В биохимии флавинадениндинуклеотид ( ФАД ) представляет собой окислительно -восстановительный кофермент , связанный с различными белками , который участвует в ряде ферментативных реакций метаболизма . Флавопротеин представляет собой белок, содержащий флавиновую группу , которая может быть в форме FAD или флавинмононуклеотида (FMN). Известны многие флавопротеины: компоненты сукцинатдегидрогеназного комплекса, α-кетоглутаратдегидрогеназы и компонент пируватдегидрогеназного комплекса .
FAD может существовать в четырех окислительно-восстановительных состояниях: флавин-N(5)-оксид , хинон , семихинон и гидрохинон . [1] FAD преобразуется между этими состояниями путем принятия или отдачи электронов. FAD в своей полностью окисленной форме, или хиноновой форме, принимает два электрона и два протона, образуя FADH 2 (форма гидрохинона). Семихинон (ФАДН · ) может быть образован либо восстановлением ФАД, либо окислением ФАДН 2 путем принятия или отдачи одного электрона и одного протона соответственно. Однако некоторые белки генерируют и поддерживают суперокисленную форму кофактора флавина — флавин-N(5)-оксид. [2] [3]
Флавопротеины были впервые открыты в 1879 году путем разделения компонентов коровьего молока. Первоначально их называли лактохромами из-за молочного происхождения и желтого пигмента . [4] Научному сообществу потребовалось 50 лет, чтобы добиться существенного прогресса в идентификации молекул, ответственных за желтый пигмент. В 1930-е годы началась область исследований коферментов с публикацией многих структур производных флавина и никотинамида и их облигатной роли в окислительно-восстановительном катализе. В 1932 году немецкие ученые Отто Варбург и Вальтер Кристиан обнаружили полученный из дрожжей желтый белок, необходимый для клеточного дыхания. Их коллега Хьюго Теорелл разделил этот желтый фермент на апофермент и желтый пигмент и показал, что ни фермент, ни пигмент не способны окислять НАДН на их клетках. самостоятельно, но смешивание их вместе восстановит активность. В 1937 году Теорелл подтвердил, что пигмент представляет собой фосфатный эфир рибофлавина , флавинмононуклеотид (FMN), что стало первым прямым доказательством существования кофакторов ферментов . [5] Варбург и Кристиан затем обнаружили, что FAD является кофактором оксидазы D-аминокислот в ходе аналогичных экспериментов в 1938 году. [6] Работа Варбурга по связыванию никотинамида с переносом гидрида и открытие флавинов проложили путь многим ученым в 40-х годах. и 50-е годы, чтобы открыть большое количество окислительно-восстановительной биохимии и связать их вместе в таких путях, как цикл лимонной кислоты и синтез АТФ .
Флавинадениндинуклеотид состоит из двух частей: адениннуклеотида ( аденозинмонофосфата ) и флавинмононуклеотида (FMN) , соединенных друг с другом посредством своих фосфатных групп. Аденин связан с циклической рибозой по углероду 1' , тогда как фосфат связан с рибозой по углероду 5' , образуя нуклеотид аденина. Рибофлавин образуется за счет связи углерод-азот (CN) между изоаллоксазином и рибитом . Затем фосфатная группа связывается с концевым углеродом рибозы, образуя FMN. Поскольку связь между изоаллоксазином и рибитом не считается гликозидной связью , флавинмононуклеотид на самом деле не является нуклеотидом. [7] Это делает название динуклеотида вводящим в заблуждение; однако группа флавинмононуклеотидов по своей структуре и химическим свойствам все же очень близка к нуклеотиду.
FAD можно преобразовать в FADH 2 путем добавления 2 H + и 2 e − . ФАДН 2 также может окисляться за счет потери 1 H + и 1 e - с образованием ФАДН. Форму FAD можно воссоздать за счет дальнейшей потери 1 H + и 1 e − . Образование FAD также может происходить за счет восстановления и дегидратации флавин-N(5)-оксида. [8] В зависимости от степени окисления флавины в водном растворе приобретают определенный цвет . флавин-N(5)-оксид (переокисленный) имеет желто-оранжевый цвет, FAD (полностью окисленный) — желтый, FADH (полувосстановленный) — синий или красный в зависимости от pH , а полностью восстановленная форма бесцветна. [9] [10] Изменение формы может оказать большое влияние на другие химические свойства. Например, FAD, полностью окисленная форма, подвержена нуклеофильной атаке , полностью восстановленная форма FADH 2 обладает высокой поляризуемостью , тогда как полувосстановленная форма нестабильна в водном растворе. [11] FAD представляет собой ароматическую кольцевую систему, тогда как FADH 2 таковой не является. [12] Это означает, что FADH 2 имеет значительно более высокую энергию без стабилизации за счет резонанса , которую обеспечивает ароматическая структура. ФАДН 2 представляет собой молекулу, несущую энергию, поскольку после окисления она восстанавливает ароматичность и высвобождает энергию, представленную этой стабилизацией.
