Ферменты TET представляют собой семейство метилцитозиндиоксигеназ транслокации ten-eleven (TET) . Они играют важную роль в деметилировании ДНК . 5-Метилцитозин (см. первый рисунок) представляет собой метилированную форму основания ДНК цитозина (C), которая часто регулирует транскрипцию генов и имеет несколько других функций в геноме. [1]
Деметилирование ферментами TET (см. второй рисунок) может изменить регуляцию транскрипции. Ферменты TET катализируют гидроксилирование ДНК 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) и могут далее катализировать окисление 5hmC до 5-формилцитозина (5fC), а затем до 5-карбоксицитозина (5caC). [2] 5fC и 5caC могут быть удалены из последовательности оснований ДНК путем репарации эксцизии оснований и заменены цитозином в последовательности оснований.
Ферменты TET играют центральную роль в деметилировании ДНК, необходимом во время эмбриогенеза, гаметогенеза, памяти, обучения , привыкания и восприятия боли . [3]
Три родственных гена TET , TET1 , TET2 и TET3, кодируют соответственно три родственных белка млекопитающих TET1, TET2 и TET3. Все три белка обладают 5mC оксидазной активностью, но они различаются по доменной архитектуре. [4] Белки TET представляют собой крупные (~180-230-кДа) многодоменные ферменты. Все белки TET содержат консервативный домен двухцепочечной β-спирали (DSBH), богатый цистеином домен и сайты связывания для кофакторов Fe(II) и 2-оксоглутарата (2-OG), которые вместе образуют основную каталитическую область на C-конце . В дополнение к своему каталитическому домену полноразмерные белки TET1 и TET3 имеют N-концевой домен цинкового пальца CXXC, который может связывать ДНК. [5] У белка TET2 отсутствует домен CXXC, но ген IDAX , соседствующий с геном TET2, кодирует белок CXXC4. Считается, что IDAX играет роль в регуляции активности TET2, способствуя его привлечению к неметилированным CpG.
Три гена TET экспрессируются как различные изоформы , включая по крайней мере две изоформы TET1, три изоформы TET2 и три изоформы TET3. [2] [6] Различные изоформы генов TET экспрессируются в различных клетках и тканях. Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, фактически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и первичными половыми клетками (PGC). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере у мыши, возникает из-за использования альтернативного промотора, который приводит к короткому транскрипту и укороченному белку, обозначенному TET1s. Три изоформы TET2 возникают из различных промоторов. Они экспрессируются и активны в эмбриогенезе и дифференцировке кроветворных клеток . Изоформы TET3 — это полноразмерная форма TET3FL, короткая форма сплайс-варианта TET3s и форма, которая встречается в ооцитах, обозначенная TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и на стадии одной клетки зиготы и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в любом другом типе клеток или ткани взрослой мыши, протестированной в эксперименте. В то время как экспрессия TET1 едва обнаруживается в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется лишь умеренно, вариант TET3 TET3o демонстрирует чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на стадии двух клеток. Похоже, что TET3o, высокий в ооцитах и зиготах на стадии одной клетки, является основным ферментом TET, используемым, когда происходит почти 100% быстрое деметилирование в отцовском геноме сразу после оплодотворения и до начала репликации ДНК (см. Деметилирование ДНК ).
Многие различные белки связываются с определенными ферментами TET и рекрутируют TET в определенные геномные местоположения. В некоторых исследованиях необходим дальнейший анализ, чтобы определить, является ли взаимодействие per se посредником рекрутирования или вместо этого взаимодействующий партнер помогает установить благоприятную хроматиновую среду для связывания TET. Клетки с истощением TET1 и TET2 выявили различные целевые предпочтения этих двух ферментов, с предпочитающими TET1 промоторами и предпочитающими TET2 генными телами высокоэкспрессируемых генов и энхансеров. [7]
Три ДНК-метилтрансферазы млекопитающих (DNMT) демонстрируют сильное предпочтение к добавлению метильной группы к 5-му углероду цитозина , где за нуклеотидом цитозина следует нуклеотид гуанина в линейной последовательности оснований вдоль его направления 5' → 3' (на участках CpG ). [8] Это образует участок 5mCpG. Более 98% метилирования ДНК происходит на участках CpG в соматических клетках млекопитающих . [9] Таким образом, ферменты TET в значительной степени инициируют деметилирование на участках 5mCpG.
Оксогуанингликозилаза (OGG1) является одним из примеров белка, который рекрутирует фермент TET. TET1 способен действовать на 5mCpG, если ROS сначала подействовал на гуанин с образованием 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG или его таутомера 8-oxo-dG), что приводит к образованию динуклеотида 5mCp-8-OHdG (см. рисунок). [10] После образования 5mCp-8-OHdG фермент репарации эксцизии оснований OGG1 связывается с повреждением 8-OHdG без немедленного удаления (см. рисунок). Присоединение OGG1 к участку 5mCp-8-OHdG рекрутирует TET1 , позволяя TET1 окислять 5mC, прилегающий к 8-OHdG. Это инициирует путь деметилирования.
EGR1 — еще один пример белка, который задействует фермент TET. [11] EGR1 играет важную роль в обучении и памяти. [12] [13] Когда новое событие, такое как условно-рефлекторное состояние страха, вызывает формирование памяти, РНК-мессенджер EGR1 быстро и избирательно активируется в подмножествах нейронов в определенных областях мозга, связанных с обучением и формированием памяти. [14] TET1s — это преобладающая изоформа TET1, которая экспрессируется в нейронах. [15] Когда экспрессируются белки EGR1, они, по-видимому, переносят TET1s примерно в 600 участков в геноме нейрона. [11] Затем EGR1 и TET1, по-видимому, сотрудничают в деметилировании и, таким образом, активации экспрессии генов ниже по течению от участков связывания EGR1 в ДНК. [11]
Процессивность TET можно рассматривать на трех уровнях: физическом, химическом и генетическом. Физическая процессивность относится к способности белка TET скользить по ДНК от одного сайта CpG к другому. Исследование in vitro показало, что связанный с ДНК TET не окисляет преимущественно другие сайты CpG на той же молекуле ДНК, что указывает на то, что TET не является физически процессивным. Химическая процессивность относится к способности TET катализировать окисление 5mC итеративно до 5caC без высвобождения его субстрата. Похоже, что TET может работать как через химически процессивные, так и через непроцессивные механизмы в зависимости от условий реакции. Генетическая процессивность относится к генетическому результату окисления, опосредованного TET, в геноме, как показано путем картирования окисленных оснований. В эмбриональных стволовых клетках мыши многие геномные регионы или сайты CpG модифицированы таким образом, что 5mC изменен на 5hmC, но не на 5fC или 5caC, тогда как во многих других сайтах CpG 5mC модифицированы на 5fC или 5caC, но не на 5hmC, что позволяет предположить, что 5mC преобразуется в разные состояния в разных геномных регионах или сайтах CpG. [7]
Ферменты TET являются диоксигеназами в семействе альфа-кетоглутарат-зависимых гидроксилаз . Фермент TET является альфа-кетоглутарат (α-KG)-зависимой диоксигеназой, которая катализирует реакцию окисления путем включения одного атома кислорода из молекулярного кислорода (O 2 ) в свой субстрат, 5-метилцитозин в ДНК (5mC), для получения продукта 5-гидроксиметилцитозина в ДНК. Это преобразование сопряжено с окислением косубстрата α-KG до сукцината и диоксида углерода (см. рисунок).
Первый шаг включает связывание α-KG и 5-метилцитозина с активным сайтом фермента TET. Каждый из ферментов TET содержит основной каталитический домен с двухцепочечной β-спиральной складкой, которая содержит критически важные остатки связывания металлов, обнаруженные в семействе Fe(II)/α-KG-зависимых оксигеназ. [16] α-KG координируется как бидентатный лиганд (связанный в двух точках) с Fe(II) (см. рисунок), в то время как 5mC удерживается нековалентной силой в непосредственной близости. Активный сайт TET содержит высококонсервативный триадный мотив, в котором каталитически необходимый Fe(II) удерживается двумя остатками гистидина и одним остатком аспарагиновой кислоты (см. рисунок). Триада связывается с одной стороной центра Fe, оставляя три лабильных сайта, доступных для связывания α-KG и O2 ( см. рисунок). Затем ТЕТ преобразует 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин, в то время как α-кетоглутарат преобразуется в сукцинат и CO2 .
Белки TET также обладают активностью, которая не зависит от деметилирования ДНК. [17] К ним относится, например, взаимодействие TET2 с O -связанной N -ацетилглюкозамин ( O-GlcNAc ) трансферазой для содействия ацилированию гистона O-GlcN с целью влияния на транскрипцию целевых генов. [18]
Геном сперматозоидов мышей на 80–90% метилирован в участках CpG в ДНК, что составляет около 20 миллионов метилированных участков. [19] После оплодотворения , в начале первого дня эмбриогенеза , отцовские хромосомы почти полностью деметилируются в течение шести часов с помощью активного процесса, зависящего от ТЕТ, прежде чем начинается репликация ДНК (синяя линия на рисунке).
Деметилирование материнского генома происходит другим способом. В зрелом ооците около 40% его участков CpG в ДНК метилированы. В эмбрионе до имплантации и до стадии бластоцисты (см. рисунок) единственная присутствующая метилтрансфераза — это изоформа DNMT1, обозначенная как DNMT1o. [20] Похоже, что деметилирование материнских хромосом в основном происходит путем блокирования метилирующего фермента DNMT1o от проникновения в ядро, за исключением короткого периода на стадии 8 клеток (см. Деметилирование ДНК ). Таким образом, ДНК материнского происхождения подвергается пассивному деметилированию путем разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). Морула ( на стадии 16 клеток) имеет лишь небольшое количество метилирования ДНК (черная линия на рисунке).
Недавно сформированные первичные половые клетки (ППК) в имплантированном эмбрионе эволюционируют из соматических клеток примерно на 7-й день эмбриогенеза у мыши. На этом этапе ППК имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют из эпибласта в сторону гонадного гребня . Как было рассмотрено Мессершмидтом и др. [21], большинство ППК останавливаются в фазе G 2 клеточного цикла, пока они мигрируют в сторону задней кишки в течение 7,5–8,5 дней эмбриона. Затем деметилирование ППК происходит двумя волнами. [21] Существует как пассивное, так и активное, ТЕТ-зависимое деметилирование первичных половых клеток. На 9,5-й день первичные половые клетки начинают быстро реплицироваться, начиная с примерно 200 ППК на 9,5-й день эмбриона до примерно 10 000 ППК на 12,5-й день. [22] В течение 9,5–12,5 дней DNMT3a и DNMT3b подавляются, а DNMT1 присутствует в ядре на высоком уровне. Но DNMT1 не может метилировать цитозины в течение 9,5–12,5 дней, поскольку ген UHRF1 (также известный как NP95 ) подавляется, а UHRF1 является необходимым белком, необходимым для привлечения DNMT1 в очаги репликации, где происходит поддерживающее метилирование ДНК. [22] Это пассивная, разбавляющая форма деметилирования.
Кроме того, с 9,5 по 13,5 день эмбриона происходит активная форма деметилирования. Как указано на рисунке пути деметилирования выше, два фермента играют центральную роль в активном деметилировании. Это метилцитозиндиоксигеназа транслокации ten-eleven (TET) и тимин-ДНК-гликозилаза (TDG). Один конкретный фермент TET, TET1 и TDG, присутствуют на высоких уровнях с 9,5 по 13,5 день эмбриона [22] и используются в активном TET-зависимом деметилировании во время гаметогенеза. [21] Геномы PGC демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди всех клеток за весь жизненный цикл мыши к 13,5 дню эмбриона. [23]
Обучение и память имеют уровни постоянства, отличающиеся от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые являются временными по своей природе. Обучение и память могут накапливаться либо медленно (таблицы умножения), либо быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды достигнутые, могут быть вызваны для сознательного использования в течение длительного времени. Крысы, подвергнутые одному случаю контекстного условного рефлекса страха, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 часа после обучения было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крысы были дифференциально метилированы . Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после обучения, причем более 500 генов были деметилированы. [24] Аналогичные результаты, полученные в гиппокампе крысы, были получены и у мышей с контекстным условным рефлексом страха. [25]
Область гиппокампа мозга — это место, где сначала хранятся контекстные воспоминания о страхе (см. рисунок), но это хранение является временным и не остается в гиппокампе. У крыс контекстное условное замирание отменяется, когда гиппокамп подвергается гиппокампэктомии всего через день после обусловливания, но крысы сохраняют значительное количество контекстного страха, когда гиппокампэктомия откладывается на четыре недели. [26] У мышей, обследованных через 4 недели после обусловливания, метилирование и деметилирование гиппокампа были обращены вспять (гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся), в то время как существенное дифференциальное метилирование и деметилирование CpG произошло в корковых нейронах во время поддержания памяти. В передней поясной коре (см. рисунок) мышей было 1223 дифференциально метилированных гена (см. рисунок) через четыре недели после контекстного условного замирания. Таким образом, хотя вскоре после формирования памяти в гиппокампе наблюдалось множество метилирований, все эти метилирования в гиппокампе были деметилированы уже через четыре недели.
