stringtranslate.com

Кристаллизация белка

Кристаллы белков, выращенные на американском космическом корабле "Шаттл" или российской космической станции "Мир" .

Кристаллизация белка — это процесс образования регулярного массива отдельных белковых молекул, стабилизированных кристаллическими контактами. Если кристалл достаточно упорядочен, он будет дифрагировать . Некоторые белки естественным образом образуют кристаллические массивы, например аквапорин в хрусталике глаза. [1] [2]

В процессе кристаллизации белков белки растворяются в водной среде и растворе пробы до достижения пересыщенного состояния . [3] Для достижения этого состояния используются различные методы, такие как диффузия паров, микропартия, микродиализ и диффузия со свободным интерфейсом. Образование кристаллов белка — сложный процесс, на который влияют многие факторы, включая pH, температуру, ионную силу кристаллизационного раствора и даже гравитацию. [3] После формирования эти кристаллы можно использовать в структурной биологии для изучения молекулярной структуры белка, особенно для различных промышленных или медицинских целей. [4] [5]

Развитие кристаллизации белков

Уже более 150 лет учёным всего мира известно о кристаллизации белковых молекул. [6]

В 1840 году Фридрих Людвиг Хюнефельд случайно обнаружил образование кристаллического материала в образцах крови дождевых червей, хранившихся под двумя предметными стеклами, и иногда наблюдал небольшие пластинчатые кристаллы в высушенных образцах свиной или человеческой крови. Эти кристаллы были названы Феликсом Хоппе-Зейлером в 1864 году «гемоглобином». Основополагающие открытия Хюнефельда вдохновили многих ученых в будущем. [7]

В 1851 году Отто Функе описал процесс получения кристаллов человеческого гемоглобина путем разбавления эритроцитов растворителями, например чистой водой, спиртом или эфиром, с последующим медленным испарением растворителя из белкового раствора. В 1871 году Уильям Т. Прейер, профессор Йенского университета, опубликовал книгу под названием Die Blutkrystalle («Кристаллы крови»), в которой были рассмотрены особенности кристаллов гемоглобина примерно 50 видов млекопитающих, птиц, рептилий и рыб. [7]

В 1909 году физиолог Эдвард Т. Райхерт вместе с минералогом Амосом П. Брауном опубликовали трактат о получении, физиологии и геометрических характеристиках кристаллов гемоглобина нескольких сотен животных, включая вымершие виды, такие как тасманийский волк. [7] Было обнаружено увеличение количества кристаллов белка.

В 1934 году Джон Десмонд Бернал и его студентка Дороти Ходжкин обнаружили, что кристаллы белка, окруженные маточным раствором, дают лучшие дифракционные картины, чем высушенные кристаллы. Используя пепсин , они первыми различили дифракционную картину влажного глобулярного белка. До Бернала и Ходжкина кристаллография белков проводилась только в сухих условиях с противоречивыми и ненадежными результатами. Это первая рентгенограмма кристалла белка. [8]

В 1958 году Джон Кендрю впервые сообщил о структуре миоглобина (красного белка, содержащего гем), определенной методом рентгеновской кристаллографии . [9] За это открытие Кендрю разделил Нобелевскую премию по химии 1962 года с Максом Перуцем . [4]

Теперь, на основе белковых кристаллов, их структуры играют значительную роль в биохимии и трансляционной медицине.

Основы кристаллизации белков

Кристаллы лизоцима наблюдаются через поляризационный фильтр.

Теория кристаллизации белков

Кристаллизация белка регулируется той же физикой, которая управляет образованием неорганических кристаллов. Чтобы кристаллизация происходила самопроизвольно, кристаллическое состояние должно быть термодинамически благоприятным. Это описывается свободной энергией Гибба (∆G), определяемой как ∆G = ∆H-T∆S, которая отражает, как энергетика процесса ∆H согласуется с соответствующим изменением энтропии ∆S. [10] Энтропия, грубо говоря, описывает беспорядок системы. Высокоупорядоченные состояния, такие как кристаллы белков, термодинамически невыгодны по сравнению с более неупорядоченными состояниями, такими как растворы белков в растворителе, поскольку переход в более упорядоченное состояние уменьшит общую энтропию системы (положительное ∆S). Для самопроизвольного образования кристаллов ∆G кристаллообразования должна быть отрицательной. Другими словами, энтропийный штраф должен быть оплачен соответствующим уменьшением полной энергии системы (∆H). Знакомые неорганические кристаллы, такие как хлорид натрия, самопроизвольно образуются в условиях окружающей среды, поскольку кристаллическое состояние уменьшает общую энергию системы. Однако кристаллизация некоторых белков в условиях окружающей среды приведет как к уменьшению энтропии (положительное ∆S), так и к увеличению полной энергии (положительное ∆H) системы и, следовательно, не происходит спонтанно. Для достижения кристаллизации таких белков условия модифицируются, чтобы сделать образование кристаллов энергетически выгодным. Это часто достигается путем создания пересыщенного раствора образца. [3]

Молекулярный взгляд от раствора к кристаллу

Формирование кристаллов состоит из двух этапов: зарождения и роста. [3] Нуклеация — это начальный этап кристаллизации. [3] На этапе нуклеации молекулы белка в растворе объединяются в агрегаты, образуя стабильное твердое ядро. [3] По мере формирования ядра кристалл становится все больше и больше за счет молекул, прикрепляющихся к этому стабильному ядру. [3] Этап зародышеобразования имеет решающее значение для образования кристаллов, поскольку это фазовый переход первого рода образцов, переходящих от высокой степени свободы к получению упорядоченного состояния (водного состояния в твердое). [3] Для успешного этапа нуклеации необходимо манипулирование параметрами кристаллизации. Подход к кристаллизации белка заключается в обеспечении более низкой растворимости целевого белка в растворе. [3] Как только предел растворимости превышен и присутствуют кристаллы, кристаллизация завершается. [3]

Методы кристаллизации белков

Диффузия пара

Три метода приготовления кристаллов. А: Висячая капля. Б: Сидячее падение. C: Микродиализ

Диффузия паров является наиболее часто используемым методом кристаллизации белков. В этом методе каплям, содержащим очищенный белок, буфер и осадитель, позволяют прийти в равновесие с резервуаром большего размера, содержащим аналогичные буферы и осадители в более высоких концентрациях. Первоначально капля белкового раствора содержит сравнительно низкие концентрации осадителя и белка, но по мере уравновешивания капли и резервуара концентрации осадителя и белка в капле увеличиваются. Если для данного белка используются соответствующие растворы для кристаллизации, рост кристаллов происходит в капле. [11] [12] Этот метод используется потому, что он позволяет плавно и постепенно изменять концентрацию белка и концентрацию осадителя, что способствует росту крупных и хорошо упорядоченных кристаллов.

Диффузия пара может осуществляться как в виде висячей капли, так и в форме сидячей капли. В аппарате с висячими каплями каплю белкового раствора помещают на перевернутое покровное стекло, которое затем подвешивают над резервуаром. В аппарате для кристаллизации сидячей капли каплю помещают на подставку, отделенную от резервуара. Оба эти метода требуют герметизации окружающей среды, чтобы могло произойти равновесие между каплей и резервуаром. [11] [13]

Микропартия

Микропартия обычно предполагает погружение очень небольшого объема капель белка в масло (всего 1 мкл). Причина, по которой требуется масло, заключается в том, что используется такой малый объем белкового раствора, и поэтому для проведения эксперимента в водной среде необходимо препятствовать испарению. Хотя можно использовать различные масла, двумя наиболее распространенными герметиками являются парафиновые масла (описанные Чайеном и др.) и силиконовые масла (описанные Д'Арси). Существуют также другие методы микродозирования, в которых не используется жидкий герметик, а вместо этого требуется, чтобы ученый быстро поместил пленку или ленту на планшет с прорезями после помещения капли в лунку.

Помимо очень ограниченного количества необходимых образцов, этот метод также имеет еще одно преимущество: образцы защищены от загрязнения, передающегося по воздуху, поскольку они никогда не подвергаются воздействию воздуха во время эксперимента.

Микродиализ

В микродиализе используется полупроницаемая мембрана, через которую могут проходить небольшие молекулы и ионы, в то время как белки и крупные полимеры не могут пересекаться. Устанавливая градиент концентрации растворенных веществ на мембране и позволяя системе приближаться к равновесию, система может медленно двигаться к перенасыщению, после чего могут образовываться кристаллы белка.

Микродиализ может производить кристаллы путем высаливания с использованием высоких концентраций соли или других небольших проницаемых через мембрану соединений, которые снижают растворимость белка. В очень редких случаях некоторые белки можно кристаллизовать путем диализного высаливания, диализа против чистой воды, удаления растворенных веществ, стимулирования самоассоциации и кристаллизации.

Распространение свободного интерфейса

Этот метод объединяет растворы белка и осадков, не смешивая их предварительно, а вместо этого впрыскивая их через обе стороны канала, обеспечивая равновесие посредством диффузии. Два раствора вступают в контакт в камере для реагентов, оба при максимальных концентрациях, инициируя спонтанное зародышеобразование. По мере того как система приходит в равновесие, уровень пересыщения снижается, что способствует росту кристаллов. [14]

Факторы, влияющие на кристаллизацию белка

рН

Основной движущей силой кристаллизации белка является оптимизация количества связей, которые можно образовать с другим белком посредством межмолекулярных взаимодействий. [3] Эти взаимодействия зависят от электронной плотности молекул и боковых цепей белка, которые изменяются в зависимости от pH. [10] Третичная и четвертичная структура белков определяются межмолекулярными взаимодействиями между боковыми группами аминокислот, в которых гидрофильные группы обычно обращены наружу, к раствору, образуя гидратную оболочку растворителя (воды). [10] По мере изменения pH заряд этих полярных боковых групп также меняется в зависимости от pH раствора и pKa белка. Следовательно, выбор pH важен либо для того, чтобы способствовать образованию кристаллов, в которых связь между молекулами друг с другом более благоприятна, чем с молекулами воды. [10] pH – одна из самых мощных манипуляций, которую можно назначить для достижения оптимальных условий кристаллизации.

Температура

Температура — еще один интересный параметр для обсуждения, поскольку растворимость белка является функцией температуры. [15] При кристаллизации белка манипуляция температурой для получения успешных кристаллов является одной из распространенных стратегий. В отличие от pH, температура различных компонентов кристаллографических экспериментов может влиять на конечные результаты, например, температура приготовления буфера, [16] температура фактического эксперимента по кристаллизации и т. д.

Химические добавки

Химические добавки — это небольшие химические соединения, которые добавляются в процесс кристаллизации для увеличения выхода кристаллов. [17] Роль малых молекул в кристаллизации белка вначале не была хорошо продумана, поскольку в большинстве случаев их считали загрязнителями. [17] Меньшие молекулы кристаллизуются лучше, чем макромолекулы, такие как белки, поэтому до исследования Макферсона использование химических добавок было ограничено. Однако это важный аспект экспериментальных параметров кристаллизации, который важен для дальнейшего исследования и применения биохимиками и кристаллографами. [17]

Технологии, способствующие кристаллизации белков

Высокопроизводительный кристаллизационный скрининг [18]

Существуют высокопроизводительные методы, которые помогают оптимизировать большое количество экспериментов, необходимых для изучения различных условий, необходимых для успешного роста кристаллов. Для заказа доступно множество коммерческих наборов, в которых предварительно собранные ингредиенты применяются в системах, гарантированно обеспечивающих успешную кристаллизацию. Используя такой набор, ученый избавляется от хлопот по очистке белка и определению подходящих условий кристаллизации.

Роботы, работающие с жидкостью, могут использоваться для одновременной постановки и автоматизации большого количества экспериментов по кристаллизации. То, что в противном случае было бы медленным и потенциально подверженным ошибкам процессом, выполняемым человеком, может быть выполнено эффективно и точно с помощью автоматизированной системы. В роботизированных системах кристаллизации используются те же компоненты, что описаны выше, но каждый этап процедуры выполняется быстро и с большим количеством повторов. В каждом эксперименте используются крошечные количества раствора, и преимущество меньшего размера двойное: меньшие размеры выборки не только сокращают расход очищенного белка, но и меньшие количества раствора приводят к более быстрой кристаллизации. Каждый эксперимент контролируется камерой, которая обнаруживает рост кристаллов. [12]

Белковая инженерия

Белки можно спроектировать так, чтобы повысить вероятность успешной кристаллизации белков, используя такие методы, как уменьшение поверхностной энтропии [19] или инженерию в кристаллических контактах. [20] Часто проблемные остатки цистеина можно заменить аланином, чтобы избежать дисульфид -опосредованной агрегации, а такие остатки, как лизин, глутамат и глутамин, можно заменить на аланин, чтобы уменьшить внутреннюю гибкость белка, что может препятствовать кристаллизации.

Применение кристаллографии белков

Макромолекулярные структуры можно определить из кристаллов белка с помощью различных методов, включая дифракцию рентгеновских лучей / рентгеновскую кристаллографию , криогенную электронную микроскопию (CryoEM) (включая электронную кристаллографию и дифракцию микрокристаллических электронов (MicroED) ), малоугловую рентгеновскую рентгенографию. рассеяние и дифракция нейтронов . См. также Структурную биологию .

Кристаллизация белков также может быть полезна при приготовлении белков для фармацевтических целей. [21]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Шей К.Л., Ван З., Л. Венке Дж., Ци Ю (май 2014 г.). «Аквапорины в глазах: выражение, функции и роль при заболеваниях глаз». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1840 (5): 1513–1523. дои : 10.1016/j.bbagen.2013.10.037. ПМЦ  4572841 . ПМИД  24184915.
  2. ^ Гонен Т., Ченг Ю., Слиз П., Хироаки Ю., Фудзиёси Ю., Харрисон СК, Уолц Т. (декабрь 2005 г.). «Липид-белковые взаимодействия в двухслойных двумерных кристаллах AQP0». Природа . 438 (7068): 633–638. Бибкод : 2005Natur.438..633G. дои : 10.1038/nature04321. ПМК 1350984 . ПМИД  16319884. 
  3. ^ abcdefghijk Макферсон А., Гавира Дж.А. (январь 2014 г.). «Введение в кристаллизацию белков». Акта Кристаллографика. Раздел F. Коммуникации в области структурной биологии . 70 (Часть 1): 2–20. дои : 10.1107/s2053230x13033141. ПМЦ 3943105 . ПМИД  24419610. 
  4. ^ аб Бланделл TL (июль 2017 г.). «Кристаллография белка и открытие лекарств: воспоминания об обмене знаниями между научными кругами и промышленностью». МСКРЖ . 4 (Часть 4): 308–321. дои : 10.1107/s2052252517009241. ПМЦ 5571795 . ПМИД  28875019. 
  5. ^ Трипатия Д., Бардия А., Селлерс WR (июль 2017 г.). «Рибоциклиб (LEE011): механизм действия и клиническое влияние этого селективного ингибитора циклин-зависимой киназы 4/6 при различных солидных опухолях». Клинические исследования рака . 23 (13): 3251–3262. doi : 10.1158/1078-0432.ccr-16-3157. ПМК 5727901 . ПМИД  28351928. 
  6. ^ Макферсон А (март 1991 г.). «Краткая история роста кристаллов белка». Журнал роста кристаллов . 110 (1–2): 1–10. Бибкод : 1991JCrGr.110....1M. дои : 10.1016/0022-0248(91)90859-4. ISSN  0022-0248.
  7. ^ abc Giegé R (декабрь 2013 г.). «Исторический взгляд на кристаллизацию белка с 1840 года до наших дней». Журнал ФЭБС . 280 (24): 6456–6497. дои : 10.1111/февраль 12580 . ПМИД  24165393.
  8. ^ Тулинский А (1996). «Глава 35. Проект структуры белка, 1950–1959: первая согласованная попытка определения структуры белка в США». Годовые отчеты по медицинской химии . Эльзевир. 31 : 357–366. дои : 10.1016/s0065-7743(08)60474-1. ISBN 9780120405312.
  9. ^ Кендрю Дж.К., Бодо Дж., Динцис Х.М., Пэрриш Р.Г., Вайкофф Х., Филлипс, округ Колумбия (март 1958 г.). «Трехмерная модель молекулы миоглобина, полученная методом рентгеноструктурного анализа». Природа . 181 (4610): 662–666. Бибкод : 1958Natur.181..662K. дои : 10.1038/181662a0. PMID  13517261. S2CID  4162786.
  10. ^ abcd Boyle J (январь 2005 г.). «Ленингерские принципы биохимии (4-е изд.): Нельсон Д. и Кокс М.». Образование в области биохимии и молекулярной биологии . 33 (1): 74–75. дои : 10.1002/bmb.2005.494033010419 . ISSN  1470-8175.
  11. ^ AB Родос Г (2006). Кристаллография стала кристально чистой: Руководство для пользователей макромолекулярных моделей (Третье изд.). Академическая пресса.
  12. ^ ab "Хрустальный робот". Декабрь 2000 года . Проверено 18 февраля 2003 г.
  13. ^ Макри Д. (1993). Практическая кристаллография белков. Сан-Диего: Академическая пресса. стр. 1–23. ISBN 978-0-12-486052-0.
  14. ^ Рупп Б (20 октября 2009 г.). Биомолекулярная кристаллография: принципы, практика и применение в структурной биологии. Гирляндная наука. п. 800. ISBN 9781134064199. Проверено 28 декабря 2016 г.
  15. ^ Пелегрин Д.Х., Гаспаретто, Калифорния (февраль 2005 г.). «Растворимость сывороточных белков в зависимости от температуры и pH». LWT – Пищевая наука и технология . 38 (1): 77–80. дои : 10.1016/j.lwt.2004.03.013. ISSN  0023-6438.
  16. ^ Чен RQ, Лу QQ, Ченг QD, Ао ЛБ, Чжан CY, Хоу Х и др. (январь 2015 г.). «Игнорируемая переменная: температура приготовления раствора при кристаллизации белка». Научные отчеты . 5 (1): 7797. Бибкод : 2015NatSR...5E7797C. дои : 10.1038/srep07797. ПМК 4297974 . ПМИД  25597864. 
  17. ^ abc Макферсон А, Кадни Б (декабрь 2006 г.). «В поисках серебряной пули: альтернативная стратегия кристаллизации макромолекул». Журнал структурной биологии . 156 (3): 387–406. дои : 10.1016/j.jsb.2006.09.006. PMID  17101277. S2CID  10944540.
  18. ^ Лин Ю (август 2018 г.). «Что произошло за последние пять лет с высокопроизводительным скринингом кристаллизации белков?». Мнение экспертов об открытии лекарств . 13 (8): 691–695. дои : 10.1080/17460441.2018.1465924 . ПМИД  29676184.
  19. ^ Купер Д.Р., Бочек Т., Грелевска К., Пинковска М., Сикорска М., Завадски М., Деревенда З. (май 2007 г.). «Кристаллизация белка за счет уменьшения поверхностной энтропии: оптимизация стратегии SER». Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 63 (Часть 5): 636–645. дои : 10.1107/S0907444907010931. ПМИД  17452789.
  20. ^ Гонен С., ДиМайо Ф., Гонен Т., