Нестабильность генома (также генетическая нестабильность или геномная нестабильность ) относится к высокой частоте мутаций в геноме клеточной линии . Эти мутации могут включать изменения в последовательностях нуклеиновых кислот , хромосомные перестройки или анеуплоидию . Нестабильность генома встречается у бактерий. [1] У многоклеточных организмов нестабильность генома является центральной для канцерогенеза, [2] а у людей она также является фактором некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз или нервно-мышечное заболевание миотоническая дистрофия .
Источники нестабильности генома начали выяснять только недавно. Высокая частота внешних повреждений ДНК [3] может быть одним из источников нестабильности генома, поскольку повреждение ДНК может вызвать неточный синтез ДНК через повреждение или ошибки в репарации, что приводит к мутации . Другим источником нестабильности генома может быть эпигенетическое или мутационное снижение экспрессии генов репарации ДНК. Поскольку эндогенные (метаболически вызванные) повреждения ДНК очень часты, в среднем более 60 000 раз в день в геномах человеческих клеток, любое снижение репарации ДНК, вероятно, является важным источником нестабильности генома.
Обычно все клетки в особи данного вида (растение или животное) показывают постоянное число хромосом , которые составляют то, что известно как кариотип , определяющий этот вид (см. также Список числа хромосом различных организмов ), хотя некоторые виды демонстрируют очень высокую кариотипическую изменчивость. У людей мутации, которые могут изменить аминокислоту в области кодирования белка генома, происходят в среднем только 0,35 на поколение (менее одного мутировавшего белка на поколение). [4]
Иногда у вида со стабильным кариотипом могут наблюдаться случайные вариации, которые изменяют нормальное число хромосом. В других случаях наблюдаются структурные изменения (например, хромосомные транслокации , делеции ), которые изменяют стандартный хромосомный набор. В этих случаях указывается, что пораженный организм демонстрирует нестабильность генома (также генетическую нестабильность или даже хромосомную нестабильность ). Процесс нестабильности генома часто приводит к ситуации анеуплоидии , при которой клетки представляют число хромосом, которое либо выше, либо ниже нормального для вида.
В клеточном цикле ДНК обычно наиболее уязвима во время репликации. Реплисома должна уметь преодолевать препятствия, такие как плотно скрученный хроматин со связанными белками, одно- и двухцепочечные разрывы, которые могут привести к остановке репликационной вилки. Каждый белок или фермент в реплисоме должен хорошо выполнять свою функцию, чтобы получить идеальную копию ДНК. Мутации белков, таких как ДНК-полимераза или ДНК-лигаза, могут привести к нарушению репликации и спонтанным хромосомным обменам. [5] Такие белки, как Tel1 и Mec1 (ATR, ATM у людей), могут обнаруживать одно- и двухцепочечные разрывы и привлекать такие факторы, как геликаза Rmr3 , для стабилизации репликационной вилки с целью предотвращения ее коллапса. Мутации в Tel1, Mec1 и геликазе Rmr3 приводят к значительному увеличению хромосомной рекомбинации. ATR реагирует специфически на остановившиеся репликационные вилки и одноцепочечные разрывы, возникающие в результате повреждения УФ-излучением, в то время как ATM реагирует непосредственно на двухцепочечные разрывы. Эти белки также предотвращают переход в митоз, ингибируя срабатывание поздних точек начала репликации до тех пор, пока разрывы ДНК не будут исправлены фосфорилированием CHK1 и CHK2, что приводит к сигнальному каскаду, останавливающему клетку в S-фазе. [6] Для одноцепочечных разрывов репликация происходит до места разрыва, затем другая цепь разрезается, образуя двухцепочечный разрыв, который затем может быть восстановлен с помощью репликации, вызванной разрывом, или гомологичной рекомбинации с использованием сестринской хроматиды в качестве безошибочного шаблона. [7] В дополнение к контрольным точкам S-фазы существуют контрольные точки G1 и G2 для проверки временных повреждений ДНК, которые могут быть вызваны мутагенами, такими как повреждение УФ-излучением. Примером может служить ген Saccharomyces pombe rad9, который останавливает клетки в поздней фазе S/G2 при наличии повреждения ДНК, вызванного радиацией. Клетки дрожжей с дефектным rad9 не смогли остановить рост после облучения, продолжили деление клеток и быстро погибли; клетки с диким типом rad9 успешно остановились в поздней фазе S/G2 и остались жизнеспособными. Остановленные клетки смогли выжить благодаря увеличенному времени в фазе S/G2, что позволило ферментам репарации ДНК функционировать в полной мере. [8]
В геноме есть горячие точки, где последовательности ДНК склонны к пробелам и разрывам после ингибирования синтеза ДНК, как в вышеупомянутом останове контрольной точки. Эти сайты называются хрупкими сайтами и могут часто встречаться как естественно присутствующие в большинстве геномов млекопитающих или редко встречаться в результате мутаций, таких как расширение повторов ДНК. Редкие хрупкие сайты могут приводить к генетическим заболеваниям, таким как синдром умственной отсталости ломкой X-хромосомы, миотоническая дистрофия, атаксия Фридриха и болезнь Хантингтона, большинство из которых вызваны расширением повторов на уровне ДНК, РНК или белка. [9] Хотя, казалось бы, эти общие хрупкие сайты вредны, они сохраняются вплоть до дрожжей и бактерий. Эти вездесущие сайты характеризуются тринуклеотидными повторами, чаще всего CGG, CAG, GAA и GCN. Эти тринуклеотидные повторы могут образовывать шпильки, что приводит к затруднению репликации. При репликационном стрессе , таком как дефектный механизм или дальнейшее повреждение ДНК, на этих хрупких участках могут образовываться разрывы и пробелы ДНК. Использование сестринской хроматиды в качестве репарации не является надежным резервным копированием, поскольку окружающая информация ДНК повторов n и n+1 практически одинакова, что приводит к изменению числа копий. Например, 16-я копия CGG может быть сопоставлена с 13-й копией CGG в сестринской хроматиде, поскольку окружающая ДНК — это обе CGGCGGCGG..., что приводит к 3 дополнительным копиям CGG в конечной последовательности ДНК. [ необходима цитата ]
И у E. coli, и у Saccharomyces pombe сайты транскрипции, как правило, имеют более высокие скорости рекомбинации и мутаций. Кодирующая или нетранскрибируемая цепь накапливает больше мутаций, чем цепь-матрица. Это связано с тем, что кодирующая цепь является одноцепочечной во время транскрипции, которая химически более нестабильна, чем двухцепочечная ДНК. Во время удлинения транскрипции суперспирализация может происходить за удлиняющейся РНК-полимеразой, что приводит к одноцепочечным разрывам. Когда кодирующая цепь является одноцепочечной, она также может гибридизироваться сама с собой, создавая вторичные структуры ДНК, которые могут нарушить репликацию. У E. coli при попытке транскрибировать триплеты GAA, такие как те, которые обнаруживаются при атаксии Фридриха, полученная РНК и цепь-матрица могут образовывать несовпадающие петли между различными повторами, оставляя комплементарный сегмент в кодирующей цепи доступным для формирования собственных петель, которые препятствуют репликации. [10] Более того, репликация ДНК и транскрипция ДНК не являются временно независимыми; они могут происходить одновременно и приводить к столкновениям между репликационной вилкой и комплексом РНК-полимеразы. У S. cerevisiae геликаза Rrm3 обнаружена в высокотранскрибируемых генах в геноме дрожжей, которая привлекается для стабилизации останавливающейся репликационной вилки, как описано выше. Это говорит о том, что транскрипция является препятствием для репликации, что может привести к повышенному напряжению в хроматине, охватывающем короткое расстояние между раскрученной репликационной вилкой и местом начала транскрипции, что потенциально приводит к разрывам одноцепочечной ДНК. У дрожжей белки действуют как барьеры на 3' транскрипционной единицы, предотвращая дальнейшее перемещение репликационной вилки ДНК. [11]
В некоторых частях генома изменчивость необходима для выживания. Одним из таких мест являются гены Ig. В пре-В-клетке область состоит из всех сегментов V, D и J. Во время развития В-клетки выбирается определенный сегмент V, D и J для сплайсинга с образованием конечного гена, который катализируется рекомбиназами RAG1 и RAG2. Затем активируемая дезаминаза цитидина (AID) преобразует цитидин в урацил. Урацил обычно не существует в ДНК, и поэтому основание вырезается, а надрез превращается в двухцепочечный разрыв, который восстанавливается негомологичным соединением концов (NHEJ). Эта процедура очень подвержена ошибкам и приводит к соматической гипермутации. Эта геномная нестабильность имеет решающее значение для обеспечения выживания млекопитающих при инфекции. Рекомбинация V, D, J может обеспечить миллионы уникальных рецепторов В-клеток; Однако случайная репарация посредством NHEJ вносит изменения, которые могут создать рецептор, способный связываться с антигенами с более высокой степенью сродства. [12]
Из примерно 200 неврологических и нервно-мышечных расстройств 15 имеют четкую связь с наследственным или приобретенным дефектом в одном из путей репарации ДНК или чрезмерным генотоксическим окислительным стрессом. [13] [14] Пять из них ( пигментная ксеродерма , синдром Коккейна , трихотиодистрофия , синдром Дауна и синдром Triple-A ) имеют дефект в пути эксцизионной репарации нуклеотидов ДНК. Шесть ( спиноцеребеллярная атаксия с аксональной нейропатией-1, болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона , синдром Дауна и боковой амиотрофический склероз ) кажутся результатом повышенного окислительного стресса и неспособности пути эксцизионной репарации оснований справляться с повреждениями ДНК, которые это вызывает. Четыре из них (болезнь Хантингтона, различные спиноцеребеллярные атаксии , атаксия Фридрейха и миотоническая дистрофия типов 1 и 2) часто имеют необычное расширение повторяющихся последовательностей в ДНК, вероятно, приписываемое нестабильности генома. Четыре ( атаксия-телеангиэктазия , расстройство, подобное атаксии-телеангиэктазии, синдром разрыва Неймегена и болезнь Альцгеймера) имеют дефекты в генах, участвующих в восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК. В целом, кажется, что окислительный стресс является основной причиной геномной нестабильности в мозге. Определенное неврологическое заболевание возникает, когда путь, который обычно предотвращает окислительный стресс, является дефицитным, или путь восстановления ДНК, который обычно восстанавливает повреждения, вызванные окислительным стрессом, является дефицитным. [ необходима цитата ]
При раке нестабильность генома может возникнуть до или в результате трансформации. [15] Нестабильность генома может относиться к накоплению дополнительных копий ДНК или хромосом , хромосомным транслокациям , хромосомным инверсиям , делециям хромосом , одноцепочечным разрывам ДНК, двухцепочечным разрывам ДНК, интеркаляции инородных веществ в двойную спираль ДНК или любым аномальным изменениям в третичной структуре ДНК, которые могут вызвать либо потерю ДНК, либо неправильную экспрессию генов. Ситуации нестабильности генома (а также анеуплоидии) обычны для раковых клеток, и они считаются «отличительной чертой» этих клеток. Непредсказуемая природа этих событий также является основным фактором гетерогенности, наблюдаемой среди опухолевых клеток. [ необходима цитата ]
В настоящее время принято считать, что спорадические опухоли (не семейные) возникают из-за накопления нескольких генетических ошибок. [16] В среднем рак молочной железы или толстой кишки может иметь около 60-70 мутаций, изменяющих белок, из которых около 3 или 4 могут быть «драйверными» мутациями, а остальные могут быть «пассажирскими» мутациями. [17] Любое генетическое или эпигенетическое повреждение, увеличивающее частоту мутаций , будет иметь следствием увеличение приобретения новых мутаций, увеличивая затем вероятность развития опухоли. [18] Известно, что в процессе опухолеобразования диплоидные клетки приобретают мутации в генах, ответственных за поддержание целостности генома ( гены-хранители ), а также в генах, которые напрямую контролируют клеточную пролиферацию ( гены-привратники ). [19] Генетическая нестабильность может возникать из-за недостатков в репарации ДНК, или из-за потери или приобретения хромосом, или из-за крупномасштабных хромосомных реорганизаций. Потеря генетической стабильности будет способствовать развитию опухолей, поскольку она способствует появлению мутантов, которые могут быть отобраны окружающей средой. [20]
Микроокружение опухоли оказывает ингибирующее действие на пути репарации ДНК , способствуя геномной нестабильности, что способствует выживанию опухоли, ее пролиферации и злокачественной трансформации. [21]
Кодирующие белки области генома человека, в совокупности называемые экзомом , составляют всего 1,5% от общего генома. [22] Как указывалось выше, обычно в среднем в экзоме на поколение (от родителя к ребенку) у людей происходит всего 0,35 мутаций. Во всем геноме (включая некодирующие белки области) на поколение у людей происходит всего около 70 новых мутаций. [23] [24]
Вероятной основной причиной мутаций при раке является повреждение ДНК. [ необходима цитата ] Например, в случае рака легких повреждение ДНК вызывается агентами в экзогенном генотоксичном табачном дыме (например, акролеин , формальдегид, акрилонитрил , 1,3-бутадиен, ацетальдегид, этиленоксид и изопрен). [25] Эндогенные (метаболически вызванные) повреждения ДНК также очень часты, происходящие в среднем более 60 000 раз в день в геномах человеческих клеток (см. Повреждение ДНК (естественное) ). Внешне и эндогенно вызванные повреждения могут быть преобразованы в мутации из-за неточного синтеза транслезии или неточного восстановления ДНК (например, путем негомологичного соединения концов ). Кроме того, повреждения ДНК также могут приводить к эпигенетическим изменениям во время восстановления ДНК. [26] [27] [28] Как мутации, так и эпигенетические изменения (эпимутации) могут способствовать прогрессированию рака .
Как отмечено выше, около 3 или 4 мутаций драйвера и 60 мутаций пассажира происходят в экзоме (область кодирования белка) рака. [17] Однако гораздо большее количество мутаций происходит в некодирующих белок областях ДНК. Среднее количество мутаций последовательности ДНК во всем геноме образца ткани рака молочной железы составляет около 20 000. [29] В среднем образце ткани меланомы (где меланомы имеют более высокую частоту мутаций экзома [17] ) общее количество мутаций последовательности ДНК составляет около 80 000. [30]
Высокая частота мутаций в общем геноме при раке предполагает, что часто раннее канцерогенное изменение может быть связано с дефицитом репарации ДНК. Скорость мутаций существенно увеличивается (иногда в 100 раз) в клетках, дефектных в репарации несоответствий ДНК [31] [32] или в гомологичной рекомбинационной репарации ДНК . [33] Кроме того, хромосомные перестройки и анеуплоидия увеличиваются у людей с дефектом гена репарации ДНК BLM . [34]
Дефицит репарации ДНК сам по себе может позволить повреждениям ДНК накапливаться, а подверженный ошибкам синтез транслезии после некоторых из этих повреждений может привести к мутациям. Кроме того, неправильное восстановление этих накопленных повреждений ДНК может привести к эпигенетическим изменениям или эпимутациям . Хотя мутация или эпимутация в гене репарации ДНК сама по себе не даст селективного преимущества, такой дефект репарации может переноситься как пассажир в клетке, когда клетка приобретает дополнительную мутацию/эпимутацию, которая действительно обеспечивает пролиферативное преимущество. Такие клетки, как с пролиферативными преимуществами, так и с одним или несколькими дефектами репарации ДНК (вызывающими очень высокую скорость мутаций), вероятно, приводят к 20 000–80 000 общих мутаций генома, часто наблюдаемых при раке. [ необходима цитата ]
В соматических клетках дефициты репарации ДНК иногда возникают из-за мутаций в генах репарации ДНК, но гораздо чаще они вызваны эпигенетическим снижением экспрессии генов репарации ДНК. Так, в последовательности из 113 случаев колоректального рака только четыре имели соматические миссенс-мутации в гене репарации ДНК MGMT, в то время как большинство этих видов рака имели сниженную экспрессию MGMT из-за метилирования промотора MGMT. [35] Пять отчетов, перечисленных в статье Эпигенетика (см. раздел «Эпигенетика репарации ДНК при раке»), представили доказательства того, что от 40% до 90% случаев колоректального рака имели сниженную экспрессию MGMT из-за метилирования промотора MGMT.