Ли и др. [27] сообщили об одном примере связи между экспрессией белка TET, деметилированием и памятью при использовании обучения угасанию . Обучение угасанию — это исчезновение ранее изученного поведения, когда поведение не подкрепляется.
Сравнение образцов нейронов инфралимбической префронтальной коры (ILPFC), полученных от мышей, обученных бояться слухового сигнала, и мышей, обученных угасанию, выявило существенные различия в геноме, зависящие от опыта, в накоплении 5-hmC в ILPFC в ответ на обучение. Обучение угасанию привело к значительному повышению уровней РНК-мессенджера TET3 в корковых нейронах. TET3 избирательно активировался в неокортексе взрослого человека в зависимости от опыта.
Короткая шпилечная РНК (shRNA) — это искусственная молекула РНК с плотным шпилечным поворотом, которая может быть использована для подавления экспрессии целевого гена посредством РНК-интерференции . Мыши, обученные в присутствии нацеленной на TET3 shRNA, показали значительное ухудшение памяти об угасании страха. [27]
Прилежащее ядро ( NAc) играет важную роль в зависимости . В прилежащем ядре мышей повторное воздействие кокаина привело к снижению РНК-мессенджера TET1 (мРНК) и снижению экспрессии белка TET1. Аналогично, наблюдалось снижение мРНК TET1 на ~40% в NAc у людей, страдающих кокаиновой зависимостью, при посмертном обследовании. [28]
Как указано выше в обучении и памяти, короткая шпилечная РНК (shRNA) представляет собой искусственную молекулу РНК с плотным шпилечным поворотом, которая может быть использована для подавления экспрессии целевого гена с помощью РНК-интерференции . Фэн и др. [28] вводили shRNA, нацеленную на TET1, в NAc мышей. Это могло снизить экспрессию TET1 таким же образом, как снижение экспрессии TET1 при воздействии кокаина. Затем они использовали косвенную меру зависимости, обусловленное предпочтение места . Обусловленное предпочтение места может измерять количество времени, которое животное проводит в области, которая была связана с воздействием кокаина, и это может указывать на зависимость от кокаина. Сниженная экспрессия Tet1 , вызванная shRNA, введенной в NAc, надежно усилила обусловленность места кокаином.
Как описано в статье Ноцицепция , ноцицепция — это реакция сенсорной нервной системы на вредные стимулы, такие как токсичное химическое вещество, нанесенное на ткань. При ноцицепции химическая стимуляция сенсорных нервных клеток, называемых ноцицепторами, производит сигнал, который проходит по цепочке нервных волокон через спинной мозг в головной мозг . Ноцицепция запускает различные физиологические и поведенческие реакции и обычно приводит к субъективному переживанию или восприятию боли .
Работа Пана и соавторов [3] впервые показала, что белки TET1 и TET3 обычно присутствуют в спинном мозге мышей. Они использовали модель вызывания боли интраплантарной инъекцией 5% формалина в дорсальную поверхность задней лапы мыши и измеряли время облизывания задней лапы в качестве меры вызванной боли. Экспрессия белков TET1 и TET3 увеличилась на 152% и 160% соответственно через 2 часа после инъекции формалина. Принудительное снижение экспрессии TET1 или TET3 путем спинальной инъекции Tet1-siRNA или Tet3-siRNA в течение трех последовательных дней перед инъекцией формалина облегчило восприятие боли мышами. С другой стороны, принудительная сверхэкспрессия TET1 или TET3 в течение 2 последовательных дней значительно вызывала поведение, подобное боли, о чем свидетельствует снижение у мышей порога тепловой боли.
Они также показали, что эффекты ноцицептивной боли происходили посредством опосредованного TET преобразования 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в промоторе микроРНК , обозначенной miR-365-3p , тем самым увеличивая его экспрессию. Эта микроРНК, в свою очередь, обычно нацелена (снижает экспрессию) на информационную РНК Kcnh2 , которая кодирует белок, известный как K v 11.1 или KCNH2 . KCNH2 является альфа- субъединицей калиевого ионного канала в центральной нервной системе . Принудительное снижение экспрессии TET1 или TET3 посредством предварительной инъекции siRNA обратило снижение белка KCNH2 у мышей, обработанных формалином.