Пиридоксальфосфат ( PLP , пиридоксаль -5'- фосфат , P5P ), активная форма витамина B6 , является коферментом в различных ферментативных реакциях. Международный союз биохимии и молекулярной биологии каталогизировал более 140 PLP-зависимых активностей, что соответствует примерно 4% всех классифицированных активностей. [5] Универсальность PLP обусловлена его способностью ковалентно связывать субстрат, а затем действовать как электрофильный катализатор, тем самым стабилизируя различные типы карбанионных промежуточных продуктов реакции.
ПЛП действует как кофермент во всех реакциях переаминирования , а также в некоторых реакциях декарбоксилирования , дезаминирования и рацемизации аминокислот . [6] Альдегидная группа ПЛП образует связь Шиффового основания (внутренний альдимин ) с ε-аминогруппой специфической лизиновой группы фермента аминотрансферазы . α-аминогруппа аминокислотного субстрата замещает ε-аминогруппу остатка лизина в активном центре в процессе, известном как трансальдиминирование. Образующийся внешний альдимин может потерять протон, углекислый газ или боковую цепь аминокислоты и стать промежуточным хиноидом, который, в свою очередь, может действовать как нуклеофил в нескольких путях реакции.
При трансаминировании после депротонирования хиноноидный промежуточный продукт принимает протон в другом положении и становится кетимином . Образующийся кетимин гидролизуется так, что аминогруппа остается в комплексе. [7] Кроме того, PLP используется аминотрансферазами (или трансаминазами), которые действуют на необычные сахара, такие как перозамин и дезозамин . [8] В этих реакциях ПЛП реагирует с глутаматом , который передает свою альфа-аминогруппу ПЛП с образованием пиридоксаминофосфата (ПМП). Затем PMP передает свой азот сахару, образуя аминосахара .
PLP также участвует в различных реакциях бета-элиминирования, таких как реакции, осуществляемые сериндегидратазой и GDP-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазой (ColD) . [8]
Он также активен в реакции конденсации при синтезе гема .
ПЛП играет роль в превращении леводопы в дофамин , облегчает преобразование возбуждающего нейромедиатора глутамата в тормозной нейромедиатор ГАМК и позволяет SAM декарбоксилироваться с образованием пропиламина , который является предшественником полиаминов.
Пиридоксальфосфат выполняет множество функций в организме человека. Несколько примеров ниже:
ПЛП также обнаруживается в гликогенфосфорилазе в печени, где он используется для расщепления гликогена при гликогенолизе, когда глюкагон или адреналин сигнализируют ему об этом. Однако этот фермент не использует реакционноспособную альдегидную группу, а вместо этого использует фосфатную группу PLP для осуществления своей реакции.
Хотя подавляющее большинство PLP-зависимых ферментов образуют внутренний альдимин с PLP через остаток лизина в активном центре, некоторые PLP-зависимые ферменты не имеют этого остатка лизина, а вместо этого имеют гистидин в активном центре. В таком случае гистидин не может образовывать внутренний альдимин, и, следовательно, кофактор не становится ковалентно связанным с ферментом. GDP-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратаза (ColD) является примером такого фермента. [11] Сериновая гидроксиметилтрансфераза 2 человека регулирует реакции переноса одного углерода, необходимые для метаболизма аминокислот и нуклеотидов, и существует в димерной и тетрамерной формах. Димерный вариант SHMT2 является мощным ингибитором ферментного комплекса деубиквитилазы BRISC, который регулирует передачу сигналов в клетках на основе иммунной системы. Недавние исследования показывают, что тетрамеризация SJMT2 индуцируется PLP. Это предотвращает взаимодействие с комплексом деубикутилазы BRISC, потенциально связывая уровень витамина B6 и его метаболизм с воспалением. [12]
Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты (ферменты PLP) катализируют множество реакций. Хотя объем реакций, катализируемых PLP, кажется огромным, объединяющим принципом является образование внутреннего альдимина, производного лизина. Как только аминосубстрат взаимодействует с активным центром, образуется новое основание Шиффа, обычно называемое внешним альдимином. После этого этапа пути каждой реакции, катализируемой PLP, расходятся. [13]
Специфичность обеспечивается тем, что из четырех связей альфа-углерода аминокислоты в альдиминовом состоянии разрывается связь, перпендикулярная пиридиновому кольцу ( стереоэлектронная гипотеза Дунатана ). [14] [15] Следовательно, специфичность определяется тем, как ферменты связывают свои субстраты. Дополнительную роль в специфичности играет легкость протонирования азота пиридинового кольца. [16]
ПЛП удерживается в активном центре не только благодаря лизину, но и благодаря взаимодействию фосфатной группы и фосфатсвязывающего кармана и в меньшей степени благодаря стопке оснований пиридинового кольца с нависающим ароматическим остатком, обычно тирозином. (которые также могут участвовать в кислотно-основном катализе). Несмотря на ограниченные требования к карману связывания PLP, ферменты PLP принадлежат только к пяти различным семействам. Эти семейства плохо коррелируют с конкретным типом реакции. Пять семейств классифицируются как типы складок, за которыми следует римская цифра. [14]
Животные являются ауксотрофами по отношению к этому кофактору фермента и нуждаются в добавлении его или промежуточного продукта, отсюда его классификация как витамин B 6 , в отличие, например, от MoCo или CoQ10 . ПЛП синтезируется из пиридоксаля ферментом пиридоксалькиназой , для чего требуется одна молекула АТФ. ПЛП метаболизируется в печени.
В настоящее время известны два естественных пути PLP: один требует дезоксиксилулозо-5-фосфата (DXP), а другой нет, поэтому они известны как DXP-зависимые и DXP-независимые. Эти пути были тщательно изучены на Escherichia coli и Bacillus subtilis соответственно. Несмотря на различия в исходных соединениях и различное количество необходимых стадий, эти два пути имеют много общего. [17]
Зависимый от DXP путь биосинтеза требует нескольких этапов и сближения двух ветвей: одна производит 3-гидрокси-1-аминоацетонфосфат из эритрозо-4-фосфата , а другая (один фермент) производит дезоксисилулозо-5-фосфат (DXP) из глицеральдегида-3. -фосфат (GAP) и пируват . Продуктом конденсации 3-гидрокси-1-аминоацетонфосфата и дезоксилулозо-5-фосфата является пиридоксин-5'-фосфат. Конденсация катализируется PNP-синтазой , кодируемой pdxJ , которая создает PNP (пиридоксин-5'-фосфат). [18] Последним ферментом является PNP-оксидаза ( pdxH ), которая катализирует окисление 4'-гидроксильной группы до альдегида с использованием диоксигена, что приводит к образованию перекиси водорода.
Первая ветвь катализируется в E. coli ферментами, кодируемыми epd , pdxB , serC и pdxA . Они имеют механистическое сходство и гомологию с тремя ферментами биосинтеза серина ( serA (гомолог pdxB ), serC , serB — однако epd является гомологом разрыва ), что указывает на общее эволюционное происхождение двух путей. [19] У некоторых видов есть два гомолога гена serC E. coli , обычно один в опероне ser ( serC ), а другой в опероне pdx, и в этом случае он называется pdxF .
В библиотеке сверхэкспрессии был обнаружен «случайный путь», который мог подавлять ауксотрофию, вызванную делецией pdxB (кодирующей эритронат-4-фосфатдегидрогеназу) в E. coli . Случайный путь был очень неэффективен, но возможен из-за беспорядочной активности различных ферментов. Все началось с 3-фосфогидроксипирувата (продукта фермента, кодируемого serA в биосинтезе серина), и не требовало эритронат-4-фосфата. 3PHP был дефосфорилирован, в результате чего образовался нестабильный промежуточный продукт, который спонтанно декарбоксилируется (отсюда и присутствие фосфата в пути биосинтеза серина) до гликальдегида. Гликальдегид конденсировали с глицином, и фосфорилированным продуктом был 4-фосфогидрокситреонин (4PHT), канонический субстрат для 4-PHT дегидрогеназы ( pdxA ). [20]
DXP-независимый путь биосинтеза PLP состоит из этапа, катализируемого PLP-синтазой, ферментом, состоящим из двух субъединиц. PdxS катализирует конденсацию рибулозо-5-фосфата, глицеральдегид-3-фосфата и аммиака ; последние молекулы производятся PdxT, который катализирует производство аммиака из глутамина . PdxS представляет собой ствол (β/α)8 (также известный как TIM-цилиндр), образующий додекамер. [21]
Широкое использование ПЛП в центральном метаболизме, особенно в биосинтезе аминокислот, и его активность в отсутствие ферментов позволяют предположить, что ПЛП может быть «пребиотическим» соединением, то есть соединением, которое предшествовало зарождению органической жизни (не путать с с пребиотическими соединениями — веществами, которые служат источником питания для полезных бактерий). [22] Фактически, нагревание NH3 и гликоляльдегида самопроизвольно образует различные пиридины, включая пиридоксаль. [22] При определенных условиях ПЛП образуется из цианоацетилена, диацетилена, монооксида углерода, водорода, воды и фосфорной кислоты. [23]
Известно несколько ингибиторов ферментов PLP.
Один тип ингибитора образует электрофил с PLP, заставляя его необратимо реагировать с лизином активного центра. Такими ингибиторами являются ацетиленовые соединения (например, пропаргилглицин) и виниловые соединения (например, винилглицин). Другой тип ингибитора инактивирует PLP, например, аналоги α-метил- и амино-оксисубстрата (например, α-метилглутамат). Другие ингибиторы имеют хорошие уходящие группы, которые нуклеофильно атакуют PLP. Таков хлораланин , который ингибирует большое количество ферментов. [14]
Примеры ингибиторов:
Пиридоксаль-5-фосфат (витамин B6) -зависимые ферменты имеют множественное эволюционное происхождение. В целом ферменты B6 разделились на четыре независимые эволюционные линии: семейство α (т.е. аспартатаминотрансфераза ), семейство β ( сериндегидратаза ), семейство D- аланинаминотрансферазы и семейство аланинрацемазы . Пример эволюционного сходства семейства Бета можно увидеть в механизме. Все β-ферменты являются лиазами и катализируют реакции, в которых участвуют Cα и Cβ. В целом, в PLP -зависимых ферментах PLP в каждом случае ковалентно присоединен через иминную связь к аминогруппе в активном центре. [28]