Аналогично, из 119 случаев колоректального рака, классифицированных как с дефицитом репарации несоответствий и отсутствием экспрессии гена репарации ДНК PMS2, Pms2 был дефицитным в 6 случаях из-за мутаций в гене PMS2, в то время как в 103 случаях экспрессия PMS2 была дефицитной, поскольку его партнер по спариванию MLH1 был подавлен из-за метилирования промотора (белок PMS2 нестабилен при отсутствии MLH1). [36] Другие 10 случаев потери экспрессии PMS2, вероятно, были вызваны эпигенетической сверхэкспрессией микроРНК, miR-155, которая подавляет MLH1. [37]
В эпигенетике рака (см. раздел Частота эпимутаций в генах репарации ДНК ) имеется частичный список эпигенетических дефектов, обнаруженных в генах репарации ДНК при спорадических видах рака. Они включают частоты от 13 до 100% эпигенетических дефектов в генах BRCA1 , WRN , FANCB , FANCF , MGMT , MLH1 , MSH2 , MSH4 , ERCC1 , XPF, NEIL1 и ATM, обнаруженных при раке, включая рак молочной железы, яичников, колоректальный рак, а также рак головы и шеи. Было обнаружено, что два или три эпигенетических дефицита в экспрессии ERCC1, XPF и/или PMS2 происходят одновременно в большинстве из 49 оцененных случаев рака толстой кишки. [38] Некоторые из этих дефицитов репарации ДНК могут быть вызваны эпимутациями в микроРНК , как обобщено в разделе статьи о микроРНК под названием miRNA, DNA repair and cancer .
Рак обычно возникает из-за нарушения работы опухолевого репрессора или нарушения регуляции онкогена. Знание того, что В-клетки испытывают разрывы ДНК во время развития, может дать представление о геноме лимфом. Многие типы лимфом вызваны хромосомной транслокацией, которая может возникнуть из-за разрывов в ДНК, приводящих к неправильному присоединению. При лимфоме Беркитта c-myc , онкоген, кодирующий фактор транскрипции, транслоцируется в положение после промотора гена иммуноглобулина, что приводит к нарушению регуляции транскрипции c-myc. Поскольку иммуноглобулины необходимы для лимфоцита и высоко экспрессируются для повышения обнаружения антигенов, c-myc затем также высоко экспрессируется, что приводит к транскрипции его мишеней , которые участвуют в пролиферации клеток. Лимфома из клеток мантии характеризуется слиянием циклина D1 с локусом иммуноглобулина. Циклин D1 ингибирует Rb, супрессор опухоли, что приводит к возникновению опухолей. Фолликулярная лимфома возникает в результате транслокации промотора иммуноглобулина в ген Bcl-2, что приводит к высокому уровню белка Bcl-2, который ингибирует апоптоз. В-клетки с поврежденной ДНК больше не подвергаются апоптозу, что приводит к дальнейшим мутациям, которые могут повлиять на драйверные гены, что приводит к опухолеобразованию. [39] Расположение транслокации в онкогене разделяет структурные свойства целевых областей AID , что позволяет предположить, что онкоген был потенциальной целью AID, что приводит к двухцепочечному разрыву, который был транслоцирован в локус гена иммуноглобулина посредством восстановления NHEJ . [40]