Бактериологический анализ воды — это метод анализа воды для оценки количества присутствующих бактерий и, при необходимости, определения типа бактерий. Он представляет собой один из аспектов качества воды . Это микробиологическая аналитическая процедура, которая использует образцы воды и из этих образцов определяет концентрацию бактерий. Затем можно сделать выводы о пригодности воды для использования на основе этих концентраций. Этот процесс используется, например, для регулярного подтверждения того, что вода безопасна для потребления человеком или что вода для купания и отдыха безопасна для использования.
Интерпретация и уровни срабатывания для разных вод различаются в зависимости от использования воды. В то время как очень строгие уровни применяются к питьевой воде , более мягкие уровни применяются к морским водам для купания, где ожидается, что пользователи будут потреблять гораздо меньшие объемы воды.
Общей чертой всех этих стандартных процедур скрининга является то, что первичный анализ проводится для индикаторных организмов, а не для патогенов , которые могут вызывать беспокойство. Индикаторными организмами являются бактерии, такие как неспецифические колиформы , Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa , которые очень часто встречаются в кишечнике человека или животных и которые, если их обнаружить, могут указывать на присутствие сточных вод . Индикаторные организмы используются, потому что даже если человек инфицирован более патогенными бактериями, он все равно будет выделять во много миллионов раз больше индикаторных организмов, чем патогенов. Поэтому разумно предположить, что если уровни индикаторных организмов низкие, то уровни патогенов будут намного ниже или отсутствовать. Суждения о пригодности воды для использования основаны на очень обширных прецедентах и связаны с вероятностью того, что любая выборочная популяция бактерий может быть инфекционной на разумном статистическом уровне достоверности. [ необходима цитата ]
Анализ обычно выполняется с использованием методов культивирования , биохимических и иногда оптических методов. Когда уровни индикаторных организмов превышают заданные триггеры, может быть проведен специальный анализ на патогены, и они могут быть быстро обнаружены (при подозрении) с использованием специальных методов культивирования или молекулярной биологии . [1]
Наиболее надежными методами являются метод прямого подсчета на пластине и метод мембранной фильтрации. Агар mEndo используется при мембранной фильтрации, а агар VRBA используется при методе прямого подсчета на пластине. VRBA означает фиолетово-красный желчный агар. Среда, содержащая желчные соли, которая способствует росту грамотрицательных бактерий и обладает ингибирующими свойствами по отношению к грамположительным, хотя и не полностью ингибирует. [ необходима ссылка ]
Эти среды содержат лактозу, которая обычно ферментируется бактериями, ферментирующими лактозу, производящими колонии, которые можно идентифицировать и охарактеризовать. Ферментирующие лактозу бактерии производят цветные колонии, в то время как неферментирующие лактозу бактерии производят бесцветные колонии. Поскольку анализ всегда основан на очень маленьком образце, взятом из очень большого объема воды, все методы основаны на статистических принципах. [2]
Один из старейших методов называется методом множественных пробирок. [3] В этом методе измеренный подобразец (возможно, 10 мл) разбавляется 100 мл стерильной питательной среды, а затем аликвота объемом 10 мл переливается в каждую из десяти пробирок. Оставшиеся 10 мл затем разбавляются снова, и процесс повторяется. В конце 5 разведений получается 50 пробирок, охватывающих диапазон разбавления от 1:10 до 1:10000. [ необходима цитата ]
Затем пробирки инкубируют при заданной температуре в течение определенного времени, и в конце процесса подсчитывают количество пробирок с ростом для каждого разбавления. Затем статистические таблицы используются для выведения концентрации организмов в исходном образце. Этот метод можно улучшить, используя индикаторную среду, которая меняет цвет при наличии кислотообразующих видов, и включив в каждую пробирку с образцом крошечную перевернутую пробирку, называемую пробиркой Дарема . Перевернутая пробирка Дарема улавливает любой выделяемый газ. Выделение газа при 37 градусах Цельсия является убедительным признаком присутствия Escherichia coli . [ необходима цитата ]
Тест АТФ — это процесс быстрого измерения активных микроорганизмов в воде посредством обнаружения аденозинтрифосфата (АТФ). АТФ — это молекула, обнаруженная только внутри и вокруг живых клеток, и как таковая она дает прямую меру биологической концентрации и здоровья. АТФ количественно определяется путем измерения света, произведенного в результате его реакции с естественным ферментом люциферазой светлячков , с помощью люминометра . Количество произведенного света прямо пропорционально количеству биологической энергии, присутствующей в образце. [ необходима цитата ]
Тесты АТФ второго поколения специально разработаны для анализа воды, сточных вод и промышленных применений, где, по большей части, образцы содержат различные компоненты, которые могут помешать анализу АТФ.
Метод подсчета чашек основан на выращивании колоний бактерий на питательной среде, так что колония становится видимой невооруженным глазом, и можно подсчитать количество колоний на чашке. Для эффективности разбавление исходного образца должно быть организовано таким образом, чтобы в среднем выращивалось от 30 до 300 колоний целевой бактерии. Менее 30 колоний делают интерпретацию статистически необоснованной, в то время как более 300 колоний часто приводят к перекрывающимся колониям и неточности подсчета. Чтобы гарантировать, что будет получено соответствующее количество колоний, обычно культивируют несколько разведений. Этот подход широко используется для оценки эффективности очистки воды путем инактивации репрезентативных микробных загрязнителей, таких как E. coli, в соответствии с ASTM D5465. [4] [5]
Лабораторная процедура включает в себя серийные разведения образца (1:10, 1:100, 1:1000 и т. д.) в стерильной воде и выращивание их на питательном агаре в чашке, которая герметично закрывается и инкубируется. Типичные среды включают агар для подсчета чашек для общего подсчета или агар Макконки для подсчета грамотрицательных бактерий, таких как E. coli . Обычно один набор чашек инкубируют при 22 °C в течение 24 часов, а второй набор при 37 °C в течение 24 часов. В состав питательного вещества обычно входят реагенты , которые препятствуют росту нецелевых организмов и позволяют легко идентифицировать целевой организм, часто по изменению цвета в среде. Некоторые современные методы включают флуоресцентный агент, чтобы подсчет колоний можно было автоматизировать. В конце периода инкубации колонии подсчитываются на глаз, процедура, которая занимает несколько минут и не требует микроскопа, поскольку колонии обычно имеют размер в несколько миллиметров. [ необходима цитата ]
Большинство современных лабораторий используют уточнение общего количества колоний на пластине, при котором серийные разведения образца фильтруются вакуумом через специально изготовленные мембранные фильтры , а сами фильтры помещаются на питательную среду в герметичных пластинах. [6] В остальном методология похожа на обычный общий подсчет колоний на пластине. Мембраны имеют напечатанную миллиметровую сетку и могут надежно использоваться для подсчета числа колоний под бинокулярным микроскопом. [ требуется ссылка ]
Когда анализ ищет виды бактерий, которые плохо растут на воздухе, первоначальный анализ выполняется путем смешивания серийных разведений образца в жидком питательном агаре, который затем разливается в бутылки, которые затем герметично закрываются и кладутся на бок, чтобы получить наклонную поверхность агара. Колонии, которые развиваются в теле среды, можно подсчитать на глаз после инкубации. [ необходима цитата ]
Общее число колоний называется общим жизнеспособным числом (TVC). Единицей измерения является КОЕ/мл (или колониеобразующие единицы на миллилитр), и она относится к исходному образцу. Расчет этого числа представляет собой кратное подсчитанному числу колоний, умноженному на используемое разбавление. [ необходима цитата ]
Когда образцы показывают повышенный уровень индикаторных бактерий, часто проводится дополнительный анализ для поиска конкретных патогенных бактерий. Виды, обычно исследуемые в умеренной зоне, включают Salmonella typhi и Salmonella Typhimurium . В зависимости от вероятного источника заражения исследование может также распространяться на такие организмы, как Cryptosporidium spp . В тропических районах также регулярно проводится анализ Vibrio cholerae . [ необходима цитата ]
Агар Макконки — это питательная среда, предназначенная для выращивания грамотрицательных бактерий и их окрашивания для ферментации лактозы. Она содержит соли желчных кислот (для подавления большинства грамположительных бактерий), краситель кристаллический фиолетовый (который также подавляет некоторые грамположительные бактерии), нейтральный красный краситель (который окрашивает микробы, ферментирующие лактозу), лактозу и пептон . Альфред Теодор Макконки разработал ее, работая бактериологом в Королевской комиссии по утилизации сточных вод в Соединенном Королевстве .
Агар Эндо содержит пептон, лактозу, дикалийфосфат , агар, сульфит натрия, основной фуксин и изначально был разработан для выделения Salmonella typhi , но теперь широко используется в анализе воды. Как и в агаре Макконки, колиформные организмы ферментируют лактозу, и колонии становятся красными. Неферментирующие лактозу организмы образуют прозрачные бесцветные колонии на бледно-розовом фоне среды. [7]
Среда mFC используется в мембранной фильтрации и содержит селективные и дифференциальные агенты. К ним относятся розолиевая кислота для подавления роста бактерий в целом, за исключением фекальных колиформ , желчные соли подавляют неэнтеральные бактерии, а анилиновый синий указывает на способность фекальных колиформ ферментировать лактозу до кислоты, что вызывает изменение pH в среде. [8]
Среда TYEA содержит триптон , дрожжевой экстракт , поваренную соль и L-арабинозу на литр дистиллированной воды и является неселективной средой, которую обычно культивируют при двух температурах (22 и 36 °C) для определения общего уровня загрязнения (т. е. количества колоний).
