперспирали», обозначаемая σ , которая представляет собой число добавленных или удаленных витков относительно общего числа витков в расслабленной молекуле/плазмиде, что указывает на уровень суперспирализации.
Свободная энергия Гиббса, связанная с образованием спирали, определяется уравнением ниже [19]
Разница в свободной энергии Гиббса между суперспиральной кольцевой ДНК и раскрученной кольцевой ДНК с N > 2000 п.н. приблизительно вычисляется по формуле:
или 16 кал/бар.
Поскольку число связей L суперспирализованной ДНК — это число раз, которое две нити переплетены (и обе нити остаются ковалентно неповрежденными), L не может измениться. Исходное состояние (или параметр) L 0 кольцевого дуплекса ДНК — это его расслабленное состояние. В этом состоянии его изгиб W = 0. Поскольку L = T + W , в расслабленном состоянии T = L . Таким образом, если у нас есть расслабленный кольцевой дуплекс ДНК длиной 400 п.н., L ~ 40 (предполагая ~10 п.н. на виток в B-ДНК). Тогда T ~ 40 .
Отрицательные суперспирали благоприятствуют локальному раскручиванию ДНК, позволяя такие процессы, как транскрипция , репликация ДНК и рекомбинация . Также считается, что отрицательная суперспирализация благоприятствует переходу между B-ДНК и Z-ДНК и смягчает взаимодействия ДНК-связывающих белков, участвующих в регуляции генов . [20]
Некоторые стохастические модели были предложены для учета эффектов положительного наращивания суперспирализации (PSB) в динамике экспрессии генов (например, в экспрессии бактериальных генов), различаясь, например, по уровню детализации. В целом, детализация увеличивается при добавлении процессов, затронутых и влияющих на суперспирализацию. По мере того, как происходит это добавление, сложность модели увеличивается.
Например, в [21] предложены две модели разной сложности. В наиболее подробной из них события моделировались на уровне нуклеотидов, а в другой — только на уровне промотора, и, таким образом, требовалось учитывать гораздо меньше событий.
Примеры стохастических моделей, которые фокусируются на эффектах PSB на активность промотора, можно найти в:. [22] [23] В целом, такие модели включают промотор, Pro, который является областью ДНК, контролирующей транскрипцию, и, таким образом, на активность/блокировку которой влияет PSB. Также включены молекулы РНК (продукт транскрипции), РНК-полимеразы (РНКП), которые контролируют транскрипцию, и гиразы (G), которые регулируют PSB. Наконец, необходимо иметь средство для количественной оценки PSB на ДНК (т. е. промотора) в любой заданный момент. Это можно сделать, имея некоторый компонент в системе, который производится с течением времени (например, во время событий транскрипции) для представления положительных супервитков, и который удаляется под действием гираз. Затем можно задать количество этого компонента, которое будет влиять на скорость транскрипции.
Топологические свойства кольцевой ДНК сложны. В стандартных текстах эти свойства неизменно объясняются в терминах спиральной модели ДНК, но в 2008 году было отмечено, что каждый топоизомер, отрицательный или положительный, принимает уникальное и удивительно широкое распределение трехмерных конформаций. [4]
Когда коэффициент седиментации, s , кольцевой ДНК определяется в широком диапазоне pH , видны следующие кривые. Здесь показаны три кривые, представляющие три вида ДНК. Сверху вниз они следующие: «Форма IV» (зеленая), «Форма I» (синяя) и «Форма II» (красная).
«Форма I» (синяя кривая) — это традиционная номенклатура, используемая для нативной формы дуплексной кольцевой ДНК, полученной из вирусов и внутриклеточных плазмид. Форма I ковалентно закрыта, и любая плектонемическая обмотка, которая может присутствовать, поэтому заблокирована. Если в Форму I вводится один или несколько надрезов, становится возможным свободное вращение одной нити относительно другой, и наблюдается Форма II (красная кривая).
Форма IV (зеленая кривая) является продуктом щелочной денатурации Формы I. Ее структура неизвестна, за исключением того, что она устойчиво дуплексная и чрезвычайно плотная.
Между pH 7 и pH 11,5 коэффициент седиментации s для формы I постоянен. Затем он падает и при pH чуть ниже 12 достигает минимума. При дальнейшем повышении pH s возвращается к своему прежнему значению. Однако он не останавливается на этом, а продолжает неуклонно расти. К pH 13 значение s возрастает почти до 50, в два-три раза больше значения при pH 7, что указывает на чрезвычайно компактную структуру.
Если затем понизить pH, значение s не восстанавливается. Вместо этого мы видим верхнюю зеленую кривую. ДНК, которая теперь находится в состоянии, известном как Форма IV, остается чрезвычайно плотной, даже если pH восстанавливается до исходного физиологического диапазона. Как уже говорилось ранее, структура Формы IV почти полностью неизвестна, и в настоящее время нет общепринятого объяснения ее необычайной плотности. Все, что известно о третичной структуре, это то, что она дуплексная, но не имеет водородных связей между основаниями.
Такое поведение Форм I и IV, как полагают, обусловлено особыми свойствами дуплексной ДНК, которая ковалентно замкнута в двухцепочечный круг. Если ковалентная целостность нарушается даже одним надрезом в одной из цепей, все такое топологическое поведение прекращается, и можно увидеть нижнюю кривую Формы II (Δ). Для Формы II изменения pH оказывают очень малое влияние на s . Ее физические свойства, в целом, идентичны свойствам линейной ДНК. При pH 13 нити Формы II просто разделяются, как и нити линейной ДНК. Разделенные одиночные нити имеют немного разные значения s , но не демонстрируют существенных изменений в s при дальнейшем увеличении pH.
Полное объяснение этих данных выходит за рамки этой статьи. Вкратце, изменения в s происходят из-за изменений в суперспиральности кольцевой ДНК. Эти изменения в суперспиральности схематически проиллюстрированы четырьмя маленькими рисунками, которые были стратегически наложены на рисунок выше.
Вкратце, изменения s , наблюдаемые на кривой титрования pH выше, как широко распространено считается, вызваны изменениями в суперспиральной обмотке ДНК в условиях повышения pH. До pH 11,5 предполагаемое «недозакручивание» производит правостороннюю («отрицательную») суперзакрутку. Но по мере повышения pH, когда вторичная спиральная структура начинает денатурировать и раскручиваться, хромосома (если можно так выразиться антропоморфно) больше не «хочет» иметь полную обмотку Уотсона-Крика, а скорее «хочет», все больше, быть «недозакрученной». Поскольку все меньше и меньше напряжения, которое можно снять суперспиральной обмоткой, суперспирали, следовательно, постепенно исчезают по мере повышения pH. При pH чуть ниже 12 все стимулы для суперспиральности исчезают, и хромосома будет выглядеть как расслабленный, открытый круг.
При еще более высоком pH хромосома, которая теперь денатурирует всерьез, имеет тенденцию полностью раскручиваться, чего она сделать не может (потому что L k ковалентно заперта). В этих условиях то, что когда-то рассматривалось как «недокручение», на самом деле теперь стало «перекручением». Снова возникает напряжение, и снова оно (по крайней мере частично) снимается суперспиральностью, но на этот раз в противоположном направлении ( т. е. левостороннее или «положительное»). Каждое левостороннее третичное суперскручивание удаляет одно, теперь нежелательное правостороннее вторичное скручивание Уотсона-Крика.
Титрование заканчивается при pH 13, где появляется Форма IV.