stringtranslate.com

Иммуногистохимия

Основные закономерности окрашивания при хромогенной иммуногистохимии.
Иммунофлуоресценция кожи человека с использованием антитела против IgA. Кожа пациента с пурпурой Геноха-Шенлейна : в стенках мелких поверхностных капилляров обнаружены отложения IgA (желтые стрелки). Бледно-волнистая зеленая область сверху — это эпидермис , нижняя волокнистая область — дерма .

Иммуногистохимия ( ИГХ ) является наиболее распространенным применением иммуноокрашивания . Он включает в себя процесс избирательной идентификации антигенов (белков) в клетках участка ткани с использованием принципа специфического связывания антител с антигенами в биологических тканях . [1] ИГХ берет свое название от корней «иммуно», относящихся к антителам, используемым в процедуре, и «гисто», что означает ткань (сравните с иммуноцитохимией ). Альберт Кунс разработал концепцию и впервые применил эту процедуру в 1941 году. [2]

Визуализация взаимодействия антитело-антиген может быть достигнута несколькими способами, в основном одним из следующих:

Иммуногистохимическое окрашивание широко используется для диагностики аномальных клеток, например, обнаруженных в раковых опухолях. Специфические молекулярные маркеры характерны для определенных клеточных событий, таких как пролиферация или гибель клеток ( апоптоз ). [4] Иммуногистохимия также широко используется в фундаментальных исследованиях для понимания распределения и локализации биомаркеров и дифференциально экспрессируемых белков в различных частях биологической ткани.

Базовые приготовления

Подготовка образца имеет решающее значение для поддержания морфологии клеток, архитектуры тканей и антигенности целевых эпитопов . Это требует надлежащего сбора, фиксации и секционирования тканей . Для фиксации тканей часто используют раствор формалина , но можно использовать и другие методы.

Подготовка срезов ткани

Затем ткань можно нарезать на ломтики или использовать целиком, в зависимости от цели эксперимента или самой ткани. Перед разрезом образец ткани можно поместить в среду, например парафин или криосреду. Срезы можно нарезать на различных инструментах, включая ротационные микротомы и вибратомы от Precisionary Instruments и Leica Biosystems [5] [6] Образцы обычно нарезаются в диапазоне 3–5 мкм . [ нужна цитация ] Затем срезы помещают на предметные стекла, обезвоживают с помощью спиртовых промывок возрастающей концентрации (например, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) и очищают с помощью растворителя, такого как ксилол , перед тем, как их визуализируют под микроскоп.

В зависимости от метода фиксации и сохранения ткани образец может потребовать дополнительных шагов, чтобы сделать эпитопы доступными для связывания антител, включая депарафинизацию и извлечение антигена. Для тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин, часто необходимо извлечение антигена, которое включает предварительную обработку срезов теплом или протеазой . [1] [7] Эти шаги могут повлиять на окрашивание или отсутствие окрашивания целевых антигенов.

Уменьшение неспецифического иммуноокрашивания

В зависимости от типа ткани и метода обнаружения антигена перед окрашиванием антителами может потребоваться блокирование или подавление эндогенного биотина или ферментов соответственно. Хотя антитела проявляют предпочтительную авидность к специфическим эпитопам, они могут частично или слабо связываться с сайтами неспецифических белков (также называемыми реактивными сайтами), которые аналогичны родственным сайтам связывания на целевом антигене. Большое количество неспецифического связывания вызывает сильное фоновое окрашивание, которое маскирует обнаружение целевого антигена. Чтобы уменьшить фоновое окрашивание при ИГХ, ИКК и других методах иммуноокрашивания, образцы инкубируют с буфером, который блокирует реактивные сайты, с которыми в противном случае могут связываться первичные или вторичные антитела. Обычные блокирующие буферы включают нормальную сыворотку, обезжиренное сухое молоко, БСА или желатин. Для большей эффективности доступны коммерческие блокирующие буферы с запатентованными формулами. Методы устранения фонового окрашивания включают разбавление первичных или вторичных антител, изменение времени или температуры инкубации, а также использование другой системы обнаружения или другого первичного антитела. Контроль качества должен, как минимум, включать ткань, о которой известно, что она экспрессирует антиген, в качестве положительного контроля и отрицательный контроль ткани, о которой известно, что она не экспрессирует антиген, а также тестируемую ткань, зондируемую таким же способом с исключением первичного антитела (или лучше). , абсорбция первичного антитела). [1]

Образец маркировки

Типы антител

Антитела, используемые для специфического обнаружения, могут быть поликлональными или моноклональными . Поликлональные антитела получают путем инъекции животным интересующего белка или пептидного фрагмента и после стимуляции вторичного иммунного ответа выделения антител из цельной сыворотки. Таким образом, поликлональные антитела представляют собой гетерогенную смесь антител, распознающих несколько эпитопов . Моноклональные антитела производятся путем инъекции животному с последующим взятием определенного образца иммунной ткани, выделением родительской клетки и использованием полученной иммортализованной линии для создания антител. Это заставляет антитела проявлять специфичность к одному эпитопу. [8]

Для стратегий иммуногистохимического обнаружения антитела классифицируются как первичные или вторичные реагенты. Первичные антитела вырабатываются против представляющего интерес антигена и обычно являются неконъюгированными (немечеными), тогда как вторичные антитела вырабатываются против иммуноглобулинов первичных видов антител. Вторичное антитело обычно конъюгируется с линкерной молекулой, такой как биотин , которая затем рекрутирует репортерные молекулы, или само вторичное антитело напрямую связывается с репортерной молекулой. [3]

Репортеры IHC

Репортерные молекулы различаются в зависимости от характера метода обнаружения, наиболее популярными из которых являются хромогенное и флуоресцентное обнаружение, опосредованное ферментом или флуорофором соответственно. В случае хромогенных репортеров ферментная метка реагирует с субстратом с образованием интенсивно окрашенного продукта, который можно анализировать с помощью обычного светового микроскопа. Хотя список ферментных субстратов обширен, щелочная фосфатаза (AP) и пероксидаза хрена (HRP) являются двумя ферментами, наиболее широко используемыми в качестве меток для обнаружения белков. Для использования с любым ферментом доступен ряд хромогенных, флуорогенных и хемилюминесцентных субстратов, включая DAB или BCIP / NBT , которые дают коричневое или пурпурное окрашивание соответственно, где бы ни были связаны ферменты. Реакцию с DAB можно усилить, используя никель [ 9] , вызывающий темно-фиолетовое/черное окрашивание.

Флуоресцентные репортеры представляют собой небольшие органические молекулы, используемые для ИГХ-детектирования, и традиционно включают FITC , TRITC и AMCA, в то время как коммерческие производные, в том числе Alexa Fluors и Dylight Fluors, демонстрируют аналогичные улучшенные характеристики, но различаются по цене. Для хромогенных и флуоресцентных методов обнаружения денситометрический анализ сигнала может предоставить полу- и полностью количественные данные, соответственно, для корреляции уровня репортерного сигнала с уровнем экспрессии или локализации белка.

Хромогенная иммуногистохимия: клетка подвергается воздействию первичного антитела (красный), которое связывается со специфическим антигеном (фиолетовый квадрат). Первичное антитело связывает вторичное (зеленое) антитело, которое химически связано с ферментом (синий). Фермент изменяет цвет субстрата на более пигментированный (коричневая звезда).

Методы обнаружения целевого антигена

Прямой метод представляет собой одноэтапный метод окрашивания и включает в себя меченое антитело (например, FITC -конъюгированную антисыворотку ), которое непосредственно реагирует с антигеном в срезах ткани. Хотя в этом методе используется только одно антитело и поэтому он прост и быстр, чувствительность ниже из-за небольшого усиления сигнала, в отличие от непрямых подходов. [3] Однако эта стратегия используется реже, чем ее многофазный аналог.

Непрямой метод включает немеченое первичное антитело (первый слой), которое связывается с целевым антигеном в ткани, и меченое вторичное антитело (второй слой), которое реагирует с первичным антителом. Как упоминалось выше, вторичное антитело должно быть выработано против IgG того вида животных, у которого было выработано первичное антитело. Этот метод более чувствителен, чем стратегии прямого обнаружения, из-за усиления сигнала из-за связывания нескольких вторичных антител с каждым первичным антителом, если вторичное антитело конъюгировано с флуоресцентным или ферментным репортером. [3]

Дальнейшая амплификация может быть достигнута, если вторичное антитело конъюгировать с несколькими молекулами биотина , которые могут рекрутировать комплексы фермента, связанного с белком авидин , стрептавидин или нейтравидин . [3] Разница между этими тремя биотинсвязывающими белками заключается в их индивидуальной аффинности связывания с эндогенными тканевыми мишенями, что приводит к неспецифическому связыванию и высокому фону; Ранжирование этих белков на основе их сродства неспецифического связывания, от самого высокого до самого низкого, следующее: 1) авидин, 2) стрептавидин и 3) белок NeutrAvidin.

Непрямой метод, помимо его большей чувствительности, также имеет то преимущество, что необходимо получить лишь относительно небольшое количество стандартных конъюгированных (меченых) вторичных антител. Например, меченое вторичное антитело, полученное против IgG кролика, которое можно приобрести в готовом виде, полезно с любым первичным антителом, полученным у кролика. Это возможно, поскольку все кроличьи IgG в этом примере будут иметь одну и ту же (константную) область Fc, поэтому даже при небольшом количестве вырабатываемых антикроличьих вторичных антител каждое из них может прикрепляться к любому первичному кроличьему антителу. [3] Это особенно полезно, когда исследователь маркирует более одного первичного антитела, будь то в результате поликлональной селекции, производящей массив первичных антител к одному антигену, или когда есть интерес к множеству антигенов. При использовании прямого метода необходимо будет маркировать каждое первичное антитело для каждого интересующего антигена.

Контракрасители

После иммуногистохимического окрашивания целевого антигена часто применяется второе окрашивание для обеспечения контраста, который помогает выделить первичное окрашивание. Многие из этих красителей демонстрируют специфичность для определенных классов биомолекул, тогда как другие окрашивают всю клетку. [3] Для ИГХ доступны как хромогенные, так и флуоресцентные красители, что обеспечивает широкий спектр реагентов для любого экспериментального плана, включая: гематоксилин , краситель Хехста и DAPI .

Поиск неисправностей

В иммуногистохимических методах перед окончательным окрашиванием тканевого антигена необходимо пройти несколько этапов, что может вызвать множество проблем, включая сильное фоновое окрашивание, слабое окрашивание целевого антигена и аутофлуоресценцию . Эндогенный биотин или репортерные ферменты, а также перекрестная реактивность первичных/вторичных антител являются частыми причинами сильного фонового окрашивания, тогда как слабое окрашивание может быть вызвано плохой активностью фермента или активностью первичных антител. Кроме того, автофлуоресценция может быть обусловлена ​​природой ткани или методом фиксации. Эти аспекты подготовки тканей к ИГХ и окрашивания антителами необходимо систематически решать, чтобы выявить и устранить проблемы с окрашиванием. [10]

Диагностические маркеры ИГХ

Хромогенная иммуногистохимия нормальной почки , направленная на белок CD10 .

ИГХ является превосходным методом обнаружения и имеет огромное преимущество, поскольку позволяет точно показать, где именно находится тот или иной белок в исследуемой ткани. Это также эффективный способ исследования тканей. Это сделало этот метод широко используемым в нейробиологии , позволяя исследователям изучать экспрессию белков в определенных структурах мозга. Его основным недостатком является то, что, в отличие от методов иммуноблоттинга , при которых окрашивание проверяется по шкале молекулярной массы , с помощью ИГХ невозможно показать, что окрашивание соответствует интересующему белку. По этой причине первичные антитела должны быть тщательно проверены с помощью вестерн-блоттинга или аналогичной процедуры. Этот метод еще более широко используется в диагностике хирургической патологии при иммунофенотипировании опухолей (например, иммуноокрашивание на e-кадгерин для дифференциации DCIS (протоковая карцинома in situ: окрашивание положительное) и LCIS (дольковая карцинома in situ: не окрашивание положительное) [11] ). Совсем недавно иммуногистохимические методы стали полезны в дифференциальной диагностике множественных форм карцином слюнных желез, головы и шеи. [12]

Разнообразие ИГХ-маркеров, используемых в диагностике хирургической патологии, весьма велико. Многие клинические лаборатории в больницах третичного уровня будут иметь меню из более чем 200 антител, используемых в качестве диагностических, прогностических и прогностических биомаркеров. Примеры некоторых часто используемых маркеров включают в себя:

Окрашивание PIN-4 доброкачественной железы (слева) и аденокарциномы простаты (справа) с использованием коктейля PIN-4. В аденокарциноме отсутствуют базальные эпителиальные клетки (окрашенные в темно-коричневый цвет р63 , СК-5 и СК-14 ). Кроме того, в образцах, окрашенных PIN-4, клетки аденокарциномы обычно имеют красную цитоплазму (окрашенную AMACR ).

Направление терапии

При раке изменяются различные молекулярные пути, и на некоторые изменения можно воздействовать при терапии рака. Иммуногистохимия может использоваться для оценки того, какие опухоли могут реагировать на терапию, путем обнаружения присутствия или повышенных уровней молекулярной мишени.

Химические ингибиторы

Биология опухолей допускает наличие ряда потенциальных внутриклеточных мишеней. Многие опухоли гормонозависимы. Наличие рецепторов гормонов можно использовать для определения потенциальной реакции опухоли на антигормональную терапию. Одним из первых методов лечения был антиэстроген тамоксифен , используемый для лечения рака молочной железы. Такие гормональные рецепторы можно обнаружить с помощью иммуногистохимии. [15] Иматиниб , внутриклеточный ингибитор тирозинкиназы , был разработан для лечения хронического миелогенного лейкоза , заболевания, характеризующегося образованием специфической аномальной тирозинкиназы. Имитаниб доказал свою эффективность при опухолях, которые экспрессируют другие тирозинкиназы, особенно KIT. Большинство желудочно-кишечных стромальных опухолей экспрессируют KIT, что можно обнаружить с помощью иммуногистохимии. [16]

Моноклональные антитела

Многие белки, активность которых в патологических состояниях сильно активируется с помощью иммуногистохимии, являются потенциальными мишенями для терапии с использованием моноклональных антител . Моноклональные антитела из-за своего размера используются против мишеней на клеточной поверхности. Среди сверхэкспрессируемых мишеней являются члены семейства EGFR , трансмембранные белки с внеклеточным рецепторным доменом, регулирующим внутриклеточную тирозинкиназу. [17] Из них первым был разработан HER2/neu (также известный как Erb-B2). Молекула высоко экспрессируется в различных типах раковых клеток, особенно в раке молочной железы. Таким образом, антитела против HER2/neu были одобрены FDA для клинического лечения рака под названием Герцептин . Существуют коммерчески доступные иммуногистохимические тесты Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle [18] и Ventana Pathway. [19]

Аналогичным образом, EGFR (HER-1) сверхэкспрессируется при различных видах рака, включая рак головы, шеи и толстой кишки. Иммуногистохимия используется для определения пациентов, которым могут помочь терапевтические антитела, такие как эрбитукс (цетуксимаб). [20] Коммерческие системы для обнаружения EGFR методом иммуногистохимии включают Dako pharmDx.

Картирование экспрессии белка

Иммуногистохимию также можно использовать для более общего профиля белков при условии наличия антител, проверенных для иммуногистохимии. Атлас белков человека отображает карту экспрессии белков в нормальных органах и тканях человека. Комбинация иммуногистохимии и тканевых микрочипов позволяет выявить закономерности экспрессии белков в большом количестве различных типов тканей. Иммуногистохимия также используется для определения профиля белка при наиболее распространенных формах рака человека. [21] [22]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ abc Рамос-Вара Дж.А., Миллер М.А. (январь 2014 г.). «Когда тканевые антигены и антитела уживаются друг с другом: пересмотр технических аспектов иммуногистохимии - красного, коричневого и синего метода». Ветеринарная патология . 51 (1): 42–87. дои : 10.1177/0300985813505879 . ПМИД  24129895.
  2. ^ Кунс А.Х., Крич Х.Дж., Джонс Р.Н.: Иммунологические свойства антитела, содержащего флуоресцентную группу. Proc Soc Exp Biol Med, 1941 г.; 47: 200-202.
  3. ^ abcdefg Рамос-Вара JA (июль 2005 г.). «Технические аспекты иммуногистохимии». Ветеринарная патология . 42 (4): 405–426. дои : 10.1354/vp.42-4-405. PMID  16006601. S2CID  6229029.
  4. ^ Уайтсайд Г., Мунглани Р. (сентябрь 1998 г.). «TUNEL, Hoechst и тройная маркировка иммуногистохимии: улучшенный метод обнаружения апоптоза в срезах тканей - обновление». Исследования мозга. Протоколы исследования мозга . 3 (1): 52–53. дои : 10.1016/s1385-299x(98)00020-8. ПМИД  9767106.
  5. ^ "Вибратом Leica VT1000S" . 4 марта 2022 г.
  6. ^ «Новинка: точные инструменты Compresstome VF-300-OZ » Ядро молекулярной патологии » Медицинский колледж » Университет Флориды» .
  7. ^ АбД Серотек. «Совет 1 IHC: Извлечение антигена - следует ли мне делать PIER или HIER?». АбД Серотек . Архивировано из оригинала 23 апреля 2016 г. Проверено 26 мая 2015 г.
  8. ^ Поханка М (сентябрь 2009 г.). «Производство моноклональных и поликлональных антител – получение мощного элемента биораспознавания». Журнал прикладной биомедицины . 7 (3): 115–121. дои : 10.32725/jab.2009.012 .
  9. ^ Ковентри Б.Дж., Брэдли Дж., Скиннер Дж.М. (июль 1995 г.). «Различия между стандартной и высокочувствительной иммуногистологией срезов тканей - сравнение методов окрашивания иммунопероксидазой с использованием компьютерных методов анализа видеоизображений». Патология . 27 (3): 221–223. дои : 10.1080/00313029500169013. PMID  8532386. S2CID  32020542.
  10. ^ Торлакович Э.Э., Чунг CC, Д'Арриго С., Дитель М., Фрэнсис Г.Д., Гилкс CB и др. (февраль 2017 г.). «Эволюция обеспечения качества клинической иммуногистохимии в эпоху точной медицины - Часть 2: Рабочие характеристики иммуногистохимических тестов». Прикладная иммуногистохимия и молекулярная морфология . 25 (2): 79–85. дои : 10.1097/PAI.0000000000000444. hdl : 2066/173083 . PMID  28182587. S2CID  3828962.
  11. ^ О'Мэлли Ф., Пиндер С. (2006). Патология молочной железы (Первое изд.). Эдинбург: Черчилль Ливингстон/Эльзевир. ISBN 978-0-443-06680-1.
  12. ^ Чжу С., Шуерх С., Хант Дж. (январь 2015 г.). «Обзор и обновления иммуногистохимии при избранных опухолях слюнных желез и головы и шеи». Архивы патологии и лабораторной медицины . 139 (1): 55–66. дои : 10.5858/arpa.2014-0167-RA . ПМИД  25549144.
  13. ^ Топин П. (январь 2007 г.). «Имногистохимия BrdU для изучения нейрогенеза у взрослых: парадигмы, ловушки, ограничения и проверка». Обзоры исследований мозга . 53 (1): 198–214. doi :10.1016/j.brainresrev.2006.08.002. PMID  17020783. S2CID  23557588.
  14. ^ Лидер М., Патель Дж., Макин С., Генри К. (декабрь 1986 г.). «Анализ чувствительности и специфичности цитокератинового маркера САМ 5.2 для эпителиальных опухолей. Результаты исследования 203 сарком, 50 карцином и 28 злокачественных меланом». Гистопатология . 10 (12): 1315–1324. doi :10.1111/j.1365-2559.1986.tb02574.x. PMID  2434403. S2CID  28142859.
  15. ^ Йоргенсен Дж.Т., Нильсен К.В., Эйлертсен Б. (апрель 2007 г.). «Фармакодиагностика и таргетная терапия – рациональный подход к индивидуализации медикаментозной противораковой терапии при раке молочной железы». Онколог . 12 (4): 397–405. doi : 10.1634/теонколог.12-4-397 . PMID  17470682. S2CID  19065186.
  16. ^ Gold JS, Dematteo RP (август 2006 г.). «Комбинированная хирургическая и молекулярная терапия: модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта». Анналы хирургии . 244 (2): 176–184. doi :10.1097/01.sla.0000218080.94145.cf. ПМК 1602162 . ПМИД  16858179. 
  17. ^ Харари PM (декабрь 2004 г.). «Стратегии ингибирования рецепторов эпидермального фактора роста в онкологии». Эндокринный рак . 11 (4): 689–708. дои : 10.1677/erc.1.00600 . ПМИД  15613446.
  18. ^ "leicabiosystems.com". leicabiosystems.com . Проверено 16 июня 2013 г.
  19. ^ Press MF, Sauter G, Bernstein L, Villalobos IE, Mirlacher M, Zhou JY и др. (сентябрь 2005 г.). «Диагностическая оценка HER-2 как молекулярной мишени: оценка точности и воспроизводимости лабораторных исследований в крупных проспективных рандомизированных клинических исследованиях». Клинические исследования рака . 11 (18): 6598–6607. дои : 10.1158/1078-0432.CCR-05-0636 . ПМИД  16166438.
  20. ^ Бибо Ф., Буасьер-Мишо Ф., Сабурен Ж.К., Гургу-Бургад С., Радаль М., Пено-Льорка Ф. и др. (сентябрь 2006 г.). «Оценка экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) при первичных колоректальных карциномах и связанных с ними метастазах на срезах тканей и тканевых микрочипах». Архив Вирхова . 449 (3): 281–287. дои : 10.1007/s00428-006-0247-9. ПМЦ 1888717 . ПМИД  16865406. 
  21. ^ "Атлас человеческого белка". www.proteinatlas.org . Проверено 2 октября 2017 г.
  22. ^ Улен М., Фагерберг Л., Халльстрём Б.М., Линдског С., Оксволд П., Мардиноглу А. и др. (январь 2015 г.). «Протеомика. Тканевая карта протеома человека». Наука . 347 (6220): 1260419. doi :10.1126/science.1260419. PMID  25613900. S2CID  802377.

дальнейшее чтение

Внешние ссылки

Викискладе есть медиафайлы, связанные с иммуногистохимией .