stringtranslate.com

Шпилька рибозим

Вторичная структура минимального шпилькового рибозима с субстратной РНК, связанной. Круги представляют отдельные нуклеотиды, а линии указывают на канонические (Уотсон-Крик) пары оснований

Шпильковый рибозим — это небольшой участок РНК , который может действовать как рибозим . Как и молоткообразный рибозим, он обнаружен в РНК- сателлитах растительных вирусов. Впервые он был идентифицирован в минус-цепи сателлитной РНК вируса табачной кольцевой пятнистости (TRSV), где он катализирует реакции саморасщепления и соединения ( лигирования ) для переработки продуктов репликации вируса катящегося кольца в линейные и кольцевые молекулы сателлитной РНК. Шпильковый рибозим похож на молоткообразный рибозим тем, что для реакции ему не требуется ион металла.

Биологическая функция

Шпилька рибозима — это мотив РНК, который катализирует реакции процессинга РНК, необходимые для репликации молекул сателлитной РНК, в которые он встроен. Эти реакции являются самопроцессинговыми, т. е. молекула перестраивает свою собственную структуру. Как реакции расщепления, так и реакции соединения концов опосредуются мотивом рибозима, что приводит к смеси взаимопревращающихся линейных и кольцевых молекул сателлитной РНК. Эти реакции важны для процессинга больших мультимерных молекул РНК, которые генерируются репликацией по типу катящегося кольца . В конце цикла репликации эти большие промежуточные продукты репликации сателлитной РНК обрабатываются до молекул единичной длины (кольцевых или линейных), прежде чем они могут быть упакованы вирусами и перенесены в другие клетки для дальнейших раундов репликации. [1]

Сворачивание шпилькового рибозима в его нативной третичной структуре. Последовательность рибозима показана серым цветом, а последовательность субстрата — светло-красным. Место расщепления и лигирования (темно-красное) находится между нуклеотидами A-1 и G+1. Показаны важные последовательности внутри петель A и B, а черные точки указывают на не-Уотсон-Криковские взаимодействия между нуклеотидами. Два каталитических нуклеотида показаны зеленым цветом, а критический нуклеотид C25, который образует пару оснований Уотсона-Крика с G+1 в месте реакции, показан синим цветом. [2]

Естественные версии шпилькового рибозима

В 1980-х годах шпилечный рибозим был идентифицирован в трех природных и хорошо охарактеризованных последовательностях:

Более поздняя работа в 2021 году выявила почти 1000 последовательностей шпилечных рибозимов в малоизвестных организмах, обнаруженных в метатранскриптомных данных. [7] Было высказано предположение [7], что эти новые последовательности встречаются в организмах, которые, подобно тем, которые содержат три ранее обнаруженных шпилечных рибозима, используют одноцепочечные кольцевые геномы РНК. Кольцевость геномов была подтверждена экспериментально, но дальнейшая природа организмов еще недостаточно изучена.

Искусственные версии шпилькового рибозима

Были разработаны меньшие искусственные версии шпилькового рибозима, чтобы обеспечить более подробный экспериментальный анализ молекулы. [8] Это обычно используемая стратегия для разделения тех частей самопроцессирующейся молекулы РНК, которые необходимы для реакций процессинга РНК, от тех частей, которые выполняют несвязанные функции. В ходе этого процесса были идентифицированы минимальный каталитический домен из 50 нуклеотидов и субстрат из 14 нуклеотидов. [9] Используя эти искусственно полученные последовательности, был разработан транс -действующий рибозим, который может катализировать расщепление нескольких молекул субстрата. Эта стратегия была важна тем, что она позволила исследователям (i) применять биохимические методы для ферментативного анализа, (ii) проводить эксперименты для идентификации основных структурных элементов комплекса рибозим-субстрат и (iii) разрабатывать сконструированные рибозимы, которые использовались для биомедицинских приложений, включая предотвращение репликации патогенных вирусов и изучение функции отдельных генов.

Реакционная химия

Как и в случае с несколькими другими рибозимами и протеинрибонуклеазами, реакция расщепления шпилечного рибозима генерирует фрагменты РНК с концами, состоящими из 2',3'-циклического фосфата и 5'-гидроксильной группы. Реакция лигирования, по-видимому, является простым обращением расщепления, т. е. ковалентным соединением фрагментов РНК, заканчивающихся 2',3'-циклическим фосфатом и 5'-гидроксильной группой, для создания обычной 3'-5' фосфодиэфирной связи, используемой как в РНК, так и в ДНК.

