Цилиндроспермопсин (сокращенно CYN или CYL ) — цианотоксин, вырабатываемый различными пресноводными цианобактериями . [1] CYN — это полициклическое производное урацила , содержащее гуанидино- и сульфатные группы. Он также является цвиттер-ионным , что делает его высокорастворимым в воде . CYN токсичен для тканей печени и почек и, как полагают, подавляет синтез белка и ковалентно модифицирует ДНК и/или РНК . Неизвестно, является ли цилиндроспермопсин канцерогеном , но, по-видимому, он не вызывает опухолей у мышей. [2]
CYN был впервые обнаружен после вспышки загадочной болезни на острове Палм-Айленд , Квинсленд , Австралия . Вспышка была прослежена до цветения Cylindrospermopsis raciborskii в местном питьевом водоснабжении, и токсин был впоследствии идентифицирован. Анализ токсина привел к предложенной химической структуре в 1992 году, которая была пересмотрена после того, как синтез был достигнут в 2000 году. Было выделено или синтезировано несколько аналогов CYN, как токсичных, так и нетоксичных.
C. raciborskii в основном наблюдался в тропических районах, однако недавно был обнаружен в умеренных регионах Австралии , Северной и Южной Америки , Новой Зеландии и Европы . [3] Однако штамм C. raciborskii, продуцирующий CYN, в Европе не был идентифицирован, несколько других видов цианобактерий, встречающихся по всему континенту, способны синтезировать его. [3]
В 1979 году 138 жителей острова Палм-Айленд , Квинсленд , Австралия , были госпитализированы с различными симптомами гастроэнтерита . Все они были детьми; кроме того, 10 взрослых были поражены, но не госпитализированы. Первоначальные симптомы, включая боль в животе и рвоту , напоминали симптомы гепатита ; более поздние симптомы включали почечную недостаточность и кровавую диарею . Анализ мочи выявил высокие уровни белков , кетонов и сахара у многих пациентов, а также крови и уробилиногена в меньших количествах. Анализ мочи, наряду с микроскопией кала и скринингом на отравления , не смогли предоставить статистическую связь с симптомами. Все пациенты выздоровели в течение 4–26 дней, и на тот момент не было никакой очевидной причины вспышки. Первоначальные мысли о причине включали плохое качество воды и диету, однако ни одна из них не была окончательной, и болезнь была названа «загадочной болезнью острова Палм». [4]
В то время было замечено, что эта вспышка совпала с сильным цветением водорослей в местном питьевом водоснабжении, и вскоре после этого внимание переключилось на рассматриваемую плотину. Эпидемиологическое исследование этой «загадочной болезни» позже подтвердило, что в этом замешана плотина Соломон , поскольку заболевшие использовали воду из плотины. Стало очевидно, что недавняя обработка цветения водорослей сульфатом меди вызвала лизис клеток водорослей, высвобождая токсин в воду. [5] Исследование плотины показало, что периодическое цветение водорослей было вызвано преимущественно тремя штаммами цианобактерий : двумя из рода Anabaena и Cylindrospermopsis raciborskii , ранее неизвестными в австралийских водах. [6] Биопроба трех из них на мышах показала, что, хотя два штамма Anabaena были нетоксичными, C. raciborskii был высокотоксичным. [7] Позднее выделение ответственного соединения привело к идентификации токсина цилиндроспермопсина. [8]
В более позднем отчете альтернативно предлагалось, что причиной заболевания был избыток меди в воде. Чрезмерная дозировка была следствием использования подрядчиков с наименьшими затратами для борьбы с водорослями, которые не были квалифицированы в этой области. [9]
Изоляция токсина с использованием цианобактерий, выращенных из исходного штамма Palm Island, была достигнута путем гель-фильтрации водного экстракта с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ . Выяснение структуры было достигнуто с помощью масс-спектрометрии (МС) и экспериментов ядерного магнитного резонанса (ЯМР), и была предложена структура (позже доказано, что она была немного неверной) (рисунок 1). [8]
Эта почти правильная молекула обладает трициклической гуанидиновой группой (кольца A, B и C), а также урациловым кольцом (D). Цвиттерионная природа молекулы делает ее высокорастворимой в воде, поскольку наличие заряженных областей внутри молекулы создает дипольный эффект, подходящий для полярного растворителя . Чувствительность ключевых сигналов в спектре ЯМР к небольшим изменениям pH предполагает, что урациловое кольцо существует в кето / енольной таутомерной связи, где перенос водорода приводит к двум различным структурам (рисунок 2). Первоначально предполагалось, что водородная связь между урациловой и гуанидиновой группами в енольной таутомере сделает эту форму доминирующей. [8]
Второй метаболит C. raciborskii был идентифицирован из экстрактов цианобактерий после наблюдения часто встречающегося пика, сопровождающего пик CYN во время экспериментов с УФ и МС. Анализ методами МС и ЯМР показал, что это новое соединение не имеет кислорода, смежного с урациловым кольцом, и было названо дезоксицилиндроспермопсином (рисунок 3). [10]
В 1999 году эпимер CYN, названный 7-эпициклиндроспермопсин (epiCYN), был также идентифицирован как второстепенный метаболит из Aphanizomenon ovalisporum . Это произошло при выделении CYN из цианобактерий, взятых из озера Кинерет в Израиле . [11] Предложенная структура этой молекулы отличалась от CYN только ориентацией гидроксильной группы, прилегающей к кольцу урацила (рисунок 4).
Синтетические подходы к CYN начинались с пиперидинового кольца (A) и прогрессировали до аннелирования колец B и C. [12] Первый полный синтез CYN был зарегистрирован в 2000 году с помощью 20-шагового процесса. [13]
Улучшения синтетических методов привели к пересмотру стереохимии CYN в 2001 году. Синтетический процесс, контролирующий каждый из шести стереогенных центров epiCYN, установил, что исходные назначения как CYN, так и epiCYN были на самом деле инверсией правильных структур. [14] Альтернативный подход Уайта и Хансена подтвердил эти абсолютные конфигурации (рисунок 5). [15] Во время этого правильного назначения предполагалось, что енольная форма не была доминирующей. [14]
Одним из ключевых факторов, связанных с токсичностью CYN, является его стабильность . Хотя было обнаружено, что токсин быстро разлагается в экстракте водорослей при воздействии солнечного света , он устойчив к разложению при изменении pH и температуры и не разлагается ни в чистом твердом виде, ни в чистой воде. В результате в мутной и неподвижной воде токсин может сохраняться в течение длительного времени, и хотя кипячение воды убьет цианобактерии, оно может не удалить токсин. [16]
Хокинс и др . продемонстрировали токсические эффекты CYN с помощью биопробы на мышах, используя экстракт исходного штамма Palm Island. У мышей с острым отравлением наблюдалась анорексия , диарея и затрудненное дыхание . Результаты вскрытия выявили кровоизлияния в легкие , печень , почки , тонкий кишечник и надпочечники . Гистопатология выявила дозозависимый некроз гепатоцитов , накопление липидов и образование фибриновых тромбов в кровеносных сосудах печени и легких, а также различный некроз эпителиальных клеток в областях почек. [7]
Более поздний биоанализ на мышах эффектов цилиндроспермопсина выявил увеличение веса печени как при летальных, так и при нелетальных дозах; кроме того, печень выглядела темной. Обширный некроз гепатоцитов был виден у мышей, которым вводили летальную дозу, а некоторые локализованные повреждения также наблюдались у мышей, которым вводили нелетальную дозу. [17]
Первоначальная оценка токсичности CYN в 1985 году заключалась в том, что LD 50 за 24 часа составила 64±5 мг лиофилизированной культуры/кг веса тела мыши при внутрибрюшинной инъекции . [7] В ходе дальнейшего эксперимента в 1997 году LD 50 была измерена как 52 мг/кг за 24 часа и 32 мг/кг за 7 дней, однако данные предполагали, что в изоляте использованных обработанных ультразвуком клеток присутствовало другое токсичное соединение ; [18] прогнозы, сделанные Охтани и др. [8] относительно 24-часовой токсичности, были значительно выше, и было высказано предположение, что присутствовал другой метаболит, объясняющий относительно низкий измеренный уровень 24-часовой токсичности. [18]
Поскольку наиболее вероятным путем поглощения CYN человеком является прием внутрь, эксперименты по пероральной токсичности были проведены на мышах. Пероральная LD 50 составила 4,4-6,9 мг CYN/кг, и в дополнение к некоторому изъязвлению слизистой оболочки пищевода и желудка , симптомы соответствовали симптомам внутрибрюшинного введения. Содержимое желудка включало культуральный материал, что указывало на то, что эти цифры LD 50 могут быть завышены. [19]
Другой способ воздействия CYN связан с изменениями в микробиоме кишечника из-за искусственных подсластителей. Исследование, включающее аспартам, проведенное в Cedars-Sinai в Лос-Анджелесе Ручи Матуром, доктором медицины, обнаружило CYN в двенадцатиперстной кишке на уровнях, в четыре раза превышающих исходные значения у пользователей аспартама, наряду с изменениями в бактериальных видах. [20]
Патологические изменения , связанные с отравлением CYN, как сообщалось, происходили в четыре отдельные стадии: ингибирование синтеза белка , пролиферация мембран , накопление липидов внутри клеток и, наконец, гибель клеток . Исследование печени мышей, удаленной при вскрытии, показало, что при внутрибрюшинной инъекции CYN через 16 часов рибосомы из шероховатого эндоплазматического ретикулума (rER) отсоединялись, а через 24 часа наблюдалась выраженная пролиферация мембранных систем гладкого ER и аппарата Гольджи . Через 48 часов в телах клеток накапливались небольшие липидные капли, а через 100 часов гепатоциты в печеночных дольках были разрушены до неспособности выполнять свои функции. [21]
Было показано, что процесс ингибирования синтеза белка необратим, однако это не окончательно метод цитотоксичности соединения. Froscio et al. . предположили, что CYN имеет по крайней мере два отдельных способа действия: ранее описанное ингибирование синтеза белка и пока неясный метод, вызывающий гибель клеток. Было показано, что клетки могут выживать в течение длительных периодов (до 20 часов) с 90% ингибированием синтеза белка и по-прежнему сохранять жизнеспособность. [22] Поскольку CYN цитотоксичен в течение 16–18 часов [23], было высказано предположение, что причиной гибели клеток являются другие механизмы.
Цитохром P450 участвует в токсичности CYN, поскольку блокирование действия P450 снижает токсичность CYN. [24] Было высказано предположение, что активированный метаболит (или метаболиты) CYN, полученный из P450, является основной причиной токсичности. [22] Шоу и др . продемонстрировали, что токсин может метаболизироваться in vivo , что приводит к образованию связанных метаболитов в печеночной ткани, и что повреждение было более распространено в гепатоцитах крыс, чем в других типах клеток. [25]
Из-за структуры CYN, которая включает сульфатные , гуанидиновые и урациловые группы, было высказано предположение, что CYN действует на ДНК или РНК . Шоу и др . сообщили о ковалентном связывании CYN или его метаболитов с ДНК у мышей [25] , а также наблюдался разрыв цепи ДНК [26] . Хампаж и др. также поддержали это и, кроме того, постулировали, что CYN (или метаболит) действует либо на веретено , либо на центромеры во время деления клетки , вызывая потерю целых хромосом [27] .
Группа урацила CYN была идентифицирована как фармакофор токсина. В двух экспериментах винильный атом водорода на кольце урацила был заменен атомом хлора с образованием 5-хлорцилиндроспермопсина, а группа урацила была усечена до карбоновой кислоты с образованием цилиндроспермовой кислоты (рисунок 6). Оба продукта были оценены как нетоксичные , даже при 50-кратном превышении LD 50 CYN. [28] В предыдущем определении структуры дезоксицилиндроспермопсина была проведена оценка токсичности соединения. Мыши, которым внутрибрюшинно вводили четырехкратную 5-дневную среднюю летальную дозу CYN, не показали токсических эффектов. Поскольку было показано, что это соединение относительно распространено, был сделан вывод, что этот аналог был сравнительно нетоксичен. [10] Учитывая , что и CYN, и epiCYN токсичны, [11] гидроксильную группу на урациловом мостике можно считать необходимой для токсичности. До сих пор относительная токсичность CYN и epiCYN не сравнивалась.
Биосинтетический кластер генов цилиндроспермопсина (BGC) был описан у Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 в 2008 году. [29]
После вспышки на острове Палм-Айленд было выявлено несколько других видов цианобактерий, продуцирующих CYN: Anabaena bergii , Anabaena lapponica , [30] Aphanizomenon ovalisporum , [31] Umezakia natans , [32] Raphidiopsis curvata . [33] и Aphanizomenon issatschenkoi . [34] В Австралии существуют три основных токсичных цианобактерии: Anabaena circinalis , виды Microcystis и C. raciborskii . Из них последняя, которая продуцирует CYN, привлекла значительное внимание не только из-за вспышки на острове Палм-Айленд, но и из-за того, что вид распространяется в более умеренные районы. Ранее водоросли классифицировались только как тропические , однако недавно они были обнаружены в умеренных регионах Австралии, Европы , [3] Северной и Южной Америки , [6] а также Новой Зеландии . [35]
В августе 1997 года три коровы и десять телят умерли от отравления цилиндроспермопсином на ферме на северо-западе Квинсленда. Была проверена близлежащая плотина, содержащая цветение водорослей, и был идентифицирован C. raciborskii . Анализ с помощью ВЭЖХ / масс-спектрометрии выявил наличие CYN в образце биомассы . Вскрытие одного из телят показало опухшую печень и желчный пузырь , а также кровоизлияния в сердце и тонкий кишечник . Гистологическое исследование печеночной ткани соответствовало результатам, полученным у мышей, пораженных CYN. [17] Это был первый отчет о том, что C. raciborskii стал причиной смертности животных в Австралии.
Влияние цветения C. raciborskii на пруд аквакультуры в Таунсвилле , Австралия, было оценено в 1997 году. В пруду содержались красноклешневые раки , а также популяция радужных рыб озера Эачем для контроля избытка пищи. Анализ показал, что вода содержала как внеклеточный , так и внутриклеточный CYN, и что раки накапливали его в первую очередь в печени, но также и в мышечной ткани. Исследование содержимого кишечника выявило клетки цианобактерий , что указывало на то, что рак проглотил внутриклеточный токсин. Эксперимент с использованием экстракта цветения показал, что также возможно поглощение внеклеточного токсина непосредственно тканями. Такое бионакопление , особенно в аквакультурной отрасли, вызывало беспокойство, особенно когда конечными пользователями продукта были люди. [36]
Влияние цветения цианобактерий было оценено с экономической точки зрения. В декабре 1991 года крупнейшее в мире цветение водорослей произошло в Австралии, где было затронуто 1000 км реки Дарлинг - Барвон . [37] Один миллион человеко-дней питьевой воды был потерян, а прямые понесенные расходы составили более 1,3 млн австралийских долларов . Более того, 2000 мест-дней отдыха также были потеряны, а экономические издержки были оценены в 10 млн австралийских долларов, после учета косвенно затронутых отраслей, таких как туризм , размещение и транспорт . [38]
Современные методы включают жидкостную хроматографию, сопряженную с масс-спектрометрией ( ЖХ-МС ), [39] [40] биоанализ мышей, [41] анализ ингибирования синтеза белка и анализ HPLC-PDA (фотодиодная матрица) с обратной фазой. Разработан анализ синтеза белка без клеток, который, по-видимому, сопоставим с HPLC-MS. [20]
{{cite journal}}
: CS1 maint: дата и год ( ссылка )