Цинковый палец — это небольшой структурный мотив белка , который характеризуется координацией одного или нескольких ионов цинка (Zn 2+ ), что стабилизирует складку. Первоначально он был придуман для описания пальцевидного вида гипотетической структуры фактора транскрипции IIIA африканской шпорцевой лягушки ( Xenopus laevis ) . Однако было обнаружено, что он охватывает широкий спектр различных структур белка в эукариотических клетках. [1] Первоначально было показано, что TFIIIA Xenopus laevis содержит цинк и требует металла для функционирования в 1983 году, это первое подобное зарегистрированное требование цинка для белка, регулирующего ген [2] [3], за которым вскоре последовал фактор Крюппеля у дрозофилы . [4] Он часто появляется как домен связывания металла в многодоменных белках. [3]
Белки, содержащие цинковые пальцы ( белки цинковых пальцев ), классифицируются по нескольким различным структурным семействам. В отличие от многих других четко определенных супервторичных структур, таких как греческие ключи или β-шпильки , существует ряд типов цинковых пальцев, каждый из которых имеет уникальную трехмерную архитектуру. Класс конкретного белка цинковых пальцев определяется его трехмерной структурой, но его также можно распознать на основе первичной структуры белка или идентичности лигандов, координирующих ион цинка. Однако, несмотря на большое разнообразие этих белков, подавляющее большинство обычно функционируют как модули взаимодействия, которые связывают ДНК , РНК , белки или другие небольшие полезные молекулы, а изменения в структуре служат в первую очередь для изменения специфичности связывания конкретного белка.
С момента их первоначального открытия и выяснения их структуры эти модули взаимодействия оказались повсеместными в биологическом мире и могут быть обнаружены в 3% генов человеческого генома. [5] Кроме того, цинковые пальцы стали чрезвычайно полезными в различных терапевтических и исследовательских целях. Инженерия цинковых пальцев, имеющих сродство к определенной последовательности, является областью активных исследований, и нуклеазы цинковых пальцев и факторы транскрипции цинковых пальцев являются двумя из наиболее важных применений этого, которые были реализованы на сегодняшний день.
Цинковые пальцы были впервые идентифицированы в исследовании транскрипции у африканской шпорцевой лягушки , Xenopus laevis, в лаборатории Аарона Клуга . Исследование транскрипции определенной последовательности РНК показало, что прочность связывания небольшого фактора транскрипции (фактор транскрипции IIIA; TFIIIA) была обусловлена наличием координирующих цинк пальцеобразных структур. [6] Аминокислотное секвенирование TFIIIA выявило девять тандемных последовательностей из 30 аминокислот, включая две инвариантные пары остатков цистеина и гистидина. Расширенная тонкая структура поглощения рентгеновских лучей подтвердила идентичность лигандов цинка: два цистеина и два гистидина. [5] Считалось, что ДНК-связывающая петля, образованная координацией этих лигандов цинком, напоминает пальцы, отсюда и название. [1] Вскоре после этого в 1986 году группа Шуха открыла фактор Крюппеля у дрозофилы. [4] Более поздние работы по характеристике белков в различных организмах выявили важность ионов цинка в стабилизации полипептидов. [7] [8]
Кристаллические структуры комплексов цинковый палец-ДНК, решенные в 1991 и 1993 годах, выявили каноническую схему взаимодействия цинковых пальцев с ДНК. [9] [10] Обнаружено, что связывание цинкового пальца отличается от многих других ДНК-связывающих белков, которые связывают ДНК через 2-кратную симметрию двойной спирали, вместо этого цинковые пальцы связаны линейно в тандеме для связывания последовательностей нуклеиновых кислот различной длины. [5] Цинковые пальцы часто связываются с последовательностью ДНК, известной как GC-бокс . [11] Модульная природа мотива цинкового пальца позволяет связывать большое количество комбинаций последовательностей ДНК и РНК с высокой степенью сродства и специфичности и, следовательно, идеально подходит для конструирования белка, который может быть нацелен на определенные последовательности ДНК и связывать их. В 1994 году было показано, что искусственно сконструированный трехпальцевый белок может блокировать экспрессию онкогена в линии клеток мыши. С тех пор были созданы цинковые пальцы, слитые с различными другими эффекторными доменами, некоторые из которых имеют терапевтическое значение. [5]
Его важность была настолько велика, что «мотив цинкового пальца» был упомянут в «Научном обосновании» Нобелевской премии по химии 2024 года (присужденной Дэвиду Бейкеру , Демису Хассабису и Джону М. Джамперу за вычислительный дизайн белка и предсказание структуры белка) [12] .
Домены цинковых пальцев (Znf) представляют собой относительно небольшие белковые мотивы , которые содержат несколько пальцевидных выступов, которые создают тандемные контакты с целевой молекулой. Некоторые из этих доменов связывают цинк, но многие этого не делают, вместо этого связывая другие металлы, такие как железо, или вообще не связывая металл. Например, некоторые члены семейства образуют солевые мостики для стабилизации пальцевидных складок . Впервые они были идентифицированы как ДНК-связывающий мотив в факторе транскрипции TFIIIA из Xenopus laevis (африканская шпорцевая лягушка), однако теперь признано, что они связывают ДНК, РНК, белок и/или липидные субстраты . [13] [14] [15] [16] [17] Их связывающие свойства зависят от аминокислотной последовательности доменов пальцев и от линкера между пальцами, а также от структур более высокого порядка и количества пальцев. Домены Znf часто встречаются в кластерах, где пальцы могут иметь различную специфичность связывания. Мотивы Znf встречаются в нескольких неродственных суперсемействах белков , различающихся как последовательностью, так и структурой. Они демонстрируют значительную универсальность в режимах связывания, даже между членами одного класса (например, некоторые связывают ДНК, другие — белок), что позволяет предположить, что мотивы Znf являются стабильными каркасами, которые развили специализированные функции. Например, белки, содержащие Znf, функционируют в транскрипции генов , трансляции, транспорте мРНК, организации цитоскелета , развитии эпителия , клеточной адгезии , сворачивании белков, ремоделировании хроматина и распознавании цинка, и это лишь некоторые из них. [18] Мотивы связывания цинка являются стабильными структурами, и они редко претерпевают конформационные изменения при связывании со своей целью.
Первоначально термин «цинковый палец» использовался исключительно для описания ДНК-связывающего мотива, обнаруженного в Xenopus laevis ; однако теперь он используется для обозначения любого количества структур, связанных посредством их координации иона цинка. В целом, цинковые пальцы координируют ионы цинка с комбинацией остатков цистеина и гистидина . Первоначально количество и порядок этих остатков использовались для классификации различных типов цинковых пальцев (например, Cys 2 His 2 , Cys 4 и Cys 6 ). Совсем недавно вместо этого был использован более систематический метод для классификации белков цинковых пальцев. Этот метод классифицирует белки цинковых пальцев в «группы складок» на основе общей формы белкового остова в складчатом домене. Наиболее распространенными «группами складок» цинковых пальцев являются Cys 2 His 2 -подобные («классический цинковый палец»), скрипичный ключ и цинковая лента. [19]
В следующей таблице [19] показаны различные структуры и их основные характеристики:
Группа складок Cys 2 His 2 (C2H2) является наиболее охарактеризованным классом цинковых пальцев и распространена в факторах транскрипции млекопитающих. Такие домены принимают простую складку ββα и имеют мотив аминокислотной последовательности : [20]
Этот класс цинковых пальцев может иметь множество функций, таких как связывание РНК и посредничество белок-белковых взаимодействий, но наиболее известен своей ролью в последовательно-специфичных ДНК-связывающих белках, таких как Zif268 (Egr1). В таких белках отдельные домены цинковых пальцев обычно встречаются в виде тандемных повторов с двумя, тремя или более пальцами, составляющими ДНК-связывающий домен белка. Эти тандемные массивы могут связываться в большой бороздке ДНК и обычно расположены с интервалом в 3 п.н. α-спираль каждого домена (часто называемая «спиралью распознавания») может создавать последовательность-специфичные контакты с основаниями ДНК; остатки из одной спирали распознавания могут связываться с четырьмя или более основаниями, образуя перекрывающийся рисунок контактов с соседними цинковыми пальцами.
Эта складчатая группа определяется двумя короткими β-цепями, соединенными поворотом (цинковым остовом), за которым следует короткая спираль или петля, и напоминает классический мотив Cys 2 His 2 с укороченной большой частью спирали и β-шпилькой.
Белок ретровирусного нуклеокапсида (NC) ВИЧ и других родственных ретровирусов являются примерами белков, обладающих этими мотивами. Цинковый палец gag-knuckle в белке NC ВИЧ является целью класса препаратов, известных как ингибиторы цинковых пальцев .
Мотив скрипичного ключа состоит из β-шпильки на N-конце и α-спирали на C-конце, каждая из которых вносит два лиганда для связывания цинка, хотя между N-концевой β-шпилькой и C-концевой α-спиралью могут присутствовать петля и вторая β-шпилька различной длины и конформации. Эти пальцы присутствуют в разнообразной группе белков, которые часто не имеют общей последовательности или функционального сходства друг с другом. Наиболее охарактеризованными белками, содержащими цинковые пальцы скрипичного ключа, являются ядерные гормональные рецепторы .
Складка цинковой ленты характеризуется двумя бета-шпильками, образующими два структурно схожих участка связывания цинка.
Канонические члены этого класса содержат двуядерный цинковый кластер, в котором два иона цинка связаны шестью остатками цистеина . Эти цинковые пальцы можно найти в нескольких факторах транскрипции, включая белок дрожжей Gal4 .
Антивирусный белок цинковый палец (ZAP ) связывается с сайтом CpG. Используется млекопитающими для противовирусной защиты. [21] [22]
Различные методы белковой инженерии могут быть использованы для изменения специфичности связывания ДНК цинковых пальцев [20] , а тандемные повторы таких сконструированных цинковых пальцев могут быть использованы для нацеливания желаемых последовательностей геномной ДНК. [23] Слияние второго домена белка, такого как транскрипционный активатор или репрессор, с массивом сконструированных цинковых пальцев, которые связываются вблизи промотора данного гена, может быть использовано для изменения транскрипции этого гена. [23] Слияния между сконструированными массивами цинковых пальцев и белковыми доменами, которые расщепляют или иным образом модифицируют ДНК, также могут быть использованы для нацеливания этих активностей на желаемые геномные локусы. [23] Наиболее распространенные приложения для сконструированных массивов цинковых пальцев включают факторы транскрипции цинковых пальцев и нуклеазы цинковых пальцев , но были описаны и другие приложения. Типичные сконструированные массивы цинковых пальцев имеют от 3 до 6 отдельных мотивов цинковых пальцев и связывают целевые сайты длиной от 9 пар оснований до 18 пар оснований. Массивы с мотивами из 6 цинковых пальцев особенно привлекательны, поскольку они связывают целевой сайт, который достаточно длинный, чтобы иметь хорошие шансы быть уникальным в геноме млекопитающих. [24]
Сконструированные массивы цинковых пальцев часто сливаются с доменом расщепления ДНК (обычно с доменом расщепления FokI ) для получения нуклеаз цинковых пальцев . Такие слияния цинковых пальцев и FokI стали полезными реагентами для манипулирования геномами многих высших организмов, включая Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , табак , кукурузу , [25] данио-рерио , [26] различные типы клеток млекопитающих, [27] и крыс . [28] Нацеливание двухцепочечного разрыва на желаемый геномный локус может быть использовано для введения мутаций со сдвигом рамки считывания в кодирующую последовательность гена из-за подверженной ошибкам природы негомологичного пути репарации ДНК. Если также используется гомологичная «донорская последовательность» ДНК, то геномный локус может быть преобразован в определенную последовательность с помощью пути репарации, направленного на гомологию. Продолжающееся клиническое исследование оценивает цинковые пальцеобразные нуклеазы , которые разрушают ген CCR5 в человеческих Т-клетках CD4 + , в качестве потенциального средства лечения ВИЧ /СПИДа . [29]
Большинство сконструированных массивов цинковых пальцев основаны на домене цинковых пальцев мышиного фактора транскрипции Zif268, хотя некоторые группы использовали массивы цинковых пальцев, основанные на человеческом факторе транскрипции SP1. Zif268 имеет три отдельных мотива цинковых пальцев, которые совместно связывают последовательность из 9 пар оснований с высокой аффинностью. [30] Структура этого белка, связанного с ДНК, была решена в 1991 году [9] и стимулировала большое количество исследований в области сконструированных массивов цинковых пальцев. В 1994 и 1995 годах ряд групп использовали фаговый дисплей для изменения специфичности одного цинкового пальца Zif268. [31] [32] [33] [34] В настоящее время существует два основных метода, используемых для создания сконструированных массивов цинковых пальцев: модульная сборка и система бактериальной селекции, и ведутся споры о том, какой метод лучше всего подходит для большинства приложений. [35] [36]
Самый простой метод создания новых массивов цинковых пальцев — это объединение меньших «модулей» цинковых пальцев с известной специфичностью. Структура белка цинковых пальцев Zif268, связанного с ДНК, описанная Павлетичем и Пабо в их публикации 1991 года, стала ключом к большей части этой работы и описывает концепцию получения пальцев для каждого из 64 возможных триплетов пар оснований, а затем смешивания и сопоставления этих пальцев для разработки белков с любой желаемой специфичностью последовательности. [9] Самый распространенный процесс модульной сборки включает объединение отдельных цинковых пальцев, каждый из которых может распознавать последовательность ДНК из 3 пар оснований, для создания массивов из 3, 4, 5 или 6 пальцев, которые распознают целевые сайты длиной от 9 до 18 пар оснований. Другой метод использует модули из 2 пальцев для создания массивов цинковых пальцев с количеством отдельных цинковых пальцев до шести. [25] Лаборатория Барбаса Научно-исследовательского института Скриппса использовала фаговый дисплей для разработки и характеристики доменов цинковых пальцев, которые распознают большинство последовательностей триплетов ДНК [37] [38] [39] , в то время как другая группа изолировала и охарактеризовала отдельные пальцы из человеческого генома. [40] Потенциальный недостаток модульной сборки в целом заключается в том, что специфичности отдельных цинковых пальцев могут перекрываться и зависеть от контекста окружающих цинковых пальцев и ДНК. Недавнее исследование показало, что большая часть массивов цинковых пальцев из 3 пальцев, полученных с помощью модульной сборки, не связывает свою предполагаемую цель с достаточным сродством в бактериальном двухгибридном анализе и не функционирует как нуклеазы цинковых пальцев , но показатель успеха был несколько выше, когда нацеливались на сайты формы GNNGNNGNN. [41]
Последующее исследование использовало модульную сборку для создания нуклеаз цинковых пальцев как с 3-пальцевыми массивами, так и с 4-пальцевыми массивами и наблюдало гораздо более высокий уровень успеха с 4-пальцевыми массивами. [42] Также сообщалось о варианте модульной сборки, который учитывает контекст соседних пальцев, и этот метод имеет тенденцию давать белки с улучшенной производительностью по сравнению со стандартной модульной сборкой. [43]
Многочисленные методы отбора использовались для создания массивов цинковых пальцев, способных нацеливаться на желаемые последовательности. Первоначальные усилия по отбору использовали фаговый дисплей для выбора белков, которые связывают заданную целевую ДНК из большого пула частично рандомизированных массивов цинковых пальцев. Эту технику трудно использовать более чем с одним цинковым пальцем за раз, поэтому был разработан многоступенчатый процесс, который генерировал полностью оптимизированный массив из 3 пальцев путем добавления и оптимизации одного цинкового пальца за раз. [44] Более поздние усилия использовали дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двухгибридные системы и клетки млекопитающих. Многообещающий новый метод выбора новых массивов цинковых пальцев из 3 пальцев использует бактериальную двухгибридную систему и был назван «OPEN» ее создателями. [45] Эта система объединяет предварительно выбранные пулы отдельных цинковых пальцев, каждый из которых был выбран для связывания заданного триплета, а затем использует второй раунд отбора для получения массивов из 3 пальцев, способных связывать желаемую последовательность из 9 пар оснований. Эта система была разработана консорциумом Zinc Finger в качестве альтернативы коммерческим источникам сконструированных массивов цинковых пальцев. Довольно сложно напрямую сравнивать связывающие свойства белков, полученных этим методом, с белками, полученными с помощью модульной сборки, поскольку профили специфичности белков, полученных методом OPEN, никогда не были опубликованы.
Эта запись представляет собой домен цинкового пальца типа CysCysHisCys (C2HC), обнаруженный у эукариот . Белки, содержащие эти домены, включают: