stringtranslate.com

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ОТ-ПЦР

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — это лабораторный метод, объединяющий обратную транскрипцию РНК в ДНК ( в данном контексте называемую комплементарной ДНК или кДНК) и амплификацию определенных ДНК-мишеней с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). [1] Он в основном используется для измерения количества определенной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с использованием флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (кПЦР). Может возникнуть путаница, поскольку некоторые авторы используют аббревиатуру ОТ-ПЦР для обозначения ПЦР в реальном времени. В этой статье ОТ-ПЦР будет обозначать ПЦР с обратной транскрипцией. Комбинированная ОТ-ПЦР и кПЦР обычно используются для анализа экспрессии генов и количественной оценки вирусной РНК в исследовательских и клинических условиях.

Тесная связь между ОТ-ПЦР и qPCR привела к метонимическому использованию термина qPCR для обозначения ОТ-ПЦР. Такое использование может сбивать с толку, [2] поскольку ОТ-ПЦР может использоваться без qPCR, например, для молекулярного клонирования , секвенирования или простого обнаружения РНК. И наоборот, qPCR может использоваться без ОТ-ПЦР, например, для количественной оценки числа копий определенного фрагмента ДНК.

Номенклатура

Комбинированная техника ОТ-ПЦР и КПЦР была описана как количественная ОТ-ПЦР [3] или ОТ-ПЦР в реальном времени [4] (иногда ее даже называют количественной ОТ-ПЦР в реальном времени [5] ), ее по-разному сокращали как КПЦР, [6] ОТ-кПЦР, [7] РРТ-ПЦР, [8] и рРТ-ПЦР. [9] Во избежание путаницы в этой статье будут последовательно использоваться следующие сокращения:

Не все авторы, особенно более ранние, используют это соглашение, и читателю следует быть осторожным при переходе по ссылкам. RT-PCR используется для обозначения как ПЦР в реальном времени (qPCR), так и ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

История

С момента своего появления в 1977 году, нозерн-блоттинг широко использовался для количественной оценки РНК, несмотря на свои недостатки: (a) трудоемкий метод, (b) требует большого количества РНК для обнаружения и (c) количественно неточен при низком содержании РНК. [10] [11] Однако с тех пор, как в 1983 году Кэри Маллис изобрел ПЦР , ОТ-ПЦР вытеснил нозерн-блоттинг в качестве метода выбора для обнаружения и количественной оценки РНК. [12]

ОТ-ПЦР превратилась в эталонную технологию для обнаружения и/или сравнения уровней РНК по нескольким причинам: (a) она не требует пост-ПЦР-обработки, (b) может быть измерен широкий диапазон (>10 7 -кратного) распространенности РНК, и (c) она обеспечивает понимание как качественных, так и количественных данных. [5] Благодаря своей простоте, специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР используется в широком спектре приложений: от таких простых экспериментов, как количественное определение дрожжевых клеток в вине, до более сложных применений в качестве диагностических инструментов для обнаружения инфекционных агентов, таких как вирус птичьего гриппа и SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]

Принципы

В ОТ-ПЦР шаблон РНК сначала преобразуется в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы (ОТ). Затем кДНК используется в качестве шаблона для экспоненциальной амплификации с использованием ПЦР. Использование ОТ-ПЦР для обнаружения транскрипта РНК произвело революцию в изучении экспрессии генов в следующих важных направлениях:

Одноэтапная ОТ-ПЦР против двухэтапной ОТ-ПЦР

Одноэтапная и двухэтапная ОТ-ПЦР

Количественное определение мРНК с помощью ОТ-ПЦР может быть достигнуто как одноэтапная или двухэтапная реакция. Разница между двумя подходами заключается в количестве пробирок, используемых при выполнении процедуры. Двухэтапная реакция требует, чтобы реакция обратной транскриптазы и ПЦР-амплификация проводились в отдельных пробирках. Недостатком двухэтапного подхода является подверженность загрязнению из-за более частой обработки образцов. [19] С другой стороны, вся реакция от синтеза кДНК до ПЦР-амплификации происходит в одной пробирке при одноэтапном подходе. Считается, что одноэтапный подход минимизирует экспериментальную вариацию, поскольку все ферментативные реакции находятся в одной среде. Он устраняет этапы пипетирования продукта кДНК, что является трудоемким и подверженным загрязнению, для реакции ПЦР. Дальнейшее использование устойчивых к ингибиторам термостабильных ДНК-полимераз , усилителей полимеразы с оптимизированным одношаговым условием ОТ-ПЦР, поддерживает обратную транскрипцию РНК из неочищенных или сырых образцов, таких как цельная кровь и сыворотка . [20] [21] Однако исходные шаблоны РНК склонны к деградации при одношаговом подходе, и использование этого подхода не рекомендуется, когда требуются повторные анализы из того же образца. Кроме того, сообщается, что одношаговый подход менее точен по сравнению с двухшаговым подходом. Это также предпочтительный метод анализа при использовании связывающих ДНК красителей, таких как SYBR Green , поскольку устранение димеров праймеров может быть достигнуто путем простого изменения температуры плавления . Тем не менее, одношаговый подход является относительно удобным решением для быстрого обнаружения целевой РНК непосредственно в биосенсоре. [ необходима цитата ]

ОТ-ПЦР по конечной точке против ОТ-ПЦР в реальном времени

Количественную оценку продуктов ОТ-ПЦР можно в основном разделить на две категории: конечная точка и реальное время. [22] Использование конечной точки ОТ-ПЦР является предпочтительным для измерения изменений экспрессии генов в небольшом количестве образцов, но ОТ-ПЦР в реальном времени стала золотым стандартом для проверки количественных результатов, полученных с помощью анализа массивов или изменений экспрессии генов в глобальном масштабе. [23]

ОТ-ПЦР по конечной точке

Подходы к измерению конечной точки ОТ-ПЦР требуют обнаружения уровней экспрессии генов с помощью флуоресцентных красителей, таких как бромистый этидий , [24] [25] маркировки P32 продуктов ПЦР с использованием фосфоримиджера , [26] или с помощью сцинтилляционного подсчета . [18] Конечная точка ОТ-ПЦР обычно достигается с помощью трех различных методов: относительного, конкурентного и сравнительного. [27] [28]

Относительная ОТ-ПЦР
Относительные количественные оценки ОТ-ПЦР включают совместную амплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации можно провести прямое сравнение относительного содержания транскриптов в нескольких образцах мРНК. Следует отметить одну меру предосторожности: внутренний контроль должен быть выбран таким образом, чтобы на него не влияла экспериментальная обработка. Уровень экспрессии должен быть постоянным во всех образцах и с интересующей мРНК, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона амплификации мишени и контроля, крайне важно учитывать начальную концентрацию молекул-мишеней и скорость их амплификации до начала анализа. Результаты анализа выражаются в виде отношений сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, значения которых затем можно использовать для сравнения образцов при оценке относительной экспрессии целевой РНК. [25] [28] [29]
Конкурентная ОТ-ПЦР
Конкурентная ОТ-ПЦР-техника используется для абсолютной количественной оценки. Она включает использование синтетической «конкурирующей» РНК, которая может быть отличена от целевой РНК небольшой разницей в размере или последовательности. Важно, чтобы дизайн синтетической РНК был идентичн по последовательности, но немного короче целевой РНК для получения точных результатов. После проектирования и синтеза известное количество конкурентной РНК добавляется к экспериментальным образцам и ко-амплифицируется с целью с помощью ОТ-ПЦР. Затем создается концентрационная кривая конкурентной РНК, и она используется для сравнения сигналов ОТ-ПЦР, полученных от эндогенных транскриптов, чтобы определить количество цели, присутствующей в образце. [28] [30]
Сравнительная ОТ-ПЦР
Сравнительная ОТ-ПЦР похожа на конкурентную ОТ-ПЦР в том, что целевая РНК конкурирует за реагенты амплификации в рамках одной реакции с внутренним стандартом неродственной последовательности. После завершения реакции результаты сравниваются с внешней стандартной кривой для определения концентрации целевой РНК. По сравнению с относительными и конкурентными методами количественной оценки сравнительная ОТ-ПЦР считается более удобным в использовании методом, поскольку она не требует от исследователя проведения пилотного эксперимента; в относительной ОТ-ПЦР должен быть заранее определен экспоненциальный диапазон амплификации мРНК, а в конкурентной ОТ-ПЦР должна быть синтезирована синтетическая конкурентная РНК. [28] [31] [32] [33] [34]

ОТ-ПЦР в реальном времени

Появление новых методов флуоресцентной маркировки ДНК за последние несколько лет позволило проводить анализ и обнаружение продуктов ПЦР в режиме реального времени и, следовательно, привело к широкому принятию ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов. [35] ОТ-ПЦР в реальном времени теперь является не только методом выбора для количественной оценки экспрессии генов, но и предпочтительным методом получения результатов анализов массивов и экспрессий генов в глобальном масштабе. [36] В настоящее время существует четыре различных флуоресцентных ДНК- зонда для обнаружения продуктов ПЦР с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени: SYBR Green , TaqMan , молекулярные маяки и зонды-скорпионы. Все эти зонды позволяют обнаруживать продукты ПЦР, генерируя флуоресцентный сигнал. В то время как краситель SYBR Green испускает свой флуоресцентный сигнал, просто связываясь с двухцепочечной ДНК в растворе, генерация флуоресценции зондами TaqMan, молекулярными маяками и скорпионами зависит от связи молекулы красителя и гасящего фрагмента с олигонуклеотидными субстратами с помощью резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) . [37]

SYBR зеленый
Когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, он будет излучать свет при возбуждении. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, поскольку разработка зондов не требуется из-за отсутствия специфичности его связывания. Однако, поскольку краситель не различает двухцепочечную ДНК от продуктов ПЦР и от праймер-димеров, переоценка целевой концентрации является распространенной проблемой. Там, где точная количественная оценка является абсолютной необходимостью, необходимо провести дополнительный анализ для проверки результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании. [22] [23]
зонды Taqman
Зонды TaqMan
Зонды TaqMan представляют собой олигонуклеотиды, которые имеют флуоресцентный зонд, прикрепленный к 5'-концу, и гаситель к 3'-концу. Во время ПЦР-амплификации эти зонды будут гибридизоваться с целевыми последовательностями, расположенными в ампликоне , и поскольку полимераза реплицирует шаблон со связанным TaqMan, она также расщепляет флуоресцентный зонд из-за активности полимеразы 5'-нуклеазы. Поскольку близкое расположение молекулы гасителя и флуоресцентного зонда обычно предотвращает обнаружение флуоресценции через FRET, расцепление приводит к увеличению интенсивности флуоресценции пропорционально количеству циклов расщепления зонда. Хотя хорошо спроектированные зонды TaqMan дают точные результаты ОТ-ПЦР в реальном времени, их синтез является дорогостоящим и трудоемким, поскольку для каждой анализируемой мишени мРНК необходимо изготавливать отдельные зонды. [22] [16] [38] Кроме того, эти зонды чувствительны к свету и должны быть тщательно заморожены в виде аликвот, чтобы предотвратить деградацию.
Молекулярные маяковые зонды
Подобно зондам TaqMan, молекулярные маяки также используют обнаружение FRET с флуоресцентными зондами, прикрепленными к 5'-концу, и гасителем, прикрепленным к 3'-концу олигонуклеотидного субстрата. Однако, в то время как флуоресцентные зонды TaqMan расщепляются во время амплификации, зонды молекулярных маяков остаются нетронутыми и повторно связываются с новой целью во время каждого цикла реакции. Когда они свободны в растворе, близкое расположение флуоресцентного зонда и молекулы гасителя предотвращает флуоресценцию через FRET. Однако, когда зонды молекулярных маяков гибридизуются с целью, флуоресцентный краситель и гаситель разделяются, что приводит к излучению света при возбуждении. Как и в случае с зондами TaqMan, молекулярные маяки дороги в синтезе и требуют отдельных зондов для каждой РНК-мишени. [19]
Зонды Скорпиона
Зонды скорпионов, как и молекулярные маяки, не будут флуоресцентно активными в негибридизованном состоянии, опять же, из-за того, что флуоресцентный зонд на 5'-конце гасится фрагментом на 3'-конце олигонуклеотида. Однако в случае со скорпионами 3'-конец также содержит последовательность, которая комплементарна продукту расширения праймера на 5'-конце. Когда расширение скорпиона связывается со своим комплементом на ампликоне, структура скорпиона открывается, предотвращает FRET и позволяет измерять флуоресцентный сигнал. [39]
Мультиплексные зонды
Зонды TaqMan, молекулярные маяки и скорпионы позволяют проводить одновременное измерение продуктов ПЦР в одной пробирке. Это возможно, поскольку каждый из различных флуоресцентных красителей может быть связан с определенным спектром излучения. Использование мультиплексных зондов не только экономит время и усилия без ущерба для полезности теста, его применение в широких областях исследований, таких как анализ делеции генов, анализ мутаций и полиморфизма, количественный анализ и обнаружение РНК, делает его бесценным методом для лабораторий многих дисциплин. [39] [40] [41]

Для количественной оценки результатов, полученных с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, обычно используются две стратегии: метод стандартной кривой и метод сравнительного порога. [42]

Приложение

Экспоненциальная амплификация посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией обеспечивает высокочувствительную методику, при которой можно обнаружить очень низкое число копий молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется в диагностике генетических заболеваний и, полуколичественно, в определении распространенности специфических различных молекул РНК в клетке или ткани в качестве меры экспрессии генов .

Методы исследования

ОТ-ПЦР обычно используется в исследовательских методах для измерения экспрессии генов. Например, Лин и др. использовали ОТ-ПЦР для измерения экспрессии генов Gal в клетках дрожжей. Сначала Лин и др. спроектировали мутацию белка, предположительно участвующего в регуляции генов Gal. Была выдвинута гипотеза, что эта мутация избирательно отменяет экспрессию Gal. Чтобы подтвердить это, уровни экспрессии генов дрожжевых клеток, содержащих эту мутацию, были проанализированы с помощью ОТ-ПЦР. Исследователи смогли окончательно определить, что мутация этого регуляторного белка снизила экспрессию Gal. [43] Анализ методом нозерн-блоттинга используется для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК.

Вставка гена

ОТ-ПЦР также может быть очень полезна при вставке эукариотических генов в прокариот . Поскольку большинство эукариотических генов содержат интроны , которые присутствуют в геноме, но не в зрелой мРНК, кДНК, полученная в результате реакции ОТ-ПЦР, является точной (без учета подверженной ошибкам природы обратных транскриптаз) последовательностью ДНК, которая будет напрямую транслироваться в белок после транскрипции . Когда эти гены экспрессируются в прокариотических клетках с целью производства или очистки белка, РНК, полученная непосредственно в результате транскрипции, не должна подвергаться сплайсингу, поскольку транскрипт содержит только экзоны . (У прокариот, таких как E. coli, отсутствует механизм сплайсинга мРНК эукариот).

Диагностика генетических заболеваний

ОТ-ПЦР может использоваться для диагностики генетических заболеваний, таких как синдром Леша-Нихана . Это генетическое заболевание вызвано сбоем в гене HPRT1 , что клинически приводит к фатальному образованию мочевых камней из мочевой кислоты и симптомам, похожим на подагру . [6] [ необходимо уточнение ] Анализ беременной матери и плода на уровни экспрессии мРНК HPRT1 покажет, является ли мать носителем и есть ли вероятность развития синдрома Леша-Нихана у плода. [44]

Обнаружение рака

Ученые работают над способами использования ОТ-ПЦР в диагностике рака , чтобы улучшить прогноз и контролировать реакцию на терапию. Циркулирующие опухолевые клетки производят уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака. Цель состоит в том, чтобы определить, какие транскрипты мРНК служат лучшими биомаркерами для определенного типа раковых клеток, а затем проанализировать уровни их экспрессии с помощью ОТ-ПЦР. [45]

ОТ-ПЦР обычно используется при изучении геномов вирусов , геномы которых состоят из РНК, таких как вирус гриппа А , ретровирусы, такие как ВИЧ и SARS-CoV-2 . [46]

Вызовы

Несмотря на свои основные преимущества, ОТ-ПЦР не лишена недостатков. Экспоненциальный рост обратно транскрибированной комплементарной ДНК (кДНК) во время множественных циклов ПЦР приводит к неточной количественной оценке конечной точки из-за сложности поддержания линейности. [47] Для того чтобы обеспечить точное обнаружение и количественную оценку содержания РНК в образце, была разработана ОТ-ПЦР с использованием модификации на основе флуоресценции для мониторинга продуктов амплификации во время каждого цикла ПЦР. Чрезвычайная чувствительность метода может быть палкой о двух концах, поскольку даже малейшее загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам. [48] Простой метод устранения ложноположительных результатов заключается во включении якорей, или тегов , в 5'-область геноспецифического праймера. [49] Кроме того, планирование и разработка исследований количественной оценки могут быть технически сложными из-за существования многочисленных источников вариации, включая концентрацию шаблона и эффективность амплификации. [31] В качестве контроля можно использовать введение известного количества РНК в образец, добавление серии разведений РНК, создающих стандартную кривую, и добавление образца без копии матрицы (без кДНК).

Протокол

ОТ-ПЦР может проводиться по одноэтапному или двухэтапному протоколу ОТ-ПЦР.

Одношаговая ОТ-ПЦР

Одношаговая ОТ-ПЦР подвергает мРНК-мишени (до 6 кб) обратной транскрипции с последующей ПЦР-амплификацией в одной пробирке. Использование интактной, высококачественной РНК и специфичного для последовательности праймера даст наилучшие результаты.

После выбора набора для одноэтапной ОТ-ПЦР со смесью обратной транскриптазы, ДНК-полимеразы Taq и корректирующей полимеразы и получения всех необходимых материалов и оборудования необходимо подготовить реакционную смесь. Реакционная смесь включает dNTP, праймеры, РНК-матрицу, необходимые ферменты и буферный раствор. Реакционную смесь добавляют в пробирку ПЦР для каждой реакции, а затем добавляют РНК-матрицу. Затем пробирки ПЦР помещают в термоциклер для начала цикла. В первом цикле происходит синтез кДНК. Второй цикл — это начальная денатурация, при которой обратная транскриптаза инактивируется. Оставшиеся 40–50 циклов — это амплификация, которая включает денатурацию, отжиг и удлинение. После завершения амплификации продукты ОТ-ПЦР можно анализировать с помощью гель-электрофореза . [50] [51]

(Руководство по применению ПЦР и биоинструменты)

Двухэтапная ОТ-ПЦР

Двухэтапная ОТ-ПЦР, как следует из названия, происходит в два этапа. Сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одноэтапный метод. Наборы также полезны для двухэтапной ОТ-ПЦР. Как и для одноэтапной ПЦР, для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную высококачественную РНК. Праймер для двухэтапной ПЦР не обязательно должен быть специфичным к последовательности.

Шаг первый

Сначала соедините РНК-матрицу, праймер, смесь dNTP и воду без нуклеазы в пробирке для ПЦР. Затем добавьте ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу в пробирку для ПЦР. Затем поместите пробирку для ПЦР в термоциклер на один цикл, в котором происходит отжиг, удлинение и инактивация обратной транскриптазы. Наконец, переходите непосредственно ко второму этапу, который представляет собой ПЦР, или храните продукт на льду до тех пор, пока не будет выполнена ПЦР.

Шаг второй

Добавьте мастер-микс, содержащий буфер, смесь dNTP, MgCl2 , полимеразу Taq и воду без нуклеазы, в каждую пробирку для ПЦР. Затем добавьте в пробирки необходимый праймер. Затем поместите пробирки для ПЦР в термоциклер на 30 циклов программы амплификации. Это включает денатурацию, отжиг и удлинение. Продукты ОТ-ПЦР можно анализировать с помощью гель-электрофореза. [52]

Правила публикации

Количественный анализ ОТ-ПЦР считается золотым стандартом для измерения количества копий конкретных целевых ДНК в образце, но он плохо стандартизирован. [53] В результате, хотя существует множество публикаций, использующих эту технику, многие из них предоставляют неадекватные экспериментальные подробности и используют неподходящий анализ данных для получения неверных выводов. Из-за присущей изменчивости качества любых количественных данных ПЦР, рецензентам не только сложно оценивать эти рукописи, но и исследования становится невозможно воспроизвести. [54] Признавая необходимость стандартизации отчетности об экспериментальных условиях, международный консорциум академических ученых опубликовал руководящие принципы Минимальной информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE, произносится как Майки). Руководящие принципы MIQE описывают минимальную информацию, необходимую для оценки количественных экспериментов ПЦР, которая должна потребоваться для публикации, чтобы поощрять лучшую экспериментальную практику и обеспечивать релевантность, точность, правильную интерпретацию и повторяемость количественных данных ПЦР. [55]

Помимо руководств по отчетности, MIQE подчеркивает необходимость стандартизации номенклатуры, связанной с количественной ПЦР, чтобы избежать путаницы; например, аббревиатура qPCR должна использоваться для количественной ПЦР в реальном времени , в то время как RT-qPCR должна использоваться для обратной транскрипции-qPCR, а гены, используемые для нормализации, должны называться референтными генами вместо генов домашнего хозяйства . Он также предлагает не использовать коммерчески полученные термины, такие как зонды TaqMan , а вместо этого называть их зондами гидролиза . Кроме того, предлагается использовать цикл количественной оценки (Cq) для описания цикла ПЦР, используемого для количественной оценки, вместо порогового цикла (Ct), точки пересечения (Cp) и точки взлета (TOP), которые относятся к одному и тому же значению, но были придуманы разными производителями инструментов в реальном времени . [53]

Руководство состоит из следующих элементов: 1) экспериментальный дизайн, 2) образец, 3) извлечение нуклеиновой кислоты, 4) обратная транскрипция, 5) целевая информация qPCR, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) валидация и 9) анализ данных. Конкретные элементы в каждом элементе имеют метку E (необходимый) или D (желательный). Те, которые помечены E, считаются критическими и незаменимыми, в то время как те, которые помечены D, считаются периферийными, но важными для передовой практики. [55]

Исследовать

В 2023 году исследователи разработали рабочий прототип системы RT-LAMP « лаборатория на чипе» , которая выдавала результаты тестов на SARS-CoV-2 в течение трех минут. Технология интегрирует микрофлюидные каналы в печатные платы, что может обеспечить низкозатратное массовое производство. [56] [57]

Ссылки

  1. ^ Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (январь 1999). «Количественная ОТ-ПЦР: подводные камни и потенциал». BioTechniques . 26 (1): 112–22, 124–5. doi : 10.2144/99261rv01 . PMID  9894600.
  2. ^ Маккей, Ян (2007). ПЦР в реальном времени в микробиологии: от диагностики к характеристике . Норфолк, Англия: Caister Academic Press. С. 440. ISBN 978-1-904455-18-9.
  3. ^ Джойс С. (2002). «Количественная ОТ-ПЦР: Обзор современных методологий». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы Mol. Biol. Vol. 193. pp. 83–92. doi :10.1385/1-59259-283-X:083. ISBN 978-1-59259-283-8. PMID  12325527.
  4. ^ Kang XP, Jiang T, Li YQ и др. (2010). «Дуплексный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса птичьего гриппа H5N1 и вируса пандемического гриппа H1N1». Virol. J . 7 : 113. doi : 10.1186/1743-422X-7-113 . PMC 2892456 . PMID  20515509. 
  5. ^ ab Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (июнь 2005 г.). «Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени — перспектива». J. Mol. Endocrinol . 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . doi :10.1677/jme.1.01755. PMID  15956331. S2CID  1754364. 
  6. ^ Varkonyi-Gasic E, Hellens RP (2010). "qRT-PCR малых РНК". Эпигенетика растений . Методы в молекулярной биологии. Т. 631. С. 109–22. doi :10.1007/978-1-60761-646-7_10. ISBN 978-1-60761-645-0. PMID  20204872.
  7. ^ Тейлор С., Вакем М., Дейкман Г., Альсаррадж М., Нгуен М. (апрель 2010 г.). «Практический подход к публикации данных ОТ-ПЦР в соответствии с рекомендациями MIQE». Методы . 50 (4): S1–5. doi :10.1016/j.ymeth.2010.01.005. PMID  20215014.
  8. ^ Spackman E, Senne DA, Myers TJ и др. (сентябрь 2002 г.). «Разработка ПЦР-анализа с обратной транскриптазой в реальном времени для вируса гриппа типа A и подтипов гемагглютинина птиц H5 и H7». J. Clin. Microbiol . 40 ( 9): 3256–60. doi :10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002. PMC 130722. PMID  12202562. 
  9. ^ "ACCELERATED EMERGENCY AUTHORIZATION (EUA) SUMMARY COVID-19 RT-PCR TEST (LABORATORY CORPORATION OF AMERICA)". FDA . Получено 3 апреля 2020 г. .
  10. ^ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (декабрь 1977 г.). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметильную бумагу и гибридизации с ДНК-зондами». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 74 (12): 5350–4. Bibcode :1977PNAS...74.5350A. doi : 10.1073/pnas.74.12.5350 . PMC 431715 . PMID  414220. 
  11. ^ Streit S, Michalski CW, Erkan M, Kleeff J, Friess H (2009). «Анализ нозерн-блоттинга для обнаружения и количественной оценки РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Nat Protoc . 4 (1): 37–43. doi :10.1038/nprot.2008.216. PMID  19131955. S2CID  24980302.
  12. ^ Bustin SA (октябрь 2000 г.). «Абсолютная количественная оценка мРНК с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени». J. Mol. Endocrinol . 25 (2): 169–93. doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID  11013345.
  13. ^ Hierro N, Esteve-Zarzoso B, González A, Mas A, Guillamón JM (ноябрь 2006 г.). «Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) и обратная транскрипция-QPCR для обнаружения и подсчета общего количества дрожжей в вине». Appl. Environ. Microbiol . 72 (11): 7148–55. Bibcode :2006ApEnM..72.7148H. doi :10.1128/AEM.00388-06. PMC 1636171 . PMID  17088381. 
  14. ^ Slomka MJ, Pavlidis T, Coward VJ и др. (июль 2009 г.). «Проверенные методы ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для диагностики и патотипирования вирусов птичьего гриппа H7 в Евразии». Грипп и другие респираторные вирусы . 3 (4): 151–64. doi :10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x. PMC 4634683. PMID  19627372 . 
  15. ↑ Краткое описание миссии: Полевой визит ВОЗ в Ухань, Китай, 20–21 января 2020 г.: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. ^ ab Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R, et al. (июнь 2007 г.). "ПЦР в реальном времени: революционный подход к обнаружению и анализу экспрессии генов". Curr. Genomics . 8 (4): 234–51. doi :10.2174/138920207781386960. PMC 2430684 . PMID  18645596. 
  17. ^ ab Bustin SA (август 2002 г.). «Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы». J. Mol. Endocrinol . 29 (1): 23–39. doi : 10.1677/jme.0.0290023 . PMID  12200227.
  18. ^ ab Souazé F, Ntodou-Thomé A, Tran CY, Rostène W, Forgez P (август 1996 г.). «Количественная ОТ-ПЦР: пределы и точность». BioTechniques . 21 (2): 280–5. doi : 10.2144/96212rr01 . PMID  8862813.
  19. ^ ab Wong ML, Medrano JF (июль 2005 г.). «ПЦР в реальном времени для количественного определения мРНК». BioTechniques . 39 (1): 75–85. doi : 10.2144/05391rv01 . PMID  16060372.
  20. ^ Ли, Лан; Хэ, Цзянь-ань; Ван, Вэй; Ся, Юнь; Сун, Ли; Чэнь, Цзэ-хань; Цзо, Хан-чжи; Тан, Сюань-Пин; Хо, Аарон Хо-Пуй; Конг, Сиу-Кай; Лу, Джеки Фонг-Чуэн (2019-08-01). «Разработка метода прямой обратной транскрипции количественной ПЦР (dirRT-qPCR) для клинической диагностики вируса Зика». Международный журнал инфекционных заболеваний . 85 : 167–174. doi : 10.1016/j.ijid.2019.06.007 . ISSN  1201-9712. PMID  31202908.
  21. ^ Бахофен, Клаудия; Уиллоуби, Ким; Задокс, Рут; Берр, Пол; Меллор, Доминик; Рассел, Джордж К. (2013-06-01). «Прямая ОТ-ПЦР из сыворотки позволяет быстро и экономически эффективно проводить филогенетический анализ вируса вирусной диареи крупного рогатого скота». Журнал вирусологических методов . 190 (1): 1–3. doi :10.1016/j.jviromet.2013.03.015. ISSN  0166-0934. PMID  23541784.
  22. ^ abc Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW (октябрь 2000 г.). «Количественная цепная реакция с обратной транскрипцией и полимеразой для изучения распада мРНК: сравнение методов конечной точки и реального времени». Anal. Biochem . 285 (2): 194–204. doi :10.1006/abio.2000.4753. PMID  11017702. S2CID  258810.
  23. ^ ab Rajeevan MS, Vernon SD, Taysavang N, Unger ER (февраль 2001 г.). "Проверка профилей экспрессии генов на основе массива с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (кинетической)". J Mol Diagn . 3 (1): 26–31. doi :10.1016/S1525-1578(10)60646-0. PMC 1907344. PMID  11227069 . 
  24. ^ Stone-Marschat M, Carville A, Skowronek A, Laegreid WW (март 1994). «Обнаружение вируса африканской чумы лошадей методом обратной транскрипции-ПЦР». J. Clin. Microbiol . 32 (3): 697–700. doi : 10.1128 /JCM.32.3.697-700.1994. PMC 263109. PMID  8195381. 
  25. ^ ab Minton AP (апрель 1995 г.). «Конфайнмент как детерминант макромолекулярной структуры и реакционной способности. II. Эффекты слабопритягивающих взаимодействий между ограниченными макрорастворенными веществами и ограниченными структурами». Biophys. J . 68 (4): 1311–22. Bibcode :1995BpJ....68.1311M. doi :10.1016/S0006-3495(95)80304-8. PMC 1282026 . PMID  7787020. 
  26. ^ Hsu M, Yu EY, Sprušanský O, McEachern MJ, Lue NF (июль 2012 г.). «Функциональный анализ единственного гомолога Est1/Ebs1 в Kluyveromyces lactis выявляет роль как в поддержании теломер, так и в устойчивости к рапамицину». Eukaryotic Cell . 11 (7): 932–42. doi :10.1128/EC.05319-11. PMC 3416500 . PMID  22544908. 
  27. ^ Schmittgen TD, Livak KJ (2008). «Анализ данных ПЦР в реальном времени с помощью сравнительного метода C(T)». Nat Protoc . 3 (6): 1101–8. doi :10.1038/nprot.2008.73. PMID  18546601. S2CID  205464270.
  28. ^ abcd Тан, И-Вэй (2012-09-13), Передовые методы в диагностической микробиологии , Springer, ISBN 978-1461439691
  29. ^ Gause WC, Adamovicz J (июнь 1994 г.). «Использование ПЦР для количественной оценки экспрессии генов». Genome Research . 3 (6): S123–35. doi : 10.1101/gr.3.6.s123 . PMID  7522722.
  30. ^ Tsai SJ, Wiltbank MC (ноябрь 1996 г.). «Количественная оценка мРНК с использованием конкурентной ОТ-ПЦР с методологией стандартной кривой». BioTechniques . 21 (5): 862–6. doi : 10.2144/96215st04 . PMID  8922627.
  31. ^ ab Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF (март 2003 г.). «Анализ количественных данных полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени без допущений». Neurosci. Lett . 339 (1): 62–6. doi :10.1016/S0304-3940(02)01423-4. PMID  12618301. S2CID  9459695.
  32. ^ Halford WP, ​​Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (январь 1999). «Присущая количественная емкость полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией». Anal. Biochem . 266 (2): 181–91. doi : 10.1006/abio.1998.2913 . PMID  9888974.
  33. ^ King N (2010). «Использование сравнительной количественной ОТ-ПЦР для исследования эффекта инкубации цистеина на экспрессию GPx1 в свежеизолированных кардиомиоцитах». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы в молекулярной биологии. Т. 630. С. 215–32. doi :10.1007/978-1-60761-629-0_14. ISBN 978-1-60761-628-3. PMID  20301000.
  34. ^ Chang JT, Chen IH, Liao CT и др. (ноябрь 2002 г.). «Метод сравнительной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией для количественного определения ангиогенных факторов роста у пациентов с раком головы и шеи». Clin. Biochem . 35 (8): 591–6. doi :10.1016/S0009-9120(02)00403-4. PMID  12498992.
  35. ^ Лу, Роу-Цзянь; Чжао, Ли; Хуан, Бао-Ин; Е, Фэй; Ван, Вэнь-Лин; Тань, Вэнь-Цзе (5 сентября 2021 г.). «Панель анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени для обнаружения тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 и его вариантов». Китайский медицинский журнал . 134 (17): 2048–2053. doi : 10.1097/CM9.00000000000001687. PMC 8439998. PMID 34402479.  Получено 17 февраля 2023 г. 
  36. ^ Яверт, Николь (27 марта 2020 г.). «Как вирус COVID-19 обнаруживается с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени?». Международное агентство по атомной энергии . Получено 16 февраля 2023 г.
  37. ^ Holden, MJ; Wang, L. (2008). "Количественная ПЦР в реальном времени: варианты и проблемы флуоресцентных зондов". Стандартизация и обеспечение качества в измерениях флуоресценции II . Springer Series on Fluorescence. Vol. 6. p. 489. doi :10.1007/4243_2008_046. ISBN 978-3-540-70570-3.
  38. ^ Yang DK, Kweon CH, Kim BH и др. (декабрь 2004 г.). «TaqMan-обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция для обнаружения вируса японского энцефалита». J. Vet. Sci . 5 (4): 345–51. doi : 10.4142/jvs.2004.5.4.345 . PMID  15613819.
  39. ^ ab Sharkey FH, Banat IM, Marchant R (июль 2004 г.). «Обнаружение и количественная оценка экспрессии генов в бактериологии окружающей среды». Appl. Environ. Microbiol . 70 (7): 3795–806. Bibcode :2004ApEnM..70.3795S. doi :10.1128/AEM.70.7.3795-3806.2004. PMC 444812 . PMID  15240248. 
  40. ^ Ratcliff RM, Chang G, Kok T, Sloots TP (июль 2007 г.). «Молекулярная диагностика медицинских вирусов». Curr Issues Mol Biol . 9 (2): 87–102. PMID  17489437.
  41. ^ Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE (октябрь 2000 г.). «Мультиплексная ПЦР: оптимизация и применение в диагностической вирусологии». Clin. Microbiol. Rev. 13 ( 4): 559–70. doi : 10.1128/cmr.13.4.559-570.2000. PMC 88949. PMID  11023957. 
  42. ^ Bustin SA (июль 2005 г.). «Количественная ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции: моментальный снимок текущих процедур и предпочтений». Expert Rev. Mol. Diagn . 5 (4): 493–8. doi :10.1586/14737159.5.4.493. PMID  16013967. S2CID  1833811.
  43. ^ Lin L, Chamberlain L, Zhu LJ, Green MR (февраль 2012 г.). «Анализ активации транскрипции, направленной на Gal4, с использованием мутантов Tra1, селективно дефектных для взаимодействия с Gal4». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 109 (6): 1997–2002. Bibcode :2012PNAS..109.1997L. doi : 10.1073/pnas.1116340109 . PMC 3277556 . PMID  22308403. 
  44. ^ Torres RJ, Garcia MG, Puig JG (декабрь 2012 г.). «Носитель и пренатальная диагностика болезни Леша-Нихана из-за дефекта регуляции экспрессии гена HPRT». Gene . 511 (2): 306–7. doi :10.1016/j.gene.2012.09.121. PMID  23046577.
  45. ^ Xi L, Nicastri DG, El-Hefnawy T, Hughes SJ, Luketich JD, Godfrey TE (июль 2007 г.). «Оптимальные маркеры для количественного обнаружения циркулирующих опухолевых клеток меланомы, молочной железы, толстой кишки, пищевода, головы и шеи и легких с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени». Clin. Chem . 53 (7): 1206–15. doi : 10.1373/clinchem.2006.081828 . PMID  17525108.
  46. ^ «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
  47. ^ Shiao YH (декабрь 2003 г.). «Новый метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции для точной количественной оценки». BMC Biotechnol . 3 : 22. doi : 10.1186/1472-6750-3-22 . PMC 317330. PMID  14664723 . 
  48. ^ Gettemy JM, Ma B, Alic M, Gold MH (февраль 1998 г.). "Анализ регуляции семейства генов пероксидазы марганца методом обратной транскрипции-ПЦР". Appl. Environ. Microbiol . 64 (2): 569–74. Bibcode :1998ApEnM..64..569G. doi :10.1128/AEM.64.2.569-574.1998. PMC 106084 . PMID  9464395. 
  49. ^ Мартель, Фатима; Дирк Грундеманн; Эдгар Шёйг (31.03.2002). «Простой метод устранения ложноположительных результатов ОТ-ПЦР». J Biochem Mol Biol . 35 (2): 248–250. doi : 10.5483/BMBRep.2002.35.2.248 . PMID  12297038.
  50. ^ "High Transcript Tools OneStep Kit". Biotools. Архивировано из оригинала 20 мая 2013 года . Получено 12 декабря 2012 года .
  51. ^ Деген, Ханс-Иоахим; Дойфель, Аннетт; Эйзель, Дорис; Грюневальд-Яно, Стефани; Кизи, Джо (2006). Руководство по применению ПЦР (PDF) (3-е изд.). Рош Диагностика. стр. 135–137.
  52. ^ "RT-PCR Two-Step Protocol" (PDF) . MIT . Получено 12 декабря 2012 г. .
  53. ^ ab "www.microarrays.ca" (PDF) .
  54. ^ Bustin SA (апрель 2010 г.). «Почему нужны руководящие принципы публикации qPCR? — Доводы в пользу MIQE». Методы . 50 (4): 217–26. doi :10.1016/j.ymeth.2009.12.006. PMID  20025972.
  55. ^ ab Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. (апрель 2009 г.). «Руководящие принципы MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени». Clin. Chem . 55 (4): 611–22. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID  19246619.
  56. ^ Papamatthaiou S, Boxall-Clasby J, Douglas EJ, Jajesniak P, Peyret H, Mercer-Chalmers J, Kumar VK, Lomonossoff GP, Reboud J, Laabei M, Cooper JM, Kasprzyk-Hordern B, Moschou D (октябрь 2023 г.). «LoCKAmp: технология lab-on-PCB для генетического обнаружения вирусов за <3 минуты». Lab on a Chip . 23 (20): 4400–4412. doi : 10.1039/d3lc00441d. PMC 10563828. PMID  37740394 . 
  57. ^ "Диагностическое устройство LoCKAmp названо "самым быстрым в мире тестом на Covid"". The Engineer . 2 ноября 2023 г. Получено 29 октября 2024 г.

Внешние ссылки