Серия биохимических переключателей контролирует переходы между различными фазами клеточного цикла и внутри них . Клеточный цикл представляет собой серию сложных, упорядоченных, последовательных событий, которые контролируют, как одна клетка делится на две клетки, и включает несколько различных фаз. Фазы включают фазы G1 и G2, репликацию ДНК или фазу S, и фактический процесс деления клетки, митоз или фазу M. [1] Во время фазы M хромосомы разделяются и происходит цитокинез.
Переключатели поддерживают упорядоченное развитие клеточного цикла и действуют как контрольные точки, чтобы гарантировать, что каждая фаза была должным образом завершена перед переходом к следующей фазе. [1] Например, Cdk, или циклинзависимая киназа , является основным переключателем управления клеточным циклом и позволяет клетке переходить из G1 в S или из G2 в M, добавляя фосфат к белковым субстратам. Было показано, что такие многокомпонентные (включающие несколько взаимосвязанных белков) переключатели генерируют решительные, надежные (и потенциально необратимые) переходы и запускают стабильные колебания. [2] В результате они являются предметом активных исследований, которые пытаются понять, как такие сложные свойства связаны с биологическими системами управления. [3] [4] [5]
Многие биологические контуры производят сложные выходные данные, используя одну или несколько петель обратной связи . В последовательности биохимических событий обратная связь будет относиться к нижестоящему элементу в последовательности (B на соседнем изображении), влияющему на некоторый вышестоящий компонент (A на соседнем изображении), чтобы повлиять на его собственное производство или активацию (выход) в будущем. Если этот элемент действует для улучшения своего собственного выхода, то он участвует в положительной обратной связи (синяя стрелка). Положительная обратная связь также известна как самоусиливающаяся петля, и возможно, что эти петли могут быть частью более крупной петли, поскольку это характерно для регуляторных контуров. [1]
Наоборот, если этот элемент приводит к своему собственному торможению через элементы выше по потоку, это канонически отрицательная обратная связь (красная тупая стрелка). Петля отрицательной обратной связи также известна как балансирующая петля, и часто можно увидеть колебания, в которых задержанный сигнал отрицательной обратной связи используется для поддержания гомеостатического равновесия в системе. [1]
Контуры обратной связи могут использоваться для усиления (положительного) или самокоррекции (отрицательного). Правильное сочетание контуров положительной и отрицательной обратной связи может генерировать сверхчувствительность и бистабильность, [6] [7] , которые в свою очередь могут генерировать решающие переходы и колебания.
Положительные и отрицательные петли обратной связи не всегда работают по отдельности. В механизме биохимических переключателей они работают вместе, создавая гибкую систему. Например, согласно Pfeuty & Kaneko (2009), чтобы преодолеть недостаток в биохимических системах, петли положительной обратной связи могут взаимодействовать с петлями отрицательной регуляции, чтобы облегчить выход из стабильных состояний. [8] Сосуществование двух стабильных состояний известно как бистабильность, которая часто является результатом регуляции положительной обратной связи.
Примером, который показывает взаимодействие множественных отрицательных и положительных обратных связей, является активация циклин-зависимых протеинкиназ, или Cdks14. Положительные обратные связи играют роль, переключая клетки с низкой на высокую активность Cdk. Взаимодействие между двумя типами петель очевидно в митозе. В то время как положительная обратная связь инициирует митоз, отрицательная обратная связь способствует инактивации циклин-зависимых киназ комплексом, способствующим анафазе. Этот пример ясно показывает комбинированные эффекты, которые положительные и отрицательные обратные связи оказывают на регуляцию клеточного цикла.
Реакция «все или ничего» на стимул называется сверхчувствительностью . Другими словами, очень небольшое изменение стимула вызывает очень большое изменение реакции, создавая сигмоидальную кривую доза-реакция. Сверхчувствительная реакция описывается общим уравнением V = S n /(S n + K m ), известным как уравнение Хилла , когда n, коэффициент Хилла, больше 1. Крутизна сигмоидальной кривой зависит от значения n. Значение n = 1 дает гиперболическую или михаэлевскую реакцию. Сверхчувствительность достигается в различных системах; ярким примером является кооперативное связывание фермента гемоглобина с его субстратом. Поскольку сверхчувствительная реакция является почти «цифровой», ее можно использовать для усиления реакции на стимул или для вызова решительного резкого перехода (между состояниями «выключено» и «включено»).
Сверхчувствительность играет большую роль в регуляции клеточного цикла. Например, Cdk1 и Wee1 являются митотическими регуляторами, и они способны инактивировать друг друга посредством ингибирующего фосфорилирования. Это представляет собой двойную отрицательную обратную связь, в которой оба регулятора инактивируют друг друга. Согласно Киму и др. (2007), должен быть сверхчувствительный элемент для генерации бистабильного ответа. Оказывается, что Wee1 имеет сверхчувствительный ответ на Cdk1, и это, вероятно, возникает из-за конкуренции субстрата между различными участками фосфорилирования на Wee1. [9]
Бистабильность подразумевает гистерезис, а гистерезис подразумевает мультистабильность. Мультистабильность указывает на наличие двух или более стабильных состояний для данного входа. Таким образом, бистабильность — это способность системы существовать в двух устойчивых состояниях. [10] Другими словами, существует диапазон значений стимула, для которых ответ может иметь два устойчивых значения. Бистабильность сопровождается гистерезисом , что означает, что система приближается к одному из двух устойчивых состояний предпочтительно в зависимости от своей истории. Бистабильность требует обратной связи, а также сверхчувствительного элемента схемы.
При соответствующих обстоятельствах положительные и отрицательные обратные связи могут обеспечить условия для бистабильности; например, имея положительную обратную связь, связанную с элементом сверхчувствительного отклика в схеме. Гистерезисная бистабильная система может действовать как надежный обратимый переключатель, поскольку системе сложнее переходить между состояниями «вкл» и «выкл» (по сравнению с эквивалентным моностабильным сверхчувствительным откликом). Система также может быть уравновешена таким образом, что один из переходов будет физически недостижим; например, никакое уменьшение стимула не вернет систему в состояние «выкл», когда она уже находится в состоянии «вкл». Это сформирует надежный необратимый переключатель. Как спроектировать простой биологический переключатель, описано в докладе конференции. [11]
Между топологиями сети нет однозначного соответствия, поскольку многие сети имеют схожие входные и выходные отношения. Топология сети не подразумевает вход или выход, и, аналогично, вход или выход не подразумевает топологию сети. Именно по этой причине параметризация очень важна для функционирования схемы. Если динамика входа сопоставима или быстрее, чем реакция системы, реакция может показаться гистерезисной.
Ниже описаны три переключения клеточного цикла, которые обеспечивают резкие и/или необратимые переходы путем использования некоторых из описанных выше механизмов.
Переход G1/S , более известный как контрольная точка Start в почкующихся дрожжах (точка ограничения в других организмах), регулирует выполнение клеточного цикла. [1] В этой контрольной точке клетки либо останавливаются перед репликацией ДНК (из-за ограничения питательных веществ или сигнала феромона), продлевают G1 (контроль размера), либо начинают репликацию и продвигаются через остальную часть клеточного цикла. Регуляторная сеть G1/S или регулон в почкующихся дрожжах включает циклины G1 Cln1, Cln2 и Cln3, Cdc28 (Cdk1), факторы транскрипции SBF и MBF и ингибитор транскрипции Whi5 . [3] Cln3 взаимодействует с Cdk1, чтобы инициировать последовательность событий путем фосфорилирования большого количества мишеней, включая SBF, MBF и Whi5 . Фосфорилирование Whi5 заставляет его транслоцироваться из ядра, не давая ему ингибировать SBF и MBF. Активные SBF/MBF управляют переходом G1/S, включая циклины B-типа и инициируя репликацию ДНК, образование почек и дупликацию веретенных телец. Более того, SBF/MBF управляет экспрессией Cln1 и Cln2, которые также могут взаимодействовать с Cdk1, способствуя фосфорилированию его целей.
Первоначально считалось, что это переключение G1/S функционирует как линейная последовательность событий, начинающихся с Cln3 и заканчивающихся в фазе S. [12] Однако наблюдение, что любого из Cln было достаточно для активации регулона, указывало на то, что Cln1 и Cln2 могли бы задействовать положительную обратную связь для активации собственной транскрипции. Это привело бы к непрерывно ускоряющемуся циклу, который мог бы действовать как необратимый бистабильный триггер. [2] Скотхейм и др. использовали измерения отдельных клеток в почкующихся дрожжах, чтобы показать, что эта положительная обратная связь действительно происходит. [3] Небольшое количество Cln3 индуцирует экспрессию Cln1/2, а затем петля обратной связи вступает в силу, что приводит к быстрому и резкому выходу Whi5 из ядра и, следовательно, к когерентной экспрессии генов регулона G1/S. При отсутствии когерентной экспрессии генов клеткам требуется больше времени для выхода из G1, и значительная часть даже останавливается до фазы S, что подчеркивает важность положительной обратной связи в обострении переключения G1/S.
Контрольная точка клеточного цикла G1/S контролирует переход эукариотических клеток из первой фазы разрыва, G1, в фазу синтеза ДНК, S. В этом переключении в клетках млекопитающих есть две киназы клеточного цикла, которые помогают контролировать контрольную точку: киназы клеточного цикла CDK4/6-циклин D и CDK2-циклин E. [1] Транскрипционный комплекс, включающий Rb и E2F, важен для контроля этой контрольной точки. В первой фазе разрыва комплекс репрессора Rb-HDAC связывается с факторами транскрипции E2F-DP1, тем самым ингибируя нисходящую транскрипцию. Фосфорилирование Rb CDK4/6 и CDK2 диссоциирует комплекс репрессора Rb и служит переключателем включения/выключения для клеточного цикла. После фосфорилирования Rb ингибирование снимается с транскрипционной активности E2F. Это позволяет транскрипцию генов фазы S, кодирующих белки, которые усиливают переключение фазы G1 на S.
Множество различных стимулов применяют контроль контрольных точек, включая TGFb, повреждение ДНК, контактное торможение, репликативное старение и отмену фактора роста. Первые четыре действуют, индуцируя членов семейств ингибиторов киназы клеточного цикла INK4 или Kip/Cip. TGFb ингибирует транскрипцию Cdc25A, фосфатазы, которая активирует киназы клеточного цикла, а отмена фактора роста активирует GSK3b, который фосфорилирует циклин D. Это приводит к его быстрому убиквитинированию. [13]
G2 начинается с транскрипции циклина A, опосредованной E2F, которая образует комплекс циклин A-Cdk2. Для перехода в митоз комплекс циклин B - Cdk1 (впервые обнаруженный как MPF или фактор, способствующий M-фазе; Cdk1 также известен как Cdc2 у делящихся дрожжей и Cdc28 у почкующихся дрожжей) активируется Cdc25 , протеинфосфатазой . [1] Когда начинается митоз, ядерная оболочка распадается, хромосомы конденсируются и становятся видимыми, и клетка готовится к делению. Активация циклина B-Cdk1 приводит к разрушению ядерной оболочки, что является характеристикой начала митоза. [1]
Комплекс циклин B-Cdk1 участвует в регуляторной схеме, в которой Cdk1 может фосфорилировать и активировать свой активатор, Cdc25 (положительная обратная связь), а также фосфорилировать и инактивировать свой инактиватор, киназу Wee1 (двойная отрицательная обратная связь). [1] Эта схема может действовать как бистабильный триггер [14] с одним стабильным устойчивым состоянием в G2 (Cdk1 и Cdc25 выключены, Wee1 включен) и вторым стабильным устойчивым состоянием в M-фазе (Cdk1 и Cdc25 активны, Wee1 выключен). Однако сам Wee1 регулируется другими факторами, такими как Cdr2 .
В серии экспериментов с человеческой клеточной линией HeLa в 1998 году Джин и др. [15] предположили и отстаивали , что именно пространственное расположение циклина B внутри клетки инициирует митоз. Из предыдущих экспериментов с человеческими клетками и ооцитами морских звезд Джин и др. сделали вывод, что циклин B1 в изобилии присутствует в цитоплазме во время неделящихся фаз митоза, но обнаруживается в ядре в комплексе с Cdk1 непосредственно перед тем, как клетка вступает в митоз. Другие экспериментаторы показали, что клетки не будут делиться, если циклин B останется в цитоплазме. Чтобы дополнительно изучить влияние пространственного расположения циклина B на деление клеток и контроль цикла, Джин и др. пометили циклин B сигналом ядерной локализации (NLS), который удерживал бы циклин внутри ядра. Первоначально этот NLS циклина B не вызывал ожидаемого эффекта ускоренного митотического входа. Этот результат обусловлен ингибированием, подробно описанным на рисунке ниже. Wee1, ингибитор комплекса циклин B-Cdk1, локализуется в ядре и, вероятно, фосфорилирует циклин B NLS, делая его неспособным функционировать так, как предсказывалось. Это предположение было подтверждено, когда Джин и др. использовали Cdc2AF, нефосфорилируемый мутант Cdk1, и увидели ускоренный вход в клеточное деление из-за ядерной локализации циклина B. Следовательно, ядерная локализация циклина B необходима, но недостаточна для запуска деления клеток.
При исследовании регуляции клеточного цикла Джин и др. манипулировали клетками, чтобы оценить локализацию циклина B в клетках с повреждением ДНК. Благодаря сочетанию повреждения ДНК и ядерной локализации экзогенного циклина B они смогли определить, что клетки будут делиться даже с повреждением ДНК, если циклин B будет вынужден экспрессироваться в ядре. Это говорит о том, что пространственная локализация циклина B может играть роль контрольной точки митоза. Если клетки при нормальных обстоятельствах не делятся, когда их генетическая информация повреждена, но вступают в митоз, если эндогенный циклин B экспрессируется в ядре, вероятно, что транслокация циклина B в цитоплазму является механизмом, который предотвращает незрелый митотический вход. Эта гипотеза была дополнительно подтверждена анализом Джин и др. клеток, задержанных в G2 из-за повреждения ДНК. В этих клетках Джин и др. наблюдали высокие уровни активности комплекса циклин B-Cdc2 в цитоплазме. Это подтверждает ранее упомянутую теорию, поскольку показывает, что Cdc2 может активировать циклин без немедленной транслокации в ядро. Кроме того, накопление комплексов циклин B-Cdk1 в цитоплазме клеток, которые не делятся из-за повреждения ДНК, подтверждает теорию о том, что именно ядерная локализация циклина B инициирует митотический вход.
В заключение следует отметить, что пространственная локализация циклина B играет роль в митотическом входе. Транслокация циклина B из цитоплазмы в ядро необходима для деления клетки, но недостаточна, поскольку ее ингибиторы не позволяют клетке преждевременно войти в митоз. В дополнение к резервному ингибированию комплекса циклин B-Cdk1, преждевременное клеточное деление предотвращается транслокацией самого циклина B. Комплекс циклин B-Cdk1 останется в цитоплазме в клетках с повреждением ДНК, а не будет транслоцироваться в ядро, удерживая клетку от входа в митоз. Следующий вопрос, который рассматривают исследователи в этой области, заключается в том, каким конкретным механизмом регулируется эта транслокация.
Сантос и др. [16] выдвинули гипотезу, что транслокация циклина B регулируется механизмом положительной обратной связи, аналогичным тому, который регулирует активацию комплекса циклин B-Cdk1. Они считали, что положительная обратная связь включает фосфорилирование циклина B и его транслокацию в ядро. Чтобы начать исследовать это, они сначала подтвердили некоторые результаты экспериментов Джина и др., используя иммунофлуоресценцию, чтобы показать циклин B в цитоплазме перед делением, и транслокацию в ядро для инициации митоза, который они операционализировали, сравнивая относительно разрыва ядерной оболочки (NEB). Используя ядерный циклин, который не может быть инактивирован Wee1 или Myt1, Сантос и др. наблюдали, что активный ядерный циклин рекрутирует больше циклина из цитоплазмы для транслокации в ядро. Они подтвердили это наблюдение, применив обработку рапамицином, iRap. iRap индуцирует транслокацию меченого циклина B из цитоплазмы в ядро. Примечательно, что Сантос и др. увидели, что немеченый циклин B мигрировал с циклином B под влиянием iRap. Немеченый циклин нечувствителен к обработке и перемещается независимо от обработанного циклина. Это подтверждает первую часть положительной обратной связи, что ядерная локализация циклина B, которая приводит к митотическому входу, способствует повышенной транслокации цитоплазматического циклина B в ядро, дополнительно способствуя миграции оставшегося цитоплазматического циклина B в ядро и т. д.
Сантос и др. далее выдвигают гипотезу, что фосфорилирование циклина B является еще одним компонентом положительной обратной связи. Они наблюдали, что циклин B естественным образом попадает в ядро до NEB. Напротив, мутировавший, нефосфорилируемый циклин B попадает в ядро во время NEB. Это неожиданно, поскольку для клеточного цикла характерно перемещение циклина в ядро до NEB, чтобы вызвать прогрессирование клеточного цикла в митотическое деление. Поэтому Сантос и др. делают вывод, что фосфорилирование циклина B способствует перемещению в ядро. Однако, кроме того, перемещение в ядро способствует фосфорилированию циклина. Авторы отмечают, что фосфорилирование циклина B в девятнадцать раз более благоприятно в ядре, чем в цитоплазме, из-за меньшего общего объема ядра, что обеспечивает более высокую скорость фосфорилирования. Усиление транслокации вследствие фосфорилирования и усиление фосфорилирования вследствие транслокации являются примером положительной обратной связи, которая напоминает ранее обнаруженную, активирующую комплекс циклин B-Cdk1.
В заключение, ядерная локализация циклина B необходима для входа клетки в митоз. Транслокация циклина из цитоплазмы в ядро, что позволяет клетке делиться, регулируется положительной обратной связью. Активный циклин B транслоцируется в ядро и способствует активации и транслокации дополнительных единиц циклина, находящихся в ядре. Это явление усиливается при рассмотрении фосфорилирования. Фосфорилирование циклина B способствует транслокации в ядро, и циклин B в ядре с гораздо большей вероятностью будет фосфорилироваться, поэтому ядерная локализация в ответ способствует фосфорилированию циклина B.
Когда клетки находятся в митозе, циклин B-Cdk1 активирует комплекс, способствующий анафазе (APC), который, в свою очередь, инактивирует циклин B-Cdk1, разрушая циклин B, что в конечном итоге приводит к выходу из митоза. Сочетание бистабильной функции ответа Cdk1 с отрицательной обратной связью от APC может генерировать то, что известно как релаксационный осциллятор [ 4] с резкими всплесками активности Cdk1, запускающими надежные митотические циклы. Однако в релаксационном осцилляторе контрольный параметр медленно движется относительно динамики ответа системы, что может быть точным представлением митотического входа, но не обязательно митотического выхода.
Для выхода из митотической стадии клеточного цикла необходимо инактивировать комплекс циклин B-Cdk1. Затем клетки могут вернуться в первую промежуточную фазу G1 и ждать, пока цикл не продолжится снова.
В 2003 году Померенинг и др. предоставили веские доказательства этой гипотезы, продемонстрировав гистерезис и бистабильность в активации Cdk1 в цитоплазматических экстрактах ооцитов Xenopus . [4] Они впервые продемонстрировали прерывистый резкий ответ Cdk1 на изменение концентрации неразрушаемого циклина B (чтобы отделить сеть ответа Cdk1 от отрицательной обратной связи, опосредованной APC). Однако такой ответ согласуется как с моностабильным, сверхчувствительным переходом, так и с бистабильным переходом. Чтобы различить эти две возможности, они измерили стационарные уровни активного Cdk1 в ответ на изменение уровней циклина, но в двух отдельных экспериментах, один из которых начинался с интерфазного экстракта, а другой — с экстракта, уже находящегося в митозе. При промежуточных концентрациях циклина они обнаружили две стационарные концентрации активного Cdk1. Какое из двух устойчивых состояний было занято, зависело от истории системы, то есть от того, началась ли она с интерфазы или митотического экстракта, что эффективно демонстрирует гистерезис и бистабильность.
В том же году Ша и др. [17] независимо пришли к такому же выводу, обнаружив гистерезисную петлю также с использованием экстрактов яиц Xenopus laevis. В этой статье были проверены три предсказания модели Новака-Тайсона в попытке сделать вывод о том, что гистерезис является движущей силой для «переходов клеточного цикла в митоз и из него». Предсказания модели Новака-Тайсона являются общими для всех бифуркаций седло-узел. Бифуркации седло-узел являются чрезвычайно полезными бифуркациями в несовершенном мире, поскольку они помогают описывать биологические системы, которые не являются идеальными. Первое предсказание состояло в том, что пороговая концентрация циклина для входа в митоз выше пороговой концентрации циклина для выхода из митоза, и это было подтверждено путем добавления в экстракты циклирующих яиц неразлагаемого циклина B и измерения порога активации и инактивации после добавления циклогексимида (CHX), который является ингибитором синтеза белка. [1] Кроме того, второе предсказание модели Новака-Тайсона также было подтверждено: нереплицированная дезоксирибонуклеиновая кислота, или ДНК, увеличивает пороговую концентрацию циклина, которая необходима для входа в митоз. Чтобы прийти к этому выводу, экстракты, высвобождающие цитостатический фактор, были дополнены CHX, APH (ингибитор ДНК-полимеразы) или обоими, и был добавлен неразлагаемый циклин B. Третье и последнее предсказание, которое было проверено и доказано в этой статье, состояло в том, что скорость активации Cdc2 замедляется вблизи пороговой концентрации активации циклина. Эти предсказания и эксперименты демонстрируют поведение переключения, похожее на переключение, которое можно описать гистерезисом в динамической системе. [18]
При переходе от метафазы к анафазе крайне важно, чтобы сестринские хроматиды были правильно и одновременно разделены на противоположных концах клетки. [1] Разделение сестринских хроматид изначально сильно ингибируется для предотвращения преждевременного разделения в позднем митозе, но это ингибирование снимается посредством разрушения ингибирующих элементов комплексом, способствующим анафазе (APC), как только достигается биориентация сестринских хроматид. Одним из этих ингибирующих элементов является секурин , который предотвращает разрушение когезина , комплекса, который удерживает сестринские хроматиды вместе, связывая протеазу сепаразу , которая нацелена на Scc1, субъединицу комплекса когезина, для разрушения. В этой системе фосфатаза Cdc14 может удалять ингибирующий фосфат из секурина, тем самым облегчая разрушение секурина APC, высвобождая сепаразу. Как показали Ульман и др., во время прикрепления хромосом к митотическому веретену хроматиды остаются парными, поскольку сцепление между сестрами предотвращает разделение. [9] [19] Сплоченность устанавливается во время репликации ДНК и зависит от когезина, который представляет собой многосубъединичный комплекс, состоящий из Scc1, Scc3, Smc2 и Smc3. У дрожжей при переходе от метафазы к анафазе Scc1 диссоциирует от хромосом, и сестринские хроматиды разделяются. Это действие контролируется белком Esp1, который прочно связан с ингибитором анафазы Pds1, который разрушается комплексом, стимулирующим анафазу. Чтобы убедиться, что Esp1 действительно играет роль в регуляции ассоциации хромосом Scc1, клеточные штаммы были остановлены в G1 с помощью альфа-фактора. Эти клетки оставались остановленными во время развития. Были использованы мутантные клетки Esp1-1, и эксперимент был повторен, и Scc1 успешно связался с хромосомами и остался связанным даже после прекращения синтеза. Это было важно для демонстрации того, что с Esp1 Scc1 затрудняется в своей способности стабильно связываться с хромосомами во время G1, и Esp1 может фактически напрямую удалять Scc1 из хромосом.
Холт и др. [5] показали, что сепараза активирует Cdc14, который, в свою очередь, действует на секурин, тем самым создавая положительную обратную связь, которая увеличивает резкость перехода от метафазы к анафазе и координацию разделения сестринских хроматид. [5] Холт и др. исследовали основу эффекта положительной обратной связи при фосфорилировании секурина, используя мутантные штаммы дрожжей «секурин» и проверяя, как изменения в фосфорной регуляции секурина влияют на синхронность разделения сестринских хроматид. Их результаты показывают, что вмешательство в эту положительную петлю секурин-сепараза-cdc14 снижает синхронность разделения сестринских хроматид. Эта положительная обратная связь может гипотетически генерировать бистабильность при переходе к анафазе, заставляя клетку принимать необратимое решение о разделении сестринских хроматид.
Митотический выход является важной точкой перехода, которая означает конец митоза и начало новой фазы G1 для клетки, и клетка должна полагаться на определенные механизмы контроля, чтобы гарантировать, что после выхода из митоза она никогда не вернется в митоз, пока не пройдет фазы G1, S и G2 и не пройдет все необходимые контрольные точки. Многие факторы, включая циклины , циклинзависимые киназы (CDK), убиквитинлигазы , ингибиторы циклинзависимых киназ и обратимые фосфорилирования , регулируют митотический выход, чтобы гарантировать, что события клеточного цикла происходят в правильном порядке с наименьшим количеством ошибок. [20] Конец митоза характеризуется разрывом веретена, укороченными кинетохорными микротрубочками и выраженным разрастанием астральных (некинетохорных) микротрубочек. [21] Для нормальной эукариотической клетки митотический выход необратим. [22]
Было высказано много предположений относительно механизмов контроля, используемых клеткой для содействия необратимости митотического выхода в модельном эукариотическом организме, почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae . Протеолитическая деградация регуляторов клеточного цикла и соответствующие эффекты на уровни циклин-зависимых киназ были предложены в качестве механизма, который способствует эукариотическому клеточному циклу и переходу от метафазы к анафазе в частности. В этой теории комплекс, способствующий анафазе (APC), класс убиквитинлигаз, облегчает деградацию митотических циклинов (Clb2) и факторов, ингибирующих анафазу (PDS1, CUT2), для содействия митотическому выходу. [23] APC убиквитинирует мотив из девяти аминокислот, известный как деструктивный бокс (D-бокс), в NH2-концевом домене митотических циклинов для деградации протеасомой. [23] APC в ассоциации с Cdc20 (APC-Cdc20) убиквитинирует и нацеливает митотические циклины (Clb2) для деградации на начальном этапе. Одновременно APC-Cdc20 опосредует деградацию секуринов, которые ингибируют сепаразы посредством связывания в начале анафазы. Высвобожденная и активная сепараза расщепляет когезин, который удерживал сестринские хроматиды вместе, облегчая разделение сестринских хроматид и инициирует митотический выход, способствуя высвобождению Cdc14 из ядрышка. [24] [25] На более позднем этапе подавление Cdk1 и активация Cdc14, фосфатазы, активирующей Cdh1, способствуют образованию APC в ассоциации с Cdh1 (APC-Cdh1) для деградации Clb2s. [22] Cdc20 и Cdh1, которые являются активаторами APC, привлекают такие субстраты, как секурин и циклины B-типа (Clb) для убиквитинирования. [26] Без комплексов Cdk1-Clb2 для фосфорилирования белков, которые участвуют в динамике веретена, таких как Sli15, Ase1 и Ask1 , происходит удлинение веретена и сегрегация хромосом, что облегчает выход из митоза. [22] Важность протеолитической деградации в эукариотическом клеточном цикле изменила взгляд на деление клеток как на простой каскад киназ, на более сложный процесс, в котором необходимы взаимодействия между фосфорилированием, убиквитинированием и протеолизом. [23] Однако эксперименты с использованием почкующихся дрожжевых клеток с cdc28-as1, чувствительным к INM-PP1 (аналог АТФ) аллелем Cdk, доказали, что разрушение циклинов B-типа (Clb) не является необходимым для запуска необратимого митотического выхода. [22] Деградация Clb2 действительно сократила период ингибирования Cdk1, необходимый для запуска необратимого митотического выхода, что указывает на то, что протеолиз циклина вносит вклад в динамическую природу эукариотического клеточного цикла из-за более медленного времени его действия, но вряд ли является основным определяющим фактором в запуске необратимых переходов клеточного цикла.[22]
Были сделаны открытия, которые указали на важность уровня ингибиторов циклинзависимых киназ в регуляции эукариотического клеточного цикла. В частности, было показано, что уровень Sic1 , стехиометрического ингибитора комплексов Clb-CDK в почкующихся дрожжах, особенно важен в необратимом переходе G1-S путем необратимой активации киназ S-фазы. [27] Было показано, что уровень Sic1 играет важную роль в запуске необратимого митотического выхода (переход M-G1), а также в переходе G1-S. Во время митоза снижение уровня Cdk1 приводит к активации Cdc14, фосфатазы, которая противодействует Cdk1 посредством активации Cdh1 и Swi5, транскрипционного активатора белков Sic1. [28] В то время как деградация Sic1 до определенного низкого уровня запускала начало S-фазы, накопление Sic1 до определенного высокого уровня требовалось для запуска необратимого митотического выхода. [22] Ингибиторы Cdk1 могли индуцировать митотический выход, даже когда деградация циклинов B-типа блокировалась экспрессией недеградируемых Clbs или ингибиторов протеасом. Однако сестринские хроматиды не разделялись, и клетки возвращались к митозу после того, как ингибиторы были вымыты, что указывает на то, что необходимо достичь порогового уровня ингибиторов, чтобы запустить необратимый митотический выход независимо от деградации циклинов. [29] Несмотря на различные пороговые значения уровня Sic1, которые требуются для запуска митотического выхода по сравнению с переходом G1-S, было показано, что уровень Sic1 играет ключевую роль в регуляции эукариотического клеточного цикла путем ингибирования активности CDK.
Поскольку эукариотический клеточный цикл включает в себя множество белков и регуляторных взаимодействий, можно использовать динамический системный подход для упрощения сложной биологической цепи в общую структуру для лучшего анализа. [30] [31] Среди четырех возможных отношений ввода/вывода отношение между уровнем Sic1 и митотическим выходом, по-видимому, демонстрирует характеристики необратимого бистабильного переключения, управляемого обратной связью между APC-Cdh1, Sic1 и Clb2-Cdk1. [22] Известно, что бистабильность контролирует биологические функции, такие как контроль клеточного цикла и клеточная дифференциация, и играет ключевую роль во многих клеточных регуляторных сетях. [32] Бистабильное отношение ввода/вывода характеризуется двумя стабильными состояниями с двумя точками бифуркации. Для одного конкретного входа в области бистабильности, отмеченной двумя точками бифуркации, возможны множественные выходы. Кроме того, бистабильное отношение демонстрирует гистерезис: конечное состояние/выход зависит от истории входа, а также от текущего значения входа, поскольку у системы есть память. [30] Одна точка бифуркации имеет отрицательное значение контрольного параметра (точка бифуркации находится на другой стороне оси), что приводит к разрыву связи между двумя стабильными состояниями и необратимости перехода из одного состояния в другое. Что касается митотического выхода, два стабильных состояния определяются митозом и фазой G1. Как только уровень Sic1 (вход) накапливается выше порогового значения, происходит необратимый переход из митоза (стабильное состояние I) в фазу G1 (стабильное состояние II). В несовершенной среде единственная бифуркация, которая остается нетронутой, — это бифуркация седло-узел . Бифуркация седло-узел не разрушается (седло-узел — ожидаемое общее поведение), в то время как транскритические и вилочные бифуркации разрушаются при наличии несовершенств. [33] Таким образом, единственная одномерная бифуркация, которая может существовать в несовершенном биологическом мире, — это бифуркация седло-узел. [30] Бистабильную связь между переходом M-G1 и уровнем Sic1 можно представить в виде диаграммы двух бифуркаций седло-узел, в которых поведение системы качественно меняется при небольшом изменении управляющего параметра — величины Sic1.
Поскольку поведение клеточного цикла критически зависит от количества Sic1 в переходном состоянии M-G1, количество Sic1 жестко регулируется обратными связями на системном уровне. Поскольку Cdk1-Clb2 ингибирует Sic1, фосфорилируя Sic1 и делая Sic1 доступным для деградации через убиквитинирование, APC-Cdh1-зависимая деградация Cdk1-Clb2 не только снижает уровень доступных комплексов Cdk1-Clb2, но и увеличивает уровень Sic1, что в свою очередь еще больше ингибирует функцию Cdk1-Clb2. [28] Эта активация двойной отрицательной обратной связи инициируется APC-Cdc20-зависимой деградацией Cdk1-Clb2 и высвобождением Cdc14 из ядрышкового белка Net1/Cfi1. [34] Путь FEAR (выделение Cdc14 в раннюю анафазу) облегчает фосфорилирование Net1, зависящее от Clb2-Cdk1, которое временно высвобождает Cdc14 из Net1. [35] Высвобожденные комплексы Cdc14 и Clb2-Cdk1 переходят в форму веретен, которые активируют сеть митотического выхода (MEN). MEN обеспечивает устойчивое высвобождение Cdc14 из ядрышка, [35] а Cdc14 противодействует активности Clb2-Cdk1, активируя Cdh1 и стабилизируя Sic1 посредством активации транскрипционного активатора Sic1 Swi5. [36] Sic1 положительно регулирует себя, ингибируя Cdk1-Clb2 для высвобождения ингибирования Swi5, и Cdh1 также положительно регулирует себя, ингибируя Clb2-Cdk1 для высвобождения ингибирования MEN, которое может активировать Cdc14 и впоследствии сам Cdh1. Двойная отрицательная обратная связь, образованная APC-Cdh1 и Sic1, необходима для поддержания низкой активности Clb2-Cdk1, поскольку Clb2 автоматически активирует свой синтез, активируя транскрипционные факторы, комплекс Fkh2– Mcm1 Ndd1. [28]
Эукариотический клеточный цикл состоит из различных контрольных точек и петель обратной связи для обеспечения верного и успешного деления клеток. Например, во время митоза, когда дублированные хромосомы неправильно прикреплены к митотическому веретену, белки контрольной точки сборки веретена (SAC), включая Mad и Bub, ингибируют APC-Cdc20, задерживая вступление в анафазу и деградацию циклинов B-типа. Кроме того, когда митотические веретена смещены, MEN и впоследствии Cdc14 ингибируются зависимым от Bub2 и Bfa1 образом для предотвращения деградации митотических циклинов и вступления в анафазу. [36] Sic1 является хорошим примером, демонстрирующим, как взаимодействуют обратные связи на системном уровне, чтобы определять условия окружающей среды и запускать переходы клеточного цикла. Несмотря на то, что фактический переход M-G1 чрезвычайно сложен с многочисленными вовлеченными белками и регуляциями, динамический системный подход позволяет упростить эту сложную систему до бистабильного отношения ввода/вывода с двумя бифуркациями седло-узла, в которых выход (митотический выход) зависит от критической концентрации Sic1. Используя одномерный анализ, можно объяснить многие необратимые точки перехода в эукариотическом клеточном цикле, которые регулируются контролем и обратной связью на системном уровне. Другие примеры необратимых точек перехода включают Start (необратимое обязательство нового цикла деления клетки), которое можно объяснить необратимым бистабильным переключением, контрольный параметр которого жестко регулируется системными обратными связями, включающими Cln2, Whi5 и SBF. [37]