Спектрофотометрия — это раздел электромагнитной спектроскопии , занимающийся количественным измерением свойств отражения или пропускания материала в зависимости от длины волны. [2] В спектрофотометрии используются фотометры , известные как спектрофотометры, которые могут измерять интенсивность светового луча на разных длинах волн. Хотя спектрофотометрия чаще всего применяется к ультрафиолетовому, видимому и инфракрасному излучению, современные спектрофотометры могут исследовать широкие диапазоны электромагнитного спектра , включая рентгеновские , ультрафиолетовые , видимые , инфракрасные и/или микроволновые длины волн.
Спектрофотометрия — это инструмент, основанный на количественном анализе молекул в зависимости от того, сколько света поглощается окрашенными соединениями. Важными характеристиками спектрофотометров являются спектральная полоса пропускания (диапазон цветов, которые он может передавать через исследуемый образец), процент пропускания образца, логарифмический диапазон поглощения образца, а иногда и процент измерения отражательной способности.
Спектрофотометр обычно используется для измерения коэффициента пропускания или отражения растворов, прозрачных или непрозрачных твердых веществ, таких как полированное стекло, или газов. Хотя многие биохимические вещества окрашены, например, они поглощают видимый свет и, следовательно, могут быть измерены с помощью колориметрических процедур, даже бесцветные биохимические вещества часто можно превратить в окрашенные соединения, подходящие для хромогенных реакций образования цвета с получением соединений, пригодных для колориметрического анализа. [3] : 65 Однако их также можно спроектировать для измерения коэффициента диффузии в любом из перечисленных световых диапазонов, которые обычно охватывают около 200–2500 нм, с использованием различных элементов управления и калибровок . [2] В этих диапазонах света необходима калибровка машины с использованием стандартов, тип которых различается в зависимости от длины волны фотометрического определения . [4]
Примером эксперимента, в котором используется спектрофотометрия, является определение константы равновесия раствора. Определенная химическая реакция в растворе может происходить в прямом и обратном направлении, при которой реагенты образуют продукты, а продукты распадаются на реагенты. В какой-то момент эта химическая реакция достигнет точки равновесия, называемой точкой равновесия. Чтобы определить соответствующие концентрации реагентов и продуктов на этом этапе, можно проверить светопропускание раствора с помощью спектрофотометрии. Количество света, проходящего через раствор, указывает на концентрацию определенных химических веществ, которые не пропускают свет.
Поглощение света происходит за счет взаимодействия света с электронными и колебательными модами молекул. Молекула каждого типа имеет индивидуальный набор энергетических уровней, связанных с составом ее химических связей и ядер, и, таким образом, поглощает свет определенных длин волн или энергий, что приводит к уникальным спектральным свойствам. [5] Это основано на его специфическом и отчетливом составе.
Использование спектрофотометров охватывает различные научные области, такие как физика , материаловедение , химия , биохимия , химическая инженерия и молекулярная биология . [6] Они широко используются во многих отраслях промышленности, включая производство полупроводников, лазерное и оптическое производство, полиграфию и судебно-медицинскую экспертизу, а также в лабораториях по исследованию химических веществ. Спектрофотометрия часто используется для измерения активности ферментов, определения концентрации белка, определения ферментативных кинетических констант и измерения реакций связывания лигандов. [3] : 65 В конечном счете, спектрофотометр способен определить, в зависимости от контроля или калибровки, какие вещества присутствуют в мишени и в каком именно количестве, путем расчета наблюдаемых длин волн.
В астрономии термин «спектрофотометрия» относится к измерению спектра небесного объекта , при котором шкала потока спектра калибруется как функция длины волны , обычно путем сравнения с наблюдением спектрофотометрической стандартной звезды, и корректируется за поглощение. света атмосферой Земли. [7]
Спектрофотометр , изобретенный Арнольдом О. Бекманом в 1940 году [ оспаривается ] , был создан с помощью его коллег из его компании National Tech Laboratories, основанной в 1935 году, которая впоследствии стала Beckman Instrument Company и, в конечном итоге, Beckman Coulter . Это могло бы стать решением проблемы ранее созданных спектрофотометров, которые не могли правильно поглощать ультрафиолет. Он начал с изобретения модели А, в которой использовалась стеклянная призма для поглощения ультрафиолетового света. Было обнаружено, что это не дало удовлетворительных результатов, поэтому в модели B произошел переход от стекла к кварцевой призме, что позволило получить лучшие результаты по поглощению. После этого родилась Модель C с корректировкой разрешения по длине волны, в результате чего было произведено три ее единицы. Последней и самой популярной моделью стала модель D, которая сейчас более известна как спектрофотометр DU , который содержал корпус прибора, водородную лампу с ультрафиолетовым континуумом и улучшенный монохроматор. [8] Он производился с 1941 по 1976 год, цена на него в 1941 году составляла 723 доллара США (аксессуары для дальнего ультрафиолета можно было приобрести за дополнительную плату). По словам нобелевского лауреата по химии Брюса Меррифилда , это был «вероятно, самый важный инструмент, когда-либо разработанный для развития биологической науки». [9]
После прекращения производства в 1976 году [10] компания Hewlett-Packard в 1979 году создала первый коммерчески доступный спектрофотометр с диодной матрицей, известный как HP 8450A. [11] Спектрофотометры с диодной матрицей отличались от оригинального спектрофотометра, созданного Бекманом, потому что это был первый однолучевой спектрофотометр с микропроцессорным управлением, который сканировал несколько длин волн одновременно за секунды. Он облучает образец полихроматическим светом, который образец поглощает в зависимости от своих свойств. Затем он передается обратно через решетку фотодиодной матрицы, которая обнаруживает область длины волны спектра. [12] С тех пор создание и внедрение спектрофотометрических устройств значительно возросло и стало одним из самых инновационных инструментов нашего времени.
Существует два основных класса устройств: однолучевые и двухлучевые. Двухлучевой спектрофотометр [13] сравнивает интенсивность света между двумя световыми путями, один из которых содержит эталонный образец, а другой — тестируемый образец. Однолучевой спектрофотометр измеряет относительную интенсивность света луча до и после введения тестируемого образца. Хотя сравнительные измерения с помощью двухлучевых приборов проще и стабильнее, однолучевые приборы могут иметь больший динамический диапазон, оптически проще и компактнее. Кроме того, некоторые специализированные инструменты, такие как спектрофотометры, встроенные в микроскопы или телескопы, из-за практичности являются однолучевыми приборами.
Исторически сложилось так, что в спектрофотометрах для получения аналитического спектра использовался монохроматор с дифракционной решеткой . Решетка может быть как подвижной, так и фиксированной. Если используется один детектор, такой как фотоумножитель или фотодиод , решетку можно сканировать поэтапно (сканирующий спектрофотометр), так что детектор может измерять интенсивность света на каждой длине волны (которая будет соответствовать каждому «шагу»). Также можно использовать матрицы детекторов (матрицный спектрофотометр), такие как устройства с зарядовой связью (CCD) или фотодиодные матрицы (PDA). В таких системах решетка фиксирована, а интенсивность каждой длины волны света измеряется отдельным детектором в матрице. Кроме того, большинство современных спектрофотометров среднего инфракрасного диапазона используют метод преобразования Фурье для получения спектральной информации. Этот метод называется инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье .
При измерении пропускания спектрофотометр количественно сравнивает долю света, прошедшую через эталонный раствор и тестируемый раствор, затем в электронном виде сравнивает интенсивности двух сигналов и вычисляет процент пропускания образца по сравнению с эталонным стандартом. Для измерения коэффициента отражения спектрофотометр количественно сравнивает долю света, отражающуюся от эталонного и тестируемого образцов. Свет от лампы-источника проходит через монохроматор, который преломляет свет в «радугу» длин волн через вращающуюся призму и выводит узкие полосы этого дифрагированного спектра через механическую щель на выходной стороне монохроматора. Эти полосы пропускания передаются через тестовый образец. Затем плотность потока фотонов (обычно ватты на квадратный метр) прошедшего или отраженного света измеряется с помощью фотодиода, устройства с зарядовой связью или другого датчика освещенности . Затем значение пропускания или отражения для каждой длины волны испытуемого образца сравнивается со значениями пропускания или отражения эталонного образца . Большинство приборов применяют логарифмическую функцию к линейному коэффициенту пропускания для расчета «поглощающей способности» образца, величины, которая пропорциональна «концентрации» измеряемого химического вещества.
Вкратце, последовательность событий в сканирующем спектрофотометре следующая:
В матричном спектрофотометре последовательность действий следующая: [14]
Многие старые спектрофотометры необходимо калибровать с помощью процедуры, известной как «обнуление», чтобы сбалансировать нулевой выходной ток двух лучей на детекторе. Пропускание эталонного вещества устанавливается как базовое (базовое) значение, поэтому пропускание всех остальных веществ регистрируется относительно исходного «обнуленного» вещества. Затем спектрофотометр преобразует коэффициент пропускания в «поглощающую способность», концентрацию конкретных компонентов испытуемого образца по отношению к исходному веществу. [6]
Спектрофотометрия — важный метод, используемый во многих биохимических экспериментах, включающих выделение ДНК, РНК и белков, кинетику ферментов и биохимический анализ. [15] Поскольку образцы в этих целях не всегда доступны в больших количествах, они особенно подходят для анализа с помощью этого неразрушающего метода. Кроме того, ценный образец можно сохранить, используя платформу микрообъемов, где для полного анализа требуется всего 1 мкл образца. [16] Краткое объяснение процедуры спектрофотометрии включает сравнение поглощательной способности холостого образца, не содержащего окрашенного соединения, с образцом, содержащим окрашенное соединение. Это окрашивание может быть достигнуто либо с помощью красителя, такого как краситель Coomasie Brilliant Blue G-250, измеренного при длине волны 595 нм, либо с помощью ферментативной реакции, наблюдаемой между β-галактозидазой и ONPG (окрашивает образец в желтый цвет), измеренной при 420 нм. [3] : 21–119 Спектрофотометр используется для измерения окрашенных соединений в видимой области света (между 350 и 800 нм), [3] : 65, таким образом, его можно использовать для получения дополнительной информации об изучаемом веществе. В биохимических экспериментах выбирается химическое и/или физическое свойство, и используемая процедура специфична для этого свойства, чтобы получить больше информации об образце, такой как количество, чистота, активность фермента и т. д. Можно использовать спектрофотометрию. для ряда методов, таких как определение оптимальной оптической плотности образцов по длине волны, определение оптимального pH для оптической плотности образцов, определение концентраций неизвестных образцов и определение pKa различных образцов. [3] : 21–119 Спектрофотометрия также является полезным процессом очистки белков [17] , а также может использоваться как метод оптического анализа соединения. Спектрофотометрические данные также можно использовать в сочетании с уравнением Бера-Ламберта для определения различных взаимосвязей между пропусканием и концентрацией, а также поглощением и концентрацией. [3] : 21–119 Поскольку спектрофотометр измеряет длину волны соединения по его цвету, можно добавить вещество, связывающее краситель, чтобы оно могло изменить цвет и быть измерено. [18] Концентрацию двухкомпонентной смеси можно узнать, используя спектры поглощения стандартных растворов каждого компонента. Для этого необходимо знать коэффициент экстинкции этой смеси на двух длинах волн и коэффициенты экстинкции растворов, содержащих известные массы двух компонентов. [19]В дополнение к традиционной модели закона Бера-Ламберта можно использовать спектроскопию без меток на основе кювет, которая добавляет оптический фильтр на пути света, позволяя спектрофотометру количественно определять концентрацию, размер и показатель преломления образцов в соответствии с законом рук. [20] Спектрофотометры разрабатывались и совершенствовались на протяжении десятилетий и широко использовались химиками. Кроме того, спектрофотометры специализируются на измерении значений поглощения длины волны ультрафиолетового или видимого света. [3] : 21–119 Считается, что это высокоточный инструмент, который также очень чувствителен и, следовательно, чрезвычайно точен, особенно при определении изменения цвета. [21] Этот метод также удобен для использования в лабораторных экспериментах, поскольку это недорогой и относительно простой процесс.
Большинство спектрофотометров используются в УФ- и видимой областях спектра, а некоторые из этих приборов работают также и в ближней инфракрасной области. Концентрацию белка можно оценить путем измерения ОП при 280 нм благодаря присутствию триптофана, тирозина и фенилаланина. Этот метод не очень точен, поскольку состав белков сильно различается, а белки, не содержащие ни одной из этих аминокислот, не имеют максимального поглощения при 280 нм. Загрязнение нуклеиновыми кислотами также может мешать. Для этого метода требуется спектрофотометр, способный проводить измерения в УФ-диапазоне с помощью кварцевых кювет. [3] : 135
Ультрафиолетово-видимая (УФ-видимая) спектроскопия включает энергетические уровни, которые возбуждают электронные переходы. Поглощение УФ- и видимого света переводит молекулы, находящиеся в основном состоянии, в возбужденные состояния. [5]
Спектрофотометрия видимой области 400–700 нм широко используется в колориметрии . Известно, что лучше всего он работает в диапазоне 0,2–0,8 OD. Производителям чернил, полиграфическим компаниям, продавцам текстиля и многим другим необходимы данные, полученные с помощью колориметрии. Они снимают показания в диапазоне каждых 5–20 нанометров в видимой области и создают кривую спектрального отражения или поток данных для альтернативных представлений. Эти кривые можно использовать для тестирования новой партии красителя, чтобы проверить, соответствует ли она спецификациям, например стандартам печати ISO.
Традиционные спектрофотометры видимой области не могут обнаружить флуоресценцию красителя или основного материала. Это может затруднить решение проблем с цветом, если, например, одна или несколько печатных красок являются флуоресцентными. Если краситель содержит флуоресценцию, используется биспектральный флуоресцентный спектрофотометр. Существует две основные установки спектрофотометров визуального спектра: d/8 (сферическая) и 0/45. Названия обусловлены геометрией источника света, наблюдателя и внутренней части измерительной камеры. Ученые используют этот прибор для измерения количества соединений в образце. Если соединение более концентрированное, образец будет поглощать больше света; в небольших диапазонах соблюдается закон Бера-Ламберта , и оптическая плотность между образцами изменяется в зависимости от концентрации линейно. В случае измерений при печати обычно используются две альтернативные настройки: без/с УФ-фильтром, чтобы лучше контролировать воздействие УФ-осветлителей на бумагу.
Образцы обычно готовят в кюветах ; в зависимости от интересующей области они могут быть изготовлены из стекла , пластика (интересующая область видимого спектра) или кварца (интересующая область дальнего УФ-спектра). В некоторых приложениях требуются измерения небольших объемов, которые можно выполнить с помощью платформ микрообъемов.
Как описано в разделе «Приложения», спектрофотометрию можно использовать как для качественного, так и для количественного анализа ДНК, РНК и белков. Можно использовать качественный анализ, а спектрофотометры используются для регистрации спектров соединений путем сканирования широких диапазонов длин волн для определения свойств поглощения (интенсивности цвета) соединения на каждой длине волны. [5] Одним из экспериментов, который может продемонстрировать различные возможности применения видимой спектрофотометрии, является выделение β-галактозидазы из смеси различных белков. По большому счету, спектрофотометрию лучше всего использовать для количественной оценки степени очистки вашего образца по отношению к общей концентрации белка. С помощью аффинной хроматографии B-галактозидазу можно выделить и протестировать путем взаимодействия собранных образцов с орто-нитрофенил-β-галактозидом (ONPG) и определения того, станет ли образец желтым. [3] : 21–119 . После этого тестирования образца при 420 нм на специфическое взаимодействие с ONPG и при 595 для анализа Брэдфорда степень очистки можно оценить количественно. [3] : 21–119 В дополнение к этому спектрофотометрию можно использовать в тандеме с другими методами, такими как SDS-Page-электрофорез, для очистки и выделения различных образцов белка.
Спектрофотометры, предназначенные для инфракрасной области, сильно отличаются техническими требованиями к измерениям в этой области. Одним из основных факторов является тип фотосенсоров, которые доступны для разных спектральных областей, но измерение инфракрасного излучения также является сложной задачей, поскольку практически все излучает ИК-излучение в виде теплового излучения, особенно на длинах волн более 5 мкм.
Другая сложность заключается в том, что многие материалы, такие как стекло и пластик, поглощают инфракрасное излучение, что делает его несовместимым в качестве оптической среды. Идеальными оптическими материалами являются соли , которые не сильно поглощают свет. Образцы для ИК-спектрофотометрии можно намазать между двумя дисками бромида калия или растереть с бромидом калия и спрессовать в таблетку. Если необходимо измерить водные растворы, для изготовления ячейки используется нерастворимый хлорид серебра .
Спектрорадиометры , которые работают почти как спектрофотометры видимой области, предназначены для измерения спектральной плотности источников света. Приложения могут включать оценку и категоризацию продаваемого освещения производителем или покупателями для подтверждения того, что лампа, которую они решили приобрести, соответствует их спецификациям. Компоненты:
