stringtranslate.com

Криогенная электронная микроскопия

Титан Криос в Университете Лидса

Криогенная электронная микроскопия ( крио-ЭМ ) — это метод криомикроскопии, применяемый к образцам, охлажденным до криогенных температур. Для биологических образцов структура сохраняется путем помещения в среду стекловидного льда . Водный раствор образца наносится на сетку и погружается в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана . [1] Хотя разработка метода началась в 1970-х годах, последние достижения в области технологии детекторов и программных алгоритмов позволили определять биомолекулярные структуры с разрешением, близким к атомарному. [2] Это привлекло широкое внимание к подходу как к альтернативе рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии для определения макромолекулярной структуры без необходимости кристаллизации. [3]

В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [4] Nature Methods также назвал крио-ЭМ «Методом года» в 2015 году. [5]

История

Раннее развитие

В 1960-х годах использование просвечивающей электронной микроскопии для методов определения структуры было ограничено из-за радиационного повреждения, вызванного электронными пучками высокой энергии. Ученые выдвинули гипотезу, что исследование образцов при низких температурах уменьшит радиационное повреждение, вызванное пучком. [6] Как жидкий гелий (−269  °C или 4  K или −452,2  °F ), так и жидкий азот (−195,79 °C или 77 K или −320 °F) считались криогенами. В 1980 году Эрвин Кнапек и Жак Дюбоше опубликовали комментарии о повреждении пучком при криогенных температурах, поделившись наблюдениями, что:

Было обнаружено, что тонкие кристаллы, закрепленные на углеродной пленке, в 30–300 раз более устойчивы к воздействию пучка при температуре 4 К, чем при комнатной температуре... Большинство наших результатов можно объяснить, предположив, что криозащита в области 4 К сильно зависит от температуры. [7]

Однако эти результаты не были воспроизводимыми, и всего два года спустя в Nature были опубликованы поправки , сообщающие, что сопротивление пучка было менее значительным, чем первоначально предполагалось. Защита, полученная при 4 К, была ближе к «десятикратной для стандартных образцов L- валина » [8] , чем то, что было заявлено ранее.

В 1981 году Аласдер Макдауэлл и Жак Дюбоше, ученые из Европейской лаборатории молекулярной биологии , сообщили о первой успешной реализации крио-ЭМ. [9] Макдауэлл и Дюбоше превратили чистую воду в тонкую пленку, распылив ее на гидрофильную углеродную пленку, которая была быстро погружена в криоген (жидкий пропан или жидкий этан, охлажденный до 77 К). Тонкий слой аморфного льда был толщиной менее 1 мкм, а картина дифракции электронов подтвердила наличие аморфного/стекловидного льда. В 1984 году группа Дюбоше продемонстрировала силу крио-ЭМ в структурной биологии с помощью анализа витрифицированного аденовируса типа 2, бактериофага Т4 , вируса леса Семлики , бактериофага CbK и вируса везикулярного стоматита . [10]

Последние достижения

2010-е годы были отмечены радикальным прогрессом электронных камер. В частности, усовершенствования, внесенные в детекторы прямых электронов, привели к «революции разрешения» [11], сдвинув барьер разрешения ниже критического предела ~2-3 Å для определения положения и ориентации аминокислот. [12]

Хендерсон ( Лаборатория молекулярной биологии MRC , Кембридж, Великобритания) сформировал консорциум с инженерами из Лаборатории Резерфорда Эпплтона и учеными из Общества Макса Планка для финансирования и разработки первого прототипа. Затем консорциум объединил усилия с производителем электронных микроскопов FEI для развертывания и продажи новой конструкции. Примерно в то же время Gatan Inc. из Плезантона, Калифорния, выпустила аналогичный детектор, разработанный Питером Денесом ( Национальная лаборатория Лоуренса в Беркли ) и Дэвидом Агардом ( Калифорнийский университет, Сан-Франциско ). Третий тип камеры был разработан Нгуен-Хуу Сюонгом в компании Direct Electron ( Сан-Диего, Калифорния ). [11]

В последнее время достижения в использовании белковых структур визуализации помогают решать проблемы смещения ориентации образца и ограничения размера. Белки меньше ~50 кДа, как правило, имеют недостаточное SNR для разрешения белковых частиц на изображении, что делает трехмерную реконструкцию сложной или невозможной. [13] Структуры визуализации повышают SNR более мелких белков, связывая их с более крупным объектом, структурой. Группа Йейтса в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе смогла создать более четкое изображение трех вариантов KRAS (размером примерно 19 кДа), используя жесткую структуру визуализации и используя DARPins в качестве модульного связывающего домена между структурой и интересующим белком. [14]

Нобелевская премия по химии 2017 г.

В знак признания вклада криоэлектронной микроскопии в биохимию трое ученых — Жак Дюбоше , Иоахим Франк и Ричард Хендерсон — были удостоены Нобелевской премии по химии «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением» [4] .

Сравнение с рентгеновской кристаллографией

Традиционно рентгеновская кристаллография была самым популярным методом определения трехмерных структур биологических молекул. [15] Однако вышеупомянутые усовершенствования крио-ЭМ увеличили ее популярность как инструмента для изучения деталей биологических молекул. С 2010 года ежегодные отложения структур крио-ЭМ превзошли рентгеновскую кристаллографию. [16] Хотя рентгеновская кристаллография имеет значительно больше общих отложений из-за более долгой истории, общие отложения двух методов, как прогнозируется, превзойдут около 2035 года. [16]

Разрешение рентгеновской кристаллографии ограничено однородностью кристалла [17] , а перевод биологических молекул с неизвестными идеальными условиями кристаллизации в кристаллическое состояние может быть очень трудоемким, в крайних случаях занимая месяцы или даже годы. [18] Напротив, подготовка образцов в крио-ЭМ может потребовать нескольких раундов скрининга и оптимизации для преодоления таких проблем, как агрегация белков и предпочтительные ориентации [19] [20], но для этого не требуется, чтобы образец образовывал кристалл, вместо этого образцы для крио-ЭМ мгновенно замораживаются и исследуются в их почти нативном состоянии. [21]

По данным Proteopedia , медианное разрешение, достигнутое с помощью рентгеновской кристаллографии (по состоянию на 19 мая 2019 г.) в Protein Data Bank, составляет 2,05 Å [17] , а самое высокое разрешение, достигнутое за всю историю (по состоянию на 30 сентября 2022 г.), составляет 0,48 Å. [22] По состоянию на 2020 г. большинство структур белков, определенных с помощью крио-ЭМ, имеют более низкое разрешение 3–4 Å. [23] Однако по состоянию на 2020 г. наилучшее разрешение крио-ЭМ было зафиксировано на уровне 1,22 Å, [20] что делает его конкурентом по разрешению в некоторых случаях.

Корреляционный световой крио-ТЭМ и крио-ЭТ

В 2019 году корреляционная световая крио-ТЭМ и крио-ЭТ использовались для наблюдения за туннелирующими нанотрубками (ТНТ) в нейронных клетках. [24]

Сканирующая электронная криомикроскопия

Сканирующая электронная криомикроскопия (криоСЭМ) — это метод сканирующей электронной микроскопии , при котором холодный столик сканирующего электронного микроскопа находится в криогенной камере.

Криогенная просвечивающая электронная микроскопия

Криогенная просвечивающая электронная микроскопия (крио-ПЭМ) — это метод просвечивающей электронной микроскопии , который используется в структурной биологии и материаловедении . В разговорной речи термин «криогенная электронная микроскопия» или его сокращение «крио-ЭМ» по умолчанию относится к криогенной просвечивающей электронной микроскопии, поскольку подавляющее большинство крио-ЭМ выполняется в просвечивающих электронных микроскопах, а не в сканирующих электронных микроскопах.

Центры

Федеральный технологический институт , Университет Лозанны и Женевский университет открыли Центр визуализации Дюбоше (DCI) в конце ноября 2021 года с целью применения и дальнейшего развития крио-ЭМ. [25] Менее чем через месяц после первой идентификации варианта SARS-CoV-2 Omicron исследователи из DCI смогли определить его структуру, выявить ключевые мутации, позволяющие обойти отдельные вакцины, и предоставить информацию для новых терапевтических подходов. [26]

Датский национальный центр крио-ЭМ, также известный как EMBION, был открыт 1 декабря 2016 года. EMBION — это консорциум крио-ЭМ между датскими университетами (Орхусский университет — принимающая сторона, Копенгагенский университет — соорганизатор).

Рабочий процесс анализа отдельных частиц

Продвинутые методы

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Tivol WF, Briegel A, Jensen GJ (октябрь 2008 г.). «Улучшенный криоген для замораживания погружением». Микроскопия и микроанализ . 14 (5): 375–379. Bibcode :2008MiMic..14..375T. doi :10.1017/S1431927608080781. PMC  3058946 . PMID  18793481.
  2. ^ Cheng Y, Grigorieff N, Penczek PA, Walz T (апрель 2015 г.). «Праймер в одночастичную криоэлектронную микроскопию». Cell . 161 (3): 438–449. doi :10.1016/j.cell.2015.03.050. PMC 4409659 . PMID  25910204. 
  3. ^ Стоддарт С (1 марта 2022 г.). «Структурная биология: как белки получили свой крупный план». Knowable Magazine . doi : 10.1146/knowable-022822-1 . S2CID  247206999 . Получено 25 марта 2022 г. .
  4. ^ ab "Нобелевская премия по химии 2017 года". NobelPrize.org . Получено 2022-09-30 .
  5. ^ Doerr A (январь 2017). "Криоэлектронная томография". Nature Methods . 14 (1): 34. doi :10.1038/nmeth.4115. ISSN  1548-7091. S2CID  27162203.
  6. ^ Дубоше Дж., Кнапек Э. (апрель 2018 г.). «Взлеты и падения в ранней электронной криомикроскопии». PLOS Biology . 16 (4): e2005550. doi : 10.1371/journal.pbio.2005550 . PMC 5929567. PMID  29672565 . 
  7. ^ Knapek E, Dubochet J (август 1980 г.). «Повреждение органического материала лучом значительно уменьшается при криоэлектронной микроскопии». Журнал молекулярной биологии . 141 (2): 147–161. doi :10.1016/0022-2836(80)90382-4. PMID  7441748.
  8. ^ Newmark P (30 сентября 1982 г.). «Криотрансмиссионная микроскопия. Угасающие надежды». Nature . 299 (5882): 386–387. Bibcode :1982Natur.299..386N. doi : 10.1038/299386c0 .
  9. ^ Дубоше Дж., Макдауолл AW (декабрь 1981 г.). «Витрификация чистой воды для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 124 (3): 3–4. doi : 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x .
  10. ^ Adrian M, Dubochet J, Lepault J, McDowall AW (март 1984). «Криоэлектронная микроскопия вирусов». Nature . 308 (5954): 32–36. Bibcode :1984Natur.308...32A. doi :10.1038/308032a0. PMID  6322001. S2CID  4319199.
  11. ^ ab Kühlbrandt, Werner (28.03.2014). «Революция разрешений». Science . 343 (6178): 1443–1444. Bibcode :2014Sci...343.1443K. doi :10.1126/science.1251652. ISSN  0036-8075. PMID  24675944. S2CID  35524447.
  12. ^ Kuster, Daniel J.; Liu, Chengyu; Fang, Zheng; Ponder, Jay W.; Marshall, Garland R. (2015-04-20). "Высокоразрешающие кристаллические структуры белковых спиралей, согласованные с трехцентровыми водородными связями и мультипольной электростатикой". PLOS ONE . 10 (4): e0123146. Bibcode : 2015PLoSO..1023146K. doi : 10.1371/journal.pone.0123146 . ISSN  1932-6203. PMC 4403875. PMID  25894612 . 
  13. ^ Herzik, Mark A.; Wu, Mengyu; Lander, Gabriel C. (2019-03-04). "Высокоразрешающее определение структуры комплексов с молекулярной массой менее 100 кДа с использованием обычной крио-ЭМ". Nature Communications . 10 (1): 1032. Bibcode :2019NatCo..10.1032H. doi :10.1038/s41467-019-08991-8. ISSN  2041-1723. PMC 6399227 . PMID  30833564. 
  14. ^ Кастельс-Граеллс Р., Мидор К., Арбинг МА., Савайя М.Р., Джи М., Касио Д. и др. (сентябрь 2023 г.). «Определение структуры малых терапевтических белковых мишеней с помощью крио-ЭМ при разрешении 3 Å с использованием жесткого каркаса для визуализации». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 120 (37): e2305494120. Bibcode : 2023PNAS..12005494C. doi : 10.1073/pnas.2305494120. PMC 10500258. PMID  37669364 . 
  15. ^ Смит М.С., Мартин Дж.Х. (февраль 2000 г.). "рентгеновская кристаллография". Молекулярная патология . 53 (1): 8–14. doi :10.1136/mp.53.1.8. PMC 1186895. PMID 10884915  . 
  16. ^ ab Chiu, Wah; Schmid, Michael F.; Pintilie, Grigore D.; Lawson, Catherine L. (январь 2021 г.). «Эволюция стандартизации и распространения структур и данных крио-ЭМ совместно сообществом, PDB и EMDB». Журнал биологической химии . 296 : 100560. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100560 . ISSN  0021-9258. PMC 8050867. PMID 33744287  . 
  17. ^ ab "Resolution - Proteopedia, жизнь в 3D". proteopedia.org . Получено 2020-10-27 .
  18. ^ Callaway E (февраль 2020 г.). «Революционная крио-ЭМ захватывает структурную биологию». Nature . 578 (7794): 201. Bibcode :2020Natur.578..201C. doi : 10.1038/d41586-020-00341-9 . PMID  32047310.
  19. ^ Люмкис, Дмитрий (2019-03-29). «Проблемы и возможности крио-ЭМ анализа отдельных частиц». Журнал биологической химии . 294 (13): 5181–5197. doi : 10.1074/jbc.rev118.005602 . ISSN  0021-9258. PMC 6442032. PMID 30804214  . 
  20. ^ ab Nakane T, Kotecha A, Sente A, McMullan G, Masiulis S, Brown PM и др. (ноябрь 2020 г.). «Одночастичная крио-ЭМ с атомным разрешением». Nature . 587 (7832): 152–156. Bibcode :2020Natur.587..152N. doi :10.1038/s41586-020-2829-0. PMC 7611073 . PMID  33087931. 
  21. ^ Wang HW, Wang JW (январь 2017). «Как криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга». Protein Science . 26 (1): 32–39. doi :10.1002/pro.3022. PMC 5192981 . PMID  27543495. 
  22. ^ Schmidt A, Teeter M, Weckert E, Lamzin VS (апрель 2011 г.). «Кристаллическая структура малого белка крамбина при разрешении 0,48 Å». Acta Crystallographica. Раздел F, Structural Biology and Crystallization Communications . 67 (Pt 4): 424–428. doi :10.1107/S1744309110052607. PMC 3080141. PMID  21505232 . 
  23. ^ Yip KM, Fischer N, Paknia E, Chari A, Stark H (ноябрь 2020 г.). «Определение структуры белка с атомным разрешением с помощью крио-ЭМ». Nature . 587 (7832): 157–161. Bibcode :2020Natur.587..157Y. doi :10.1038/s41586-020-2833-4. PMID  33087927. S2CID  224823207.
  24. ^ Сартори-Рупп А., Кордеро Сервантес Д., Пепе А., Гуссе К., Делаж Э., Корройер-Дульмон С. и др. (январь 2019 г.). «Коррелятивная криоэлектронная микроскопия выявляет структуру ТНТ в нейрональных клетках». Nature Communications . 10 (1): 342. Bibcode :2019NatCo..10..342S. doi :10.1038/s41467-018-08178-7. PMC 6341166 . PMID  30664666. 
  25. ^ "Открытие Центра визуализации Дюбоше (DCI) в кампусах UNIGE, UNIL и EPFL". unige.ch . 2021-11-30 . Получено 2022-04-30 .
  26. ^ "Ученые раскрывают тайны вариантов Омикрона с помощью микроскопов". swissinfo.ch . 2021-12-30 . Получено 2022-04-30 .
  27. ^ Бойерляйн, Феликс Дж. Б.; Баумайстер, Вольфганг (2021-10-01). «На пути к визуальной протеомике с высоким разрешением». Журнал молекулярной биологии . От последовательности белка к структуре с невероятной скоростью: как альфафолд влияет на биологию. 433 (20): 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN  0022-2836. PMID  34384780.
  28. ^ Nannenga BL, Shi D, Leslie AG, Gonen T (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры высокого разрешения путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED». Nature Methods . 11 (9): 927–930. doi :10.1038/nmeth.3043. PMC 4149488 . PMID  25086503. 
  29. ^ Jones CG, Martynowycz MW, Hattne J, Fulton TJ, Stoltz BM, Rodriguez JA и др. (ноябрь 2018 г.). «Метод криоЭМ MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул». ACS Central Science . 4 (11): 1587–1592. doi :10.1021/acscentsci.8b00760. PMC 6276044 . PMID  30555912. 
  30. ^ de la Cruz MJ, Hattne J, Shi D, Seidler P, Rodriguez J, Reyes FE и др. (февраль 2017 г.). «Структуры атомного разрешения из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED». Nature Methods . 14 (4): 399–402. doi :10.1038/nmeth.4178. PMC 5376236 . PMID  28192420. 
  31. ^ Gruene T, Wennmacher JT, Zaubitzer C, Holstein JJ, Heidler J, Fecteau-Lefebvre A и др. (декабрь 2018 г.). «Быстрое определение структуры микрокристаллических молекулярных соединений с использованием электронной дифракции». Angewandte Chemie . 57 (50): 16313–16317. doi :10.1002/anie.201811318. PMC 6468266 . PMID  30325568. 
  32. ^ Cheng Y (август 2018 г.). «Одночастичная крио-ЭМ-как она сюда попала и куда она пойдет». Science . 361 (6405): 876–880. Bibcode :2018Sci...361..876C. doi :10.1126/science.aat4346. PMC 6460916 . PMID  30166484. 
  33. ^ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA и Suttle, CA (2017) «Крио-ЭМ-реконструкция капсида вируса Cafeteria roenbergensis предлагает новый путь сборки гигантских вирусов». Scientific Reports , 7 : 5484. doi :10.1038/s41598-017-05824-w.