В биохимии семейство ферментов ДНК -метилтрансферазы ( ДНК-МТаза , DNMT ) катализирует перенос метильной группы на ДНК . Метилирование ДНК выполняет широкий спектр биологических функций. Все известные ДНК-метилтрансферазы используют S-аденозилметионин (SAM) в качестве донора метила.
МТазы можно разделить на три различные группы в зависимости от химических реакций, которые они катализируют:
Метилтрансферазы m6A и m4C обнаруживаются преимущественно у прокариот (хотя недавние данные свидетельствуют о том, что m6A в изобилии встречается у эукариот [1] ). Метилтрансферазы m5C обнаружены у некоторых низших эукариот, у большинства высших растений и у животных, начиная с иглокожих .
Метилтрансферазы m6A (N-6-аденин-специфическая ДНК-метилаза) (A-Mtase) представляют собой ферменты , которые специфически метилируют аминогруппу в положении C-6 аденинов в ДНК. Они обнаружены в трех существующих типах бактериальных рестрикционно-модификационных систем (в системе I типа А-Мтаза является продуктом гена hsdM, а в типе III — продуктом гена mod). Эти ферменты ответственны за метилирование определенных последовательностей ДНК , чтобы предотвратить переваривание хозяином собственного генома с помощью ферментов рестрикции . Эти метилазы обладают той же специфичностью последовательности , что и соответствующие им ферменты рестрикции. Эти ферменты содержат в своем N-концевом участке консервативный мотив Asp / Asn - Pro -Pro- Tyr / Phe , этот консервативный участок может участвовать в связывании субстрата или в каталитической активности. [2] [3] [ 4] [ 5] Структура N6-MTase TaqI (M.TaqI) разрешена до 2,4 А. Молекула складывается в 2 домена: N-концевой каталитический домен, который содержит сайты связывания каталитического и кофактора , и включает центральный 9-нитевой бета-лист, окруженный 5 спиралями; и С-концевой домен распознавания ДНК, который образован 4 небольшими бета-листами и 8 альфа-спиралями . N- и C-концевые домены образуют щель, в которой размещается ДНК- субстрат . [6] Была предложена классификация N-MTases, основанная на расположении консервативных мотивов (CM). [5] Согласно этой классификации, N6-Мтазы, которые имеют мотив DPPY (CM II), встречающийся после мотива FxGxG (CM I), обозначаются N6-адениновыми МТазами класса D12. Система рестрикции и модификации типа I состоит из трех полипептидов R, M и S. Субъединицы M (hsdM) и S вместе образуют метилтрансферазу , которая метилирует два адениновых остатка в комплементарных цепях двудольной последовательности распознавания ДНК . В присутствии R-субъединицы комплекс может также действовать как эндонуклеаза , связываясь с той же целевой последовательностью , но разрезая ДНК на некотором расстоянии от этого сайта. Будет ли ДНК разрезана или модифицирована, зависит от состояния метилирования целевой последовательности . Когда целевой сайт не модифицирован, ДНК разрезается. Когда целевой сайт гемиметилирован, комплекс действует как поддерживающая метилтрансфераза, модифицируя ДНК так, что обе цепи становятся метилированными . hsdM содержит альфа-спиральный домен на N-конце , N-концевой домен HsdM. [7]
Среди m6A-метилтрансфераз (N-6-аденин-специфическая ДНК-метилаза) существует группа орфанных МТаз, не участвующих в бактериальной системе рестрикции/метилирования. [8] Эти ферменты играют регулирующую роль в экспрессии генов и регуляции клеточного цикла. EcoDam из E. coli [9] и CcrM из Caulobacter crescentus [10] являются хорошо охарактеризованными членами этого семейства. Совсем недавно было показано, что CamA из Clostridioides difficile играет ключевую функциональную роль в споруляции , образовании биопленок и адаптации к хозяину. [11]
Метилтрансферазы m4C (специфичные для цитозина ДНК-метилазы N-4) представляют собой ферменты , которые специфически метилируют аминогруппу в положении C-4 цитозинов в ДНК. [5] Такие ферменты обнаруживаются как компоненты систем рестрикции-модификации типа II у прокариот . Такие ферменты распознают определенную последовательность ДНК и метилируют цитозин в этой последовательности . Этим действием они защищают ДНК от расщепления ферментами рестрикции типа II, которые распознают ту же последовательность.
Метилтрансферазы m5C (цитозин-специфическая ДНК-метилаза C-5) (C5 Mtase) представляют собой ферменты, которые специфически метилируют углерод C-5 цитозинов в ДНК с образованием C5-метилцитозина . [12] [13] [14] В клетках млекопитающих цитозинспецифические метилтрансферазы метилируют определенные последовательности CpG , которые, как полагают, модулируют экспрессию генов и дифференцировку клеток . У бактерий эти ферменты являются компонентом систем рестрикции-модификации и служат ценными инструментами для манипулирования ДНК. [13] [15] Структура метилтрансферазы HhaI (M.HhaI) была разрешена до 2,5 А : молекула складывается в 2 домена - более крупный каталитический домен, содержащий каталитические и кофакторные сайты связывания, и меньший домен узнавания ДНК. [16]
Сообщалось о высококонсервативных ДНК-метилтрансферазах типов m4C, m5C и m6A [17] , которые представляются многообещающими мишенями для разработки новых эпигенетических ингибиторов для борьбы с бактериальной вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам, а также для других биомедицинских применений.
Метилтрансферазы de novo распознают в ДНК что-то, что позволяет им заново метилировать цитозины. Они экспрессируются главным образом на ранних стадиях развития эмбриона и определяют структуру метилирования. Метилтрансферазы de novo также активны, когда клетка, реагирующая на сигнал, такая как нейрон , должна изменить экспрессию белка. [18] Например, когда обусловленность страхом создает у крысы новые воспоминания , 9,17% генов в геноме нейронов гиппокампа крысы дифференциально метилированы. [19]
Поддерживающие метилтрансферазы добавляют метилирование к ДНК, когда одна цепь уже метилирована. Они работают на протяжении всей жизни организма, поддерживая структуру метилирования, установленную метилтрансферазами de novo.
У млекопитающих идентифицированы по крайней мере четыре ДНК-метилтрансферазы различной активности. Они названы DNMT1 , [20] две изоформы, транскрибируемые из гена DNMT3a : DNMT3a1 и DNMT3a2, [21] и DNMT3b . [22] Недавно был обнаружен другой фермент DNMT3c, специфически экспрессирующийся в мужской зародышевой линии мышей. [23]
Манзо и др. [24] наблюдали различия в геномном связывании DNMT3a1, DNMT3a2 и DNMT3b. Они обнаружили 3970 областей, обогащенных исключительно DNMT3a1, 3838 областей, обогащенных исключительно DNMT3a2, и 3432, обогащенных исключительно DNMT3b.
Ферменты DNMT регулируются не только в местах их метилирования в геноме посредством того, где они связываются с ДНК [ 24] , но они также регулируются посттрансляционными модификациями гистоновых белков нуклеосом , вокруг которых обернута геномная ДНК (24). см. рисунки). Роуз и Клозе [25] рассмотрели взаимосвязь между метилированием ДНК и метилированием лизина гистонов . Например, они указали, что H3K4me3, по-видимому, блокирует метилирование ДНК, тогда как H3K9me3 играет роль в стимулировании метилирования ДНК.
DNMT3L [26] представляет собой белок, тесно родственный DNMT3a и DNMT3b по структуре и имеющий решающее значение для метилирования ДНК, но, по-видимому, сам по себе неактивен.
DNMT1 является наиболее распространенной ДНК-метилтрансферазой в клетках млекопитающих и считается ключевой поддерживающей метилтрансферазой у млекопитающих . Он преимущественно метилирует гемиметилированные динуклеотиды CpG в геноме млекопитающих. Мотив узнавания человеческого фермента включает только три основания в паре динуклеотидов CpG: C на одной цепи и CpG на другой. Это смягченное требование к специфичности субстрата позволяет ему метилировать необычные структуры, такие как промежуточные соединения проскальзывания ДНК, со скоростью de novo, которая равна скорости его поддержания. [27] Как и другие ДНК-цитозин-5-метилтрансферазы, человеческий фермент распознает перевернутые цитозины в двухцепочечной ДНК и действует по механизму нуклеофильной атаки. [28] В раковых клетках человека DNMT1 отвечает как за de novo , так и за поддерживающее метилирование генов-супрессоров опухоли. [29] [30] Длина фермента составляет около 1620 аминокислот . Первые 1100 аминокислот составляют регуляторный домен фермента, а остальные остатки составляют каталитический домен. К ним присоединяется Гли – повторяет Лис . Оба домена необходимы для каталитической функции DNMT1.
DNMT1 имеет несколько изоформ : соматическую DNMT1, сплайсинговый вариант (DNMT1b) и специфичную для ооцитов изоформу (DNMT1o). DNMT1o синтезируется и хранится в цитоплазме ооцита и транслоцируется в ядро клетки на ранних стадиях эмбрионального развития, тогда как соматический DNMT1 всегда обнаруживается в ядре соматической ткани.
Эмбриональные стволовые клетки с нулевой мутацией DNMT1 были жизнеспособны и содержали небольшой процент метилированной ДНК и активности метилтрансферазы. Мышиные эмбрионы, гомозиготные по делеции Dnmt1, погибают на 10–11 день беременности. [31]
Хотя этот фермент имеет сильное сходство последовательностей с 5-метилцитозинметилтрансферазами как прокариот, так и эукариот, в 2006 году было показано, что фермент метилирует положение 38 в транспортной РНК аспарагиновой кислоты и не метилирует ДНК. [32] Название этой метилтрансферазы было изменено с DNMT2 на TRDMT1 (тРНК метилтрансфераза аспарагиновой кислоты 1), чтобы лучше отражать ее биологическую функцию. [33] TRDMT1 является первой РНК-цитозинметилтрансферазой, идентифицированной в клетках человека.
DNMT3 представляет собой семейство ДНК -метилтрансфераз, которые могут метилировать гемиметилированные и неметилированные CpG с одинаковой скоростью. Архитектура ферментов DNMT3 аналогична архитектуре DNMT1, с регуляторной областью, прикрепленной к каталитическому домену. Существует как минимум пять членов семейства DNMT3: DNMT3a1, DNMT3a2, 3b, 3c и 3L.
DNMT3a1, DNMT3a2 и DNMT3b могут опосредовать метилирование сайтов CpG в промоторах генов, что приводит к репрессии генов . Эти ДНК-метилтрансферазы могут также метилировать сайты CpG в кодирующих областях генов, где такое метилирование может увеличивать транскрипцию генов. [34] Работа с DNMT3a1 показала, что он преимущественно локализован на CpG-островках, бивалентно маркированных H3K4me3 (метка, способствующая транскрипции) и H3K27me3 (метка, репрессирующая транскрипцию), совпадающие с промоторами многих факторов транскрипции . Работа с DNMT3a2 в нейронах показала, что изменения метилирования ДНК, вызванные DNMT3a2, преимущественно происходят в межгенных и интронных областях. Считалось, что эти межгенные и интронные метилирования ДНК, вероятно, регулируют активность энхансеров , альтернативный сплайсинг или экспрессию некодирующих РНК . [35]
DNMT3a1 может совместно локализоваться с белком гетерохроматина (HP1) и метил-CpG-связывающим белком (MeCBP), а также с рядом других факторов. [36] Они также могут взаимодействовать с DNMT1, что может быть кооперативным событием во время метилирования ДНК. DNMT3a предпочитает метилирование CpG метилированию CpA, CpT и CpC, хотя, по-видимому, существует некоторое предпочтение последовательностей метилирования для DNMT3a и DNMT3b. DNMT3a метилирует сайты CpG со скоростью, намного меньшей, чем DNMT1, но большей, чем DNMT3b.
Экспрессия DNMT3a2 отличается от DNMT3a1 и DNMT3b, поскольку экспрессия DNMT3a2 происходит по образцу непосредственно раннего гена . Экспрессия DNMT3a2 в нейронах индуцируется, например, в результате новой активности нейронов. [37] [35] Это может иметь значение для формирования долговременной памяти . [38] У крыс высокие уровни метилирования новой ДНК в нейронах гиппокампа возникают после того , как крысе навязано запоминающееся событие, такое как контекстуальное обусловливание страха . [19] Байрактар и Кройц [39] обнаружили, что ингибиторы DNMT, применяемые в мозге, предотвращают формирование долговременных воспоминаний.
DNMT3L содержит мотивы ДНК-метилтрансферазы и необходим для установления материнских геномных отпечатков , несмотря на то, что он каталитически неактивен. DNMT3L экспрессируется во время гаметогенеза , когда происходит геномный импринтинг . Потеря DNMT3L приводит к биаллельной экспрессии генов, обычно не экспрессируемых материнским аллелем. DNMT3L взаимодействует с DNMT3a и DNMT3b и совместно локализуется в ядре. Хотя DNMT3L, по-видимому, неспособен к метилированию , он может участвовать в репрессии транскрипции .
Из-за эпигенетических эффектов семейства DNMT некоторые ингибиторы DNMT исследуются для лечения некоторых видов рака: [40]