Спектроскопические свойства FAD и его вариантов позволяют контролировать реакцию с помощью абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии UV-VIS . Каждая форма FAD имеет различные спектры поглощения, что позволяет легко наблюдать изменения степени окисления. [11] Основной локальный максимум поглощения FAD наблюдается при 450 нм с коэффициентом экстинкции 11 300 M -1 см -1 . [13] Флавины, как правило, обладают флуоресцентной активностью в несвязанном состоянии (белки, связанные с производными нуклеиновых кислот флавина, называются флавопротеинами ). Это свойство можно использовать при изучении связывания белков, наблюдая потерю флуоресцентной активности при переводе в связанное состояние. [11] Окисленные флавины имеют высокую оптическую плотность около 450 нм и флуоресценцию около 515-520 нм. [9]
В биологических системах ФАД действует как акцептор H + и e- в полностью окисленной форме, акцептор или донор в форме ФАДН и донор в восстановленной форме ФАДН 2 . На диаграмме ниже показаны потенциальные изменения, которым он может подвергнуться.
Наряду с тем, что видно выше, могут образовываться и потребляться другие реактивные формы ФАД. Эти реакции включают перенос электронов и образование/разрыв химических связей . Благодаря механизмам реакции FAD может способствовать химической активности в биологических системах. На следующих рисунках показаны общие формы некоторых действий, в которых может участвовать FAD.
Механизмы 1 и 2 представляют собой усиление гидрида , при котором молекула приобретает один ион гидрида. Механизмы 3 и 4 образования радикалов и потери гидрида. Радикальные виды содержат неспаренные электронные атомы и очень химически активны. Потеря гидрида - это процесс, обратный наблюдаемому ранее увеличению гидрида. Последние два механизма демонстрируют нуклеофильное присоединение и реакцию с использованием углеродного радикала.
ФАД играет важную роль в качестве кофактора фермента наряду с флавинмононуклеотидом , еще одной молекулой, происходящей из рибофлавина. [8] Бактерии, грибы и растения могут производить рибофлавин , но другие эукариоты , такие как люди, утратили способность производить его. [9] Таким образом, люди должны получать рибофлавин, также известный как витамин B2, из пищевых источников. [14] Рибофлавин обычно попадает в тонкий кишечник, а затем транспортируется в клетки через белки-переносчики. [9] Рибофлавинкиназа (EC 2.7.1.26) добавляет фосфатную группу к рибофлавину с образованием флавинмононуклеотида, а затем FAD - синтетаза присоединяет адениннуклеотид ; оба шага требуют АТФ . [9] Бактерии обычно имеют один бифункциональный фермент, но археи и эукариоты обычно используют два разных фермента. [9] Текущие исследования показывают, что в цитозоле и митохондриях существуют различные изоформы . [9] Похоже, что ФАД синтезируется в обоих местах и потенциально транспортируется туда, где это необходимо. [11]
Флавопротеины используют уникальную и универсальную структуру флавиновых фрагментов для катализа сложных окислительно-восстановительных реакций. Поскольку флавины имеют несколько окислительно-восстановительных состояний, они могут участвовать в процессах, включающих перенос одного или двух электронов, атомов водорода или ионов гидроксония . N5 и C4a полностью окисленного флавинового кольца также подвержены нуклеофильной атаке . [15] Такое широкое разнообразие ионизации и модификаций флавинового фрагмента можно объяснить изоаллоксазиновой кольцевой системой и способностью флавопротеинов резко нарушать кинетические параметры флавинов при связывании, включая флавинадениндинуклеотид (FAD).
Количество генов, кодирующих флавин-зависимые белки, в геноме (флавопротеом) зависит от вида и может варьироваться от 0,1% до 3,5%, при этом у людей имеется 90 генов, кодируемых флавопротеинами. [16] FAD является более сложной и распространенной формой флавина и, как сообщается, связывается с 75% общего флавопротеома [16] и 84% флавопротеинов, кодируемых человеком. [17] Сообщалось о клеточных концентрациях свободных или нековалентно связанных флавинов в различных культивируемых линиях клеток млекопитающих для FAD (2,2-17,0 амоль/клетка) и FMN (0,46-3,4 амоль/клетка). [18]
ФАД имеет более положительный восстановительный потенциал , чем НАД+ , и является очень сильным окислителем. Клетка использует это во многих энергетически сложных реакциях окисления, таких как дегидрирование связи CC до алкена . FAD-зависимые белки участвуют в самых разных метаболических путях, включая транспорт электронов, репарацию ДНК, биосинтез нуклеотидов, бета-окисление жирных кислот, катаболизм аминокислот, а также синтез других кофакторов, таких как CoA , CoQ и гемовые группы. Одна хорошо известная реакция является частью цикла лимонной кислоты (также известного как цикл трикарбоновой кислоты или цикл Кребса); сукцинатдегидрогеназа (комплекс II в цепи переноса электронов ) требует ковалентно связанного FAD, чтобы катализировать окисление сукцината до фумарата путем его связывания с восстановлением убихинона до убихинола . [11] Высокоэнергетические электроны от этого окисления мгновенно сохраняются за счет восстановления FAD до FADH 2 . Затем FADH 2 превращается в FAD, отправляя два своих высокоэнергетических электрона через цепь переноса электронов; энергии в ФАДН 2 достаточно для получения 1,5 эквивалента АТФ [19] путем окислительного фосфорилирования . Некоторые редокс-флавопротеины нековалентно связываются с FAD, например ацетил-КоА-дегидрогеназы , которые участвуют в бета-окислении жирных кислот и катаболизме аминокислот, таких как лейцин ( изовалерил-КоА-дегидрогеназа ), изолейцин (ацил-КоА с короткой/разветвленной цепью). дегидрогеназа), валин (изобутирил-КоА-дегидрогеназа) и лизин ( глутарил-КоА-дегидрогеназа ). [20] Дополнительными примерами FAD-зависимых ферментов, которые регулируют метаболизм, являются глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (синтез триглицеридов) и ксантиноксидаза, участвующие в катаболизме пуриновых нуклеотидов. [21] Некаталитические функции, которые FAD может выполнять во флавопротеинах, включают структурную роль или участие в чувствительных к синему свету фоторецепторах , которые регулируют биологические часы и развитие, генерацию света в биолюминесцентных бактериях. [20]
Флавопротеины имеют в качестве простетической группы молекулу FMN или FAD, эта простетическая группа может быть прочно связанной или ковалентно связанной. Лишь около 5-10% флавопротеинов имеют ковалентно связанный FAD, но эти ферменты обладают более сильной окислительно-восстановительной способностью. [11] В некоторых случаях FAD может обеспечивать структурную поддержку активных центров или обеспечивать стабилизацию промежуточных продуктов во время катализа. [20] На основании имеющихся структурных данных известные сайты связывания FAD можно разделить более чем на 200 типов. [22]
В геноме человека закодировано 90 флавопротеинов; около 84% требуют FAD и около 16% требуют FMN, тогда как 5 белков требуют присутствия обоих. [17] Флавопротеины в основном расположены в митохондриях из-за их окислительно-восстановительной способности. [17] Из всех флавопротеинов 90% осуществляют окислительно-восстановительные реакции, а остальные 10% представляют собой трансферазы , лиазы , изомеразы , лигазы . [16]
Моноаминоксидаза (МАО) является широко изученным флавоферментом из-за его биологической важности в катаболизме норадреналина , серотонина и дофамина . МАО окисляет первичные, вторичные и третичные амины, которые неферментативно гидролизуются из имина до альдегида или кетона . Несмотря на то, что этот класс ферментов тщательно изучен, механизм его действия все еще обсуждается. Было предложено два механизма: радикальный и нуклеофильный. Радикальный механизм менее общепринят, поскольку не существует свидетельств спектрального или электронного парамагнитного резонанса о наличии радикального промежуточного соединения. Нуклеофильный механизм является более предпочтительным, поскольку он подтверждается исследованиями сайт-направленного мутагенеза , в ходе которых были мутированы два остатка тирозина, которые, как ожидалось, увеличивали нуклеофильность субстратов. [23]
Глюкозооксидаза (GOX) катализирует окисление β-D-глюкозы до D-глюконо-δ-лактона с одновременным восстановлением связанного с ферментом флавина. GOX существует в виде гомодимера, каждая субъединица которого связывает одну молекулу FAD. Кристаллические структуры показывают, что FAD связывается в глубоком кармане фермента вблизи границы раздела димеров. Исследования показали, что при замене ФАД на 8-гидрокси-5-карба-5-деаза ФАД стереохимия реакции определяется взаимодействием с рефлавином . При обороте наблюдаются нейтральные и анионные семихиноны, что указывает на радикальный механизм. [23]
Пренилцистеинлиаза (PCLase) катализирует расщепление пренилцистеина (модификация белка) с образованием изопреноидного альдегида и освобожденного остатка цистеина на белке-мишени. FAD нековалентно связан с PCLазой. Было проведено не так много механистических исследований реакций флавина, но предлагаемый механизм показан ниже. Предполагается гидридный перенос от C1 пренильной группы к FAD, приводящий к восстановлению флавина до FADH 2 . COformED – это карбокатион , стабилизированный соседним атомом серы. Затем FADH 2 реагирует с молекулярным кислородом, восстанавливая окисленный фермент. [23]
УДФ-N-ацетиленолпирувилглюкозаминредуктаза (MurB) представляет собой фермент, катализирующий НАДФН -зависимое восстановление енолпирувил-УДФ-N-ацетилглюкозамина (субстрата) до соответствующего D-лактильного соединения УДФ-N-ацетилмурамовой кислоты (продукта). MurB является мономером и содержит одну молекулу FAD. Прежде чем субстрат сможет быть преобразован в продукт, НАДФН должен сначала восстановить ФАД. Как только НАДФ + диссоциирует, субстрат может связываться, а восстановленный флавин может восстанавливать продукт. [23]
Глутатионредуктаза (GR) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (GSSG) до глутатиона (GSH). GR требует ФАД и НАДФН для облегчения этой реакции; сначала гидрид должен быть переведен из НАДФН в ФАД. Восстановленный флавин может затем действовать как нуклеофил , атакуя дисульфид, при этом образуется аддукт C4a-цистеин. Удаление этого аддукта приводит к образованию флавин-тиолатного комплекса с переносом заряда. [23]
Ферменты типа цитохрома P450 , которые катализируют реакции монооксигеназы (гидроксилирования), зависят от переноса двух электронов от FAD к P450. У эукариот обнаружено два типа систем P450. Системы P450, расположенные в эндоплазматическом ретикулуме, зависят от редуктазы цитохрома P-450 (CPR), которая содержит как FAD, так и FMN . Два электрона восстановленного FAD (FADH 2 ) передаются по одному на FMN, а затем один электрон передается от FMN к гему P450. [24]
Системы P450, расположенные в митохондриях, зависят от двух белков-переносчиков электронов: FAD, содержащего адренодоксинредуктазу (AR), и небольшого белка, содержащего железо-серную группу, называемого адренодоксин . FAD встроен в FAD-связывающий домен AR. [25] [26] FAD AR восстанавливается до FADH 2 за счет переноса двух электронов от НАДФН, который связывается в НАДФ-связывающем домене AR. Структура этого фермента высоко консервативна, что позволяет поддерживать точное выравнивание донора электронов НАДФН и акцептора ФАД для эффективного переноса электронов. [26] Два электрона в восстановленном FAD по одному передаются адренодоксину, который, в свою очередь, отдает одиночный электрон гемовой группе митохондриального P450. [27]
Структуры редуктазы микросомальной и редуктазы митохондриальной системы Р450 совершенно различны и не имеют гомологии. [24]
п -Гидроксибензоатгидроксилаза (ПГБГ) катализирует окисление п -гидроксибензоата ( п- ОНБ) до 3,4-дигидроксибензоата (3,4-диОНБ); Для этой реакции необходимы ФАД, НАДФН и молекулярный кислород. НАДФН сначала переносит гидридный эквивалент ФАД, создавая ФАДН- , а затем НАДФ + диссоциирует от фермента. Восстановленный ПГБГ затем реагирует с молекулярным кислородом с образованием гидропероксида флавин-С(4а). Гидроперекись флавина быстро гидроксилирует p- OHB, а затем удаляет воду для регенерации окисленного флавина. [23] Альтернативный механизм оксигенации, опосредованный флавином, включает использование флавин-N(5)-оксида , а не флавин-C(4a)-(гидро)пероксида. [2] [3]
Хоризматсинтаза (CS) катализирует последний этап шикиматного пути — образование хоризмата. Известны два класса CS, оба из которых требуют FMN , но разделены по потребности в НАДФН в качестве восстановителя. Предлагаемый механизм CS включает радикальные формы. Радикальные виды флавина не были обнаружены спектроскопически без использования аналога субстрата, что позволяет предположить, что они недолговечны. Однако при использовании фторированного субстрата был обнаружен нейтральный флавин-семихинон. [23]
Глутаматсинтаза катализирует превращение 2-оксоглутарата в L-глутамат, при этом L-глутамин служит источником азота для реакции. Все продукты синтеза глутамата представляют собой железо-серные флавопротеины, содержащие железо-серный кластер и ФМН. Три класса синтеза глутамата классифицируются на основе их последовательности и биохимических свойств. Несмотря на то, что существует три класса этого фермента, считается, что все они действуют по одному и тому же механизму, отличаясь только тем, что первым восстанавливает FMN. Фермент производит две молекулы глутамата: одну за счет гидролиза глутамина (с образованием глутамата и аммиака), а вторую за счет аммиака, полученного в результате первой реакции, атакующей 2-оксоглутарат, который восстанавливается ФМН до глутамата. [23]
Учитывая важность флавопротеинов , неудивительно, что около 60% флавопротеинов человека вызывают заболевания человека при мутации. [17] В некоторых случаях это происходит из-за снижения сродства к FAD или FMN, поэтому избыточное потребление рибофлавина может уменьшить симптомы заболевания, например, при множественном дефиците ацил-КоА-дегидрогеназы . [9] Кроме того, дефицит рибофлавина сам по себе (и, как следствие, отсутствие FAD и FMN) может вызвать проблемы со здоровьем. [9] Например, у пациентов с БАС снижается уровень синтеза ФАД. [9] Оба этих пути могут привести к различным симптомам, включая аномалии развития или желудочно-кишечные расстройства, нарушение расщепления жиров , анемию , неврологические проблемы, рак или болезни сердца , мигрень , ухудшение зрения и поражения кожи. [9] Поэтому фармацевтическая промышленность производит рибофлавин для дополнения диеты в определенных случаях. В 2008 году мировая потребность в рибофлавине составила 6 000 тонн в год при производственной мощности 10 000 тонн. [4] Этот рынок стоимостью от 150 до 500 миллионов долларов предназначен не только для медицинских целей, но также используется в качестве добавки к кормам для животных в сельскохозяйственной промышленности и в качестве пищевого красителя . [4]
Новые разработки антибактериальных препаратов продолжают иметь важное значение в научных исследованиях, поскольку устойчивость бактерий к обычным антибиотикам возрастает. Специфический метаболический белок, использующий FAD ( Комплекс II ), жизненно важен для вирулентности бактерий, поэтому нацеливание на синтез FAD или создание аналогов FAD может быть полезной областью исследований. [28] Ученые уже определили две структуры, которые FAD обычно предполагает после связывания: либо расширенную конформацию, либо конформацию бабочки, в которой молекула по существу складывается пополам, что приводит к укладке адениновых и изоаллоксазиновых колец. [14] Имитаторы FAD, которые способны связываться аналогичным образом, но не обеспечивают функцию белка, могут быть полезными механизмами ингибирования бактериальной инфекции. [14] Альтернативно, той же цели могут достичь препараты, блокирующие синтез FAD; это особенно интригует, поскольку синтез FAD у человека и бактерий основан на очень разных ферментах, а это означает, что лекарство, созданное для воздействия на бактериальную FAD-синтазу, вряд ли будет мешать ферментам FAD-синтазы человека. [29]
Оптогенетика позволяет контролировать биологические события неинвазивным способом. [30] В последние годы в этой области появился ряд новых инструментов, в том числе для запуска светочувствительности, таких как домены FAD с использованием синего света (BLUF). BLUF кодируют последовательность из 100–140 аминокислот , полученную из фоторецепторов растений и бактерий. [30] Подобно другим фоторецепторам , свет вызывает структурные изменения в домене BLUF, что приводит к нарушению последующих взаимодействий. [30] Текущие исследования изучают белки с добавленным доменом BLUF и то, как различные внешние факторы могут влиять на белки. [30]
В организме есть ряд молекул, обладающих собственной флуоресценцией , включая триптофан, коллаген , ФАД, НАДН и порфирины . [31] Ученые воспользовались этим, используя их для мониторинга прогрессирования заболевания, эффективности лечения или помощи в диагностике. Например, нативная флуоресценция ФАД и НАДН различается в нормальных тканях и подслизистом фиброзе полости рта , что является ранним признаком инвазивного рака полости рта . [31] Поэтому врачи используют флуоресценцию для диагностики и контроля лечения в отличие от стандартной биопсии . [31]