Исследования этой реакции в нескольких рибозимах помогли установить, что химия реакции (каталитический механизм) является эндогенным свойством самой молекулы РНК и не опосредуется ионами металлов, как это верно для некоторых белковых ферментов и некоторых других рибозимов. [10] Более того, активность расщепления все еще наблюдается, когда Mg 2+ заменяется на [Co(NH 3 ) 6 ] 3+ . [11] Co 3+ связывает NH 3 настолько прочно в растворе, что NH 3 не диссоциирует в какой-либо заметной степени и, следовательно, не становится протонированным. Это говорит о том, что не существует катализируемого металлом переноса протона или прямой координации с РНК, а вместо этого металлы требуются только для сворачивания. Кроме того, в кристаллических структурах комплекса рибозим-ингибитор и имитатора переходного состояния было показано, что трехмерная архитектура разделяет A-1 и G+1, позиционируя 2'-OH A-1 для линейной нуклеофильной атаки на разрывную фосфатную связь. Кроме того, было предложено, что G8, A38 и A9 играют роль в катализе, депротонируя 2'-OH A-1, стабилизируя развивающийся отрицательный заряд пентакоординированных фосфатных кислородов и протонируя уходящую группу 5'-O G+1. [12] [13]

Структура

Представление трехмерной структуры шпилечного рибозима. [14]

Минимальный шпилечный комплекс рибозим-субстрат сворачивается во вторичную структуру , которая включает два домена, каждый из которых состоит из двух коротких спиралей пар оснований, разделенных внутренней петлей. Домен A (спираль 1 – петля A – спираль 2) содержит субстрат и первичную область распознавания субстрата рибозима. Домен B (спираль 3 – петля B – спираль 4) больше и содержит первичные каталитические детерминанты рибозима. Два домена ковалентно соединены через фосфодиэфирную связь, которая соединяет спираль 2 со спиралью 3. Эти домены должны взаимодействовать друг с другом, чтобы произошел катализ. [15]

Когда минимальному комплексу рибозим-субстрат позволяют сворачиваться в условиях низкой ионной силы , два домена накладываются друг на друга, образуя неактивную, расширенную структуру, напоминающую шпильку. [16] Для того чтобы произошел катализ, два домена лежат параллельно друг другу в складке, напоминающей скрепку. В различных публикациях эта РНК была названа либо рибозимом «скрепка», либо рибозимом «шпилька». Несмотря на то, что первое название оказалось более точным, последнее стало общепринятой номенклатурой. В лаборатории функциональное взаимодействие между двумя доменами стимулируется добавлением катионов , положительного заряда которых достаточно для преодоления электростатического отталкивания отрицательно заряженного остова РНК. В природе ассоциация двух доменов поддерживается комбинацией ионов металлов (включая Mg2 + ) и наличием двух дополнительных спиральных доменов, которые отсутствуют в минимальном комплексе рибозим-субстрат, но служат для обеспечения правильного трехмерного сворачивания. Эти дополнительные домены накладываются на спирали 2 и 3, тем самым способствуя ассоциации двух функциональных доменов посредством того, что называется четырехсторонним спиральным соединением. [17]

Структура и активность шпилечного рибозима были исследованы с использованием широкого спектра дополнительных экспериментальных методов, включая замену нуклеотидов, замену функциональных групп, комбинаторный отбор, флуоресцентную спектроскопию , ковалентное сшивание , ЯМР - анализ и рентгеновскую кристаллографию . Эти исследования были облегчены способностью функционального комплекса к самосборке из сегментов, полученных путем твердофазного химического синтеза РНК , что позволяет включать широкий спектр модифицированных нуклеотидов, которые в природе не встречаются в РНК. В совокупности результаты этих экспериментов представляют собой высококонгруэнтную картину каталитического цикла , то есть того, как шпилечный рибозим связывает свой субстрат, сворачивается в определенную трехмерную структуру, катализирует реакцию и высвобождает продукт(ы) реакции. [18]

Направленное расщепление РНК и противовирусная активность

Шпильковые рибозимы были модифицированы таким образом, что их можно использовать для целевого расщепления других молекул РНК. Это возможно, поскольку большая часть субстратной специфичности шпилькового рибозима является результатом простого спаривания оснований Уотсона-Крика в спиралях 1 и 2. [19]

Одной из областей особого интереса была разработка шпилечных рибозимов для потенциального терапевтического использования, например, путем предотвращения репликации патогенных вирусов. Противовирусные шпилечные рибозимы были созданы и экспрессированы в клетках млекопитающих, и было показано, что клетки, экспрессирующие различные сконструированные рибозимы, устойчивы к инфицированию ВИЧ -1 , [20] [21] гепатитом B , [22] и вирусом Синдбис . [23]

Ссылки

  1. ^ Symons, RH (1997). «Растительные патогенные РНК и РНК-катализ». Nucleic Acids Res . 25 (14): 2683–2689. doi :10.1093/nar/25.14.2683. PMC  146833. PMID  9207012 .
  2. ^ Alam, S.; Grum-Tokars, V.; Krucinska, J.; Kundracik, M.; Wedekind, J. (2005). «Конформационная гетерогенность в позиции U37 шпилечного рибозима all-RNA с последствиями для связывания металлов и каталитической структуры S-поворота». Biochemistry . 44 (44): 14396–14408. doi :10.1021/bi051550i. PMID  16262240.
  3. ^ Feldstein, PA; Buzayan, JM; Bruening, G (15 октября 1989 г.). «Две последовательности, участвующие в автолитической обработке комплементарной РНК сателлитного вируса табачной кольцевой пятнистости». Gene . 82 (1): 53–61. doi :10.1016/0378-1119(89)90029-2. PMID  2583519.
  4. ^ Хампель, А; Триц, Р. (13 июня 1989 г.). «РНК-каталитические свойства минимальной последовательности (-)sTRSV». Биохимия . 28 (12): 4929–4933. doi :10.1021/bi00438a002. PMID  2765519.
  5. ^ Рубино, Л.; Тусиньян, М.Е.; Стегер, Г.; Капер, Дж.М. (сентябрь 1990 г.). «Нуклеотидная последовательность и структурный анализ двух сателлитных РНК, связанных с вирусом желтой крапчатости цикория». Журнал общей вирусологии . 71 (9): 1897–1903. doi : 10.1099/0022-1317-71-9-1897 . PMID  1698918.
  6. ^ Kaper, JM; Tousignant, ME; Steger, G (15 июля 1988 г.). «Последовательность нуклеотидов предсказывает кольцевость и саморасщепление 300-рибонуклеотидного спутника вируса мозаики арабиса». Biochemical and Biophysical Research Communications . 154 (1): 318–325. doi :10.1016/0006-291x(88)90687-0. PMID  3395334.
  7. ^ ab Weinberg CE, Olzog VJ, Eckert I, Weinberg Z (июнь 2021 г.). «Идентификация более чем в 200 раз большего количества шпилечных рибозимов, чем было известно ранее в различных кольцевых РНК». Nucleic Acids Res . 49 (11): 6375–6388. doi : 10.1093/nar/gkab454 . PMC 8216279. PMID  34096583 . 
  8. ^ Фельдштейн, ПА; Брюнинг, Г (1993). «Каталитически активная геометрия в обратимой циркуляризации РНК «мини-мономера», полученных из комплементарной цепи сателлитной РНК вируса кольцевой пятнистости табака». Nucleic Acids Research . 21 (8): 1991–1998. doi :10.1093/nar/21.8.1991. PMC 309442. PMID  7684131 . 
  9. ^ Хампель, А; Триц, Р. (1989). «РНК-каталитические свойства минимальной последовательности (-)sTRSV». Биохимия . 28 (12): 4929–4933. doi :10.1021/bi00438a002. PMID  2765519.
  10. ^ Мюррей, Дж. Б.; Сейхан, А. А.; Уолтер, Н. Г.; Берк, Дж. М.; Скотт, В. Г. (1998). «Молоткоголовый, шпилечный и VS рибозимы каталитически эффективны только в отношении одновалентных катионов» (PDF) . Химия и биология . 5 (10): 587–595. doi :10.1016/S1074-5521(98)90116-8. PMID  9818150. S2CID  17025877.
  11. ^ Young, KJ; Gill, F.; Grasby, JA (1 октября 1997 г.). «Ионы металлов играют пассивную роль в реакции, катализируемой шпилькой рибозима». Nucleic Acids Research . 25 (19): 3760–3766. doi :10.1093/nar/25.19.3760. ISSN  0305-1048. PMC 146958. PMID 9380495  . 
  12. ^ Rupert, PB; Ferré-D'Amaré, AR (12 апреля 2001 г.). «Кристаллическая структура комплекса шпилька-рибозим-ингибитор с учетом катализа». Nature . 410 (6830): 780–786. Bibcode :2001Natur.410..780R. doi :10.1038/35071009. ISSN  0028-0836. PMID  11298439. S2CID  4416839.
  13. ^ Руперт, Питер Б.; Мэсси, Арчна П.; Сигурдссон, Снорри Т.; Ферре-Д'Амаре, Адриан Р. (15 ноября 2002 г.). «Стабилизация переходного состояния каталитической РНК». Science . 298 (5597): 1421–1424. Bibcode :2002Sci...298.1421R. doi :10.1126/science.1076093. ISSN  1095-9203. PMID  12376595. S2CID  23783258.
  14. ^ Salter, J.; Krucinska, J.; Alam, S.; Grum-Tokars, V.; Wedekind, JE (2006). «Вода в активном центре шпилечного рибозима all-RNA и влияние вариантов оснований Gua8 на геометрию переноса фосфорила». Biochemistry . 45 (3): 686–700. doi :10.1021/bi051887k. PMC 2546605 . PMID  16411744. 
  15. ^ Бутчер, С. Э.; Хекман, Дж. Э.; Берк, Дж. М. (1995). «Восстановление активности рибозима шпильки после разделения функциональных доменов». Журнал биологической химии . 270 (50): 29648–29651. doi : 10.1074/jbc.270.50.29648 . PMID  8530348.
  16. ^ Эстебан, JA; Уолтер, NG; Коцорек, G.; Хекман, JE; Берк, JM (1998). "Структурная основа гетерогенной кинетики: реинжиниринг шпилечного рибозима" (PDF) . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (11): 6091–6096. Bibcode :1998PNAS...95.6091E. doi : 10.1073/pnas.95.11.6091 . PMC 27590 . PMID  9600922. 
  17. ^ Nahas, M.; Wilson, TJ; Ha, T.; Lilley, DMJ (2005). «Сворачивание и катализ шпилечного рибозима». Труды биохимического общества . 33 (ч. 3): 461–465. doi :10.1042/BST0330461. PMID  15916541.
  18. ^ Cochrane, JC; Strobel, SA (2008). «Каталитические стратегии саморасщепляющихся рибозимов». Accounts of Chemical Research . 41 (8): 1027–1035. doi :10.1021/ar800050c. PMID  18652494.
  19. ^ Chowrira, BM; Burke, JM (1991). «Связывание и расщепление нуклеиновых кислот «шпилечным» рибозимом». Биохимия . 30 (35): 8518–8522. doi :10.1021/bi00099a003. PMID  1909564.
  20. ^ Ю, М; Ойванг, Дж; Ямада, О; Хампель, А; Рапаппорт, Дж; Луни, Д; Вонг-Стаал, Ф (1993). «Рибозим-шпилька ингибирует экспрессию различных штаммов вируса иммунодефицита человека типа 1». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 90 (13): 6340–6344. Bibcode : 1993PNAS...90.6340Y. doi : 10.1073 /pnas.90.13.6340 . PMC 46924. PMID  8327516. 
  21. ↑ Пуэрта-Фернандес Э, Баррозо-дель Хесус А, Ромеро-Лопес С, Тапиа Н, Мартинес М.А., Берсаль-Эрранс А (10 июня 2005 г.). «Ингибирование репликации ВИЧ-1 с помощью РНК, нацеленной на область LTR». СПИД . 19 (9): 863–870. doi : 10.1097/01.aids.0000171399.77500.e0 . PMID  15905666. S2CID  16652577.
  22. ^ Zu Putlitz, J.; Yu, Q.; Burke, JM; Wands, JR (1999). «Комбинаторный скрининг и внутриклеточная противовирусная активность шпилечных рибозимов, направленных против вируса гепатита B». Журнал вирусологии . 73 (7): 5381–5387. doi :10.1128/JVI.73.7.5381-5387.1999. PMC 112594. PMID  10364285 . 
  23. ^ Чжан, З.; Берк, Дж. (2005). «Ингибирование вирусной репликации рибозимом: мутационный анализ сайта и механизма противовирусной активности». Журнал вирусологии . 79 (6): 3728–3736. doi :10.1128 / JVI.79.6.3728-3736.2005. PMC 1075678. PMID  15731266. 

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки