Контрольные точки клеточного цикла являются контрольными механизмами в эукариотическом клеточном цикле , которые обеспечивают его правильное развитие. Каждая контрольная точка служит потенциальной точкой завершения клеточного цикла , в течение которой оцениваются условия клетки, при этом прогрессирование через различные фазы клеточного цикла происходит только при соблюдении благоприятных условий. В клеточном цикле существует множество контрольных точек, [1] но три основные из них: контрольная точка G1, также известная как начальная или ограничительная контрольная точка или основная контрольная точка; контрольная точка G2/M ; и переход метафазы в анафазу, также известный как контрольная точка веретена . [2] Прохождение через эти контрольные точки в значительной степени определяется активацией циклин-зависимых киназ регуляторными белковыми субъединицами , называемыми циклинами , различные формы которых вырабатываются на каждой стадии клеточного цикла для контроля конкретных событий, которые в нем происходят. [3] [4]
Все живые организмы являются продуктами повторяющихся раундов роста и деления клеток. [5] Во время этого процесса, известного как клеточный цикл , клетка дублирует свое содержимое, а затем делится надвое. Целью клеточного цикла является точное дублирование ДНК каждого организма, а затем равномерное разделение клетки и ее содержимого между двумя полученными клетками. У эукариот клеточный цикл состоит из четырех основных стадий: G 1 , во время которой клетка метаболически активна и непрерывно растет; S-фаза , во время которой происходит репликация ДНК; G 2 , во время которой продолжается рост клетки, и клетка синтезирует различные белки, готовясь к делению; и фаза M ( митоз ), во время которой дублированные хромосомы (известные как сестринские хроматиды ) разделяются на два дочерних ядра, и клетка делится на две дочерние клетки, каждая с полной копией ДНК. [6] По сравнению с эукариотическим клеточным циклом, прокариотический клеточный цикл (известный как бинарное деление ) относительно прост и быстр: хромосома реплицируется из точки начала репликации, собирается новая мембрана, а клеточная стенка образует перегородку, которая разделяет клетку на две части. [7]
Поскольку эукариотический клеточный цикл является сложным процессом, эукариоты развили сеть регуляторных белков, известную как система контроля клеточного цикла , которая отслеживает и диктует прогрессирование клетки через клеточный цикл. [5] Эта система действует как таймер или часы, которые устанавливают фиксированное количество времени, которое клетка должна провести в каждой фазе клеточного цикла, и в то же время она также реагирует на информацию, полученную от процессов, которые она контролирует. Контрольные точки клеточного цикла играют важную роль в системе контроля, распознавая дефекты, возникающие во время основных процессов, таких как репликация ДНК или сегрегация хромосом , и вызывая остановку клеточного цикла в ответ до тех пор, пока дефекты не будут исправлены. [8] Основной механизм действия контрольных точек клеточного цикла заключается в регуляции активности семейства протеинкиназ, известных как циклинзависимые киназы (CDK), которые связываются с различными классами регуляторных белков, известных как циклины , при этом специфические комплексы циклин-CDK образуются и активируются на различных фазах клеточного цикла. Эти комплексы, в свою очередь, активируют различные нисходящие мишени, способствуя или предотвращая прогрессирование клеточного цикла. [9]
Контрольная точка G1, также известная как точка рестрикции в клетках млекопитающих и начальная точка в дрожжах, является точкой, в которой клетка становится приверженной входу в клеточный цикл. По мере того, как клетка проходит через G1, в зависимости от внутренних и внешних условий, она может либо задержать G1, либо войти в состояние покоя, известное как G0 , либо пройти точку рестрикции. [5] Повреждение ДНК является основным указанием для клетки «ограничить» и не входить в клеточный цикл. Решение о приверженности новому раунду клеточного деления происходит, когда клетка активирует циклин-CDK-зависимую транскрипцию, которая способствует входу в S-фазу. Эта контрольная точка обеспечивает дальнейший процесс. [10]
В течение раннего G1 есть три транскрипционных репрессора, известных как карманные белки, которые связываются с факторами транскрипции E2F . Семейство генов E2F представляет собой группу факторов транскрипции, которые нацелены на многие гены, которые важны для контроля клеточного цикла, включая циклины , CDK, регуляторы контрольных точек и белки репарации ДНК. Неправильная регуляция семейства E2F часто обнаруживается в случаях рака, что свидетельствует о том, что семейство E2F необходимо для жесткой регуляции репликации и деления ДНК. [10] Три карманных белка — это ретинобластома (Rb), p107 и p130, которые связываются с факторами транскрипции E2F, чтобы предотвратить прогрессирование после контрольной точки G1.
Семейство генов E2F содержит некоторые белки с активаторными механизмами и некоторые белки с репрессирующими механизмами. P107 и p130 действуют как корепрессоры для E2F 4 и E2F 5, которые работают над репрессией транскрипции факторов, способствующих переходу от G1 к S. Третий карманный белок, Rb, связывается с E2F 1, E2F 2 и E2F 3, которые являются белками E2F с активирующими способностями, и репрессирует их. [10]
Положительная обратная связь играет важную роль в регуляции перехода от фазы G1 к фазе S, особенно в фосфорилировании Rb комплексом белков Cyclin/CDK. Rb без фосфата или нефосфорилированный Rb регулирует выход из клеточного цикла G0 и дифференциацию. В начале фазы G1 факторы роста и повреждение ДНК сигнализируют о повышении уровня циклина D, который затем связывается с Cdk4 и Cdk6, образуя комплекс CyclinD:Cdk4/6. [11] Известно, что этот комплекс инактивирует Rb путем фосфорилирования. Однако детали фосфорилирования Rb довольно сложны и специфичны по сравнению с предыдущими знаниями о контрольной точке G1. CyclinD:Cdk4/6 размещает только один фосфат или монофосфорилаты Rb на одном из его четырнадцати доступных и уникальных участков фосфорилирования. Каждая из четырнадцати специфических монофосфорилированных изоформ имеет дифференциальное предпочтение связывания с членами семейства E2F, что, вероятно, увеличивает разнообразие клеточных процессов в организме млекопитающих. [11]
E2F 4 и E2F 5 зависят от p107 и p130 для поддержания своей ядерной локализации. Однако циклин D:Cdk 4/6 также фосфорилирует p107 и p130, процесс, который освобождает их связь с E2F 4 и 5 (которые затем выходят в цитоплазму), и позволяет E2F 1–3 связываться с ДНК и инициировать транскрипцию циклина E. [10] Белки Rb сохраняют свое монофосфорилированное состояние во время ранней фазы G1, в то время как циклин E накапливается и связывается с Cdk2.
CyclinE:Cdk2 играет дополнительную важную роль фосфорилирования в переходе G1-в-S. В частности, CyclinE:Cdk2 способствует положительной обратной связи, которая создает переключатель «все или ничего». Во многих сетях генетического контроля положительная обратная связь гарантирует, что клетки не будут проскальзывать вперед и назад между фазами клеточного цикла [12] Cyclin E:Cdk2 продолжает фосфорилировать Rb во всех его участках фосфорилирования, также называемых «гиперфосфорилированием», что обеспечивает полную инактивацию Rb. Гиперфосфорилирование Rb считается поздней точкой рестрикции G1, после которой клетка не может вернуться назад в клеточном цикле. В этой точке белки E2F 1-3 связываются с ДНК и транскрибируют Cyclin A и Cdc 6. [11]
Циклин-зависимый ингибитор киназы 1B (CDKN1B), также известный как p27, связывается с CyclinE:Cdk2 и предотвращает его активацию путем ингибирования. Однако, по мере того как Cyclin A накапливается и связывается с Cdk2, они образуют комплекс и ингибируют p27. Циклин-зависимая киназа фазы G1 работает вместе с циклин-зависимой киназой фазы S, нацеливаясь на p27 для деградации. В свою очередь, это позволяет полностью активировать Cyclin A:Cdk2, комплекс, который фосфорилирует E2F 1-3, инициируя их диссоциацию с сайтов промотора ДНК. Это позволяет E2F 6-8 связываться с ДНК и ингибировать транскрипцию. [10] Отрицательная обратная связь, используемая для успешного ингибирования ингибитора, p27, является еще одним важным процессом, используемым клетками для обеспечения однонаправленного движения и отсутствия возврата в клеточный цикл.
Когда происходит повреждение ДНК или когда клетка обнаруживает какие-либо дефекты, которые требуют от нее задержки или остановки клеточного цикла в G1, остановка происходит посредством нескольких механизмов. Быстрый ответ включает события фосфорилирования, которые инициируются либо киназой ATM ( мутировавшая Ataxia telangiectasia ), либо ATR ( Ataxia Teleangiectasia и Rad3-родственная ), которые действуют как сенсоры, в зависимости от типа повреждения. Эти киназы фосфорилируют и активируют эффекторные киназы Chk2 и Chk1, соответственно, которые, в свою очередь, фосфорилируют фосфатазу Cdc25A, тем самым помечая ее для убиквитинирования и деградации. Поскольку Cdc25A активирует ранее упомянутый комплекс циклин E-CDK2, удаляя ингибирующие фосфаты из CDK2, в отсутствие Cdc25A циклин E-CDK2 остается неактивным, и клетка остается в G1.
Для поддержания ареста инициируется другой ответ, посредством которого Chk2 или Chk1 фосфорилируют p53, супрессор опухоли, и это стабилизирует p53, предотвращая его связывание с Mdm2, убиквитинлигазой, которая ингибирует p53, направляя его на деградацию. Затем стабильный p53 действует как транскрипционный активатор нескольких целевых генов, включая p21, ингибитор комплекса G1-to-S, стимулирующего циклин E-CDK2. Кроме того, другой механизм, посредством которого активируется p21, заключается в накоплении p16 в ответ на повреждение ДНК. p16 разрушает комплексы циклин D-CDK4, тем самым вызывая высвобождение p21 из комплексов, что приводит к дефосфорилированию и активации Rb, что позволяет Rb связывать и ингибировать E2F 1–3, тем самым удерживая клетку от перехода в S-фазу. [13] В последнее время некоторые аспекты этой модели были оспорены. [14]
После репликации ДНК в фазе S клетка проходит фазу роста, известную как G2. В это время вырабатываются необходимые митотические белки, и клетка снова подвергается регуляторным механизмам, чтобы обеспечить надлежащий статус для входа в пролиферативную митотическую (M) фазу. В этом переходе от G2 к M задействовано несколько механистических контрольных точек с общим объединяющим фактором активности циклина-Cdk.
Хотя вариации в необходимых комплексах циклин-Cdk существуют у разных организмов, необходимость активности киназы сохраняется и обычно фокусируется на единственном парном соединении. У делящихся дрожжей существуют три различные формы митотического циклина, а у почкующихся дрожжей — шесть, однако основным используемым циклином является циклин B. [15] Циклин B будет служить в качестве ссылки для обсуждения перехода контрольной точки G2/M.
Подобно S-фазе, G2 проходит контрольную точку повреждения ДНК. Клетка еще раз проверяется на наличие участков повреждения ДНК или неполной репликации, и киназы ATR и ATM привлекаются для повреждения участков. Активация Chk1 и Chk2 также происходит, как и активация p53, чтобы вызвать остановку клеточного цикла и остановить прогрессирование в митоз. Дополнительный компонент S-фазы, пререпликативный комплекс, должен быть инактивирован посредством фосфорилирования циклина B-Cdk1. [16]
При оценке этих предыдущих контрольных точек накопление белка G2 служит для активации активности циклина B-Cdk1 посредством нескольких механизмов. ЦиклинA-Cdk2 активирует Cdc25, активатор циклина B-Cdk1, который затем дезактивирует ингибитор циклина B-Cdk1, Wee1. Это приводит к положительной обратной связи, значительно увеличивая экспрессию циклина B и активацию Cdk1. По мере того, как клетка проходит через G2 и достигает перехода G2/M, киназа Plk1 фосфорилирует Wee1, который нацеливает Wee1 на деградацию через комплекс убиквитинлигазы SCF. [17] Дополнительной функцией Plk1 является активация Cdc25 посредством фосфорилирования. Сложным эффектом деградации Wee1 и активации Cdc25 является чистое удаление ингибирующего фосфорилирования из cdc2, что активирует cdc2. Plk1 активируется при переходе G2/M с помощью Aurora A и Bora, которые накапливаются во время G2 и образуют комплекс активации. Затем комплекс Plk1-Cdc2-cdc25 инициирует положительную обратную связь, которая служит для дальнейшей активации Cdc2, и в сочетании с повышением уровней циклина B во время G2 полученные комплексы cdc2-циклин B затем активируют нижестоящие мишени, которые способствуют вступлению в митоз. [18] Результирующая активность Cdk1 также активирует экспрессию Mem1-Fkh, гена перехода G2/M. [19] Быстрый всплеск активности циклин B-Cdk1 необходим, поскольку инициация фазы M является событием «все или ничего», включающим гистерезис. Гистерезис активности Cdk1 через циклин B управляет входом в фазу M, устанавливая минимальный порог концентрации циклина B. Он существует на уровне выше минимума, необходимого для продолжения фазы M после входа, действуя для защиты события «все или ничего». Эта концентрация входа еще больше увеличивается в случае неполной репликации ДНК, добавляя еще один регуляторный механизм в точке перехода G2/M. [20] Наличие гистерезиса позволяет вступлению в фазу M строго регулироваться в зависимости от активности циклина B-Cdk1.
Механизмы, посредством которых предотвращается митотический вход в ответ на повреждение ДНК, аналогичны механизмам в контрольной точке G1/S. Повреждение ДНК запускает активацию вышеупомянутого пути ATM/ATR, в котором ATM/ATR фосфорилируют и активируют киназы контрольной точки Chk1/Chk2. Chk1/2 фосфорилируют cdc25, который, в дополнение к ингибированию, также секвестрируется в цитоплазме белками 14-3-3. 14-3-3 активируются p53, который, как упоминалось ранее, активируется Chk1 и ATM/ATR. p53 также трансактивирует p21, и как p21, так и 14-3-3, в свою очередь, ингибируют комплексы циклин B-cdc2 посредством фосфорилирования и цитоплазматической секвестрации cdc2. Кроме того, инактивация cdc25 приводит к его неспособности дефосфорилировать и активировать cdc2. [21] [22] Наконец, еще один механизм ответа на повреждение заключается в отрицательной регуляции Plk1 посредством ATM/ATR, что, в свою очередь, приводит к стабилизации Wee1 и Myt1, которые затем могут фосфорилировать и ингибировать cdc2, тем самым удерживая клетку в G2 до тех пор, пока повреждение не будет устранено. [23]
В конце G2 клетка переходит в митоз, где ядро делится. Переход от G2 к M драматичен; имеет место эффект «все или ничего», и переход необратим. Это выгодно для клетки, поскольку вступление в митоз является критическим шагом в жизненном цикле клетки. Если он не полностью зафиксируется, клетка столкнется со многими проблемами с частичным делением, что в конечном итоге, вероятно, приведет к ее смерти.
В ооцитах лягушки каскад сигналов индуцируется, когда прогестерон связывается с мембраносвязанным рецептором. Ниже активируется Mos. Затем Mos фосфорилирует MEK1, который фосфорилирует MAPK. MAPK выполняет две функции: активирует комплекс Cyclin B-Cdk1 для инициирования входа в митоз и активирует Mos. Активация Mos приводит к возникновению положительной обратной связи и, следовательно, действует как «переключатель», создавая вход в митоз по принципу «все или ничего».
Эта петля обратной связи была впервые обнаружена, когда было показано, что концентрации MAPK-P (фосфорилированного MAPK) увеличиваются в ответ на повышение уровня прогестерона. [24] На уровне отдельных клеток каждая клетка либо полностью фосфорилировала MAPK, либо не фосфорилировала MAPK, что подтверждает, что она действует как механизм, подобный переключателю, в каждой клетке. Кроме того, было показано, что блокирование синтеза белка Mos делает ответы MAPK-P более градуированными, что показывает, что синтез белка Mos необходим для характера активации MAPK «все или ничего». [25]
Этот процесс можно понять с помощью нестабильности. Используя график, показанный справа, скорость синтеза Mos смещается по мере добавления большего количества прогестерона. На каждой кривой есть стабильные фиксированные точки и нестабильные фиксированные точки. В нестабильных фиксированных точках система будет подталкиваться к одной из стабильных фиксированных точек. Таким образом, система может находиться либо в состоянии «включено», либо в состоянии «выключено», но не между ними. Когда уровень прогестерона достаточно высок, кривая Mos смещается выше и в конечном итоге пересекает линию деградации только в одной точке, поэтому есть только одно стабильное состояние «включено», указывающее на вход в митоз.
Необратимость, которую мы видим в точке перехода митоза, возникает из-за достаточно высокого уровня прогестерона в клетке. При достаточно высоком уровне прогестерона система моностабильна в результате положительной обратной связи между Mapk и Mos. Точка, в которой система переключается из бистабильного состояния в моностабильное, называется бифуркацией седлового узла.
Итак, мы можем понять все или ничего, необратимый ответ митотического перехода с математической моделью молекулярных регуляторов как бистабильную систему, которая зависит от существования положительной обратной связи. «Выключенное состояние» уничтожается достаточно высоким уровнем прогестерона, и как только клетка проходит через выключенное состояние, она застревает во включенном состоянии.
Исходя из этой бистабильной модели, мы можем понять митотический переход как основанный на гистерезисе, который им управляет. Гистерезис определяется как зависимость состояния системы от ее истории. Модель Новака–Тайсона — это математическая модель прогрессии клеточного цикла, которая предсказывает, что необратимые переходы, входящие и выходящие из митоза, управляются гистерезисом. Модель имеет три основных предсказания, которые должны быть верны в циклических экстрактах ооцитов, прогрессия клеточного цикла которых зависит от гистерезиса: [26]
Ша и др. провели эксперименты с экстрактами яиц Xenopus laevis в 2003 году, чтобы продемонстрировать эту гистерезисную природу. [27] Используя циклические экстракты, они наблюдали, что порог активации для Δциклина B составляет от 32 до 42 нМ, тогда как порог инактивации составляет от 16 до 24 нМ Δциклина B. Таким образом, эти эксперименты подтвердили бистабильность этой системы и важность гистерезиса в этом переходе клеточного цикла. При промежуточных концентрациях циклина B возможно либо интерфазное, либо митотическое состояние клетки.
Поскольку вступление в митоз является большим и дорогостоящим обязательством для клетки, логично, что должны быть системы, предотвращающие преждевременное вступление в этот этап. Было показано, что ошибки на предыдущих этапах, такие как наличие нереплицированных участков ДНК, блокируют прогресс в клеточном цикле. [28] Модель Новака-Тайсона предсказывает, что это происходит посредством повышения уровня циклина B, необходимого для вступления в митоз. [26]
Ша и др. исследовали, было ли это верно в отношении экстрактов яиц Xenopus . Они использовали афидиколин (APH) для ингибирования ДНК-полимеразы и предотвращения репликации ДНК. При обработке циклином B в интерфазе порог активации увеличивался до 80–100 нМ, как и предсказывала модель Новака–Тайсона. [27] Таким образом, эти эксперименты подтверждают, что стресс нереплицированной ДНК в клетке влияет на петлю гистерезиса и приводит к гораздо более высокому порогу циклина B для входа в митоз.
Контрольная точка митотического веретена происходит в точке метафазы , где все хромосомы должны были/должны были выровняться на митотической пластинке и находиться под биполярным натяжением. Натяжение, создаваемое этим биполярным прикреплением, и есть то, что ощущается, что инициирует вступление в анафазу. Для этого сенсорный механизм гарантирует, что комплекс, способствующий анафазе (APC/C), больше не ингибируется, что теперь может свободно разрушать циклин B , который содержит D-box (destruction box), и разрушать секурин . [29] Последний представляет собой белок, функция которого заключается в ингибировании сепаразы , которая, в свою очередь, разрезает когезины , белковый композит, отвечающий за сцепление сестринских хроматид. [30] После того, как этот ингибирующий белок разрушается посредством убиквитинирования и последующего протеолиза, сепараза затем вызывает разделение сестринских хроматид. [31] После того, как клетка разделилась на две дочерние клетки, она входит в G 1 .
Процессы репарации ДНК и контрольные точки клеточного цикла тесно связаны с раком из-за их функций регулирования стабильности генома и прогрессирования клеток соответственно. Точные молекулярные механизмы, которые связывают дисфункции в этих путях с возникновением конкретных видов рака, в большинстве случаев не совсем понятны. [32] Было показано, что потеря ATM предшествует развитию лимфомы, предположительно из-за чрезмерной гомологичной рекомбинации, что приводит к высокой геномной нестабильности. [33] Нарушение Chk1 у мышей привело к значительному нарушению регуляции контрольных точек клеточного цикла, накоплению повреждений ДНК и увеличению частоты возникновения опухолей. [34] Наследование одного мутанта BRCA1 или BRCA2 предрасполагает самок к раку груди и яичников. [35] Известно, что BRCA1 необходим для переходов S и G2/M и участвует в клеточном ответе на повреждение ДНК. Считается, что BRCA2 участвует в гомологичной рекомбинации и регуляции контрольной точки S-фазы, а мутации дефицита BRCA2 тесно связаны с возникновением опухолей. [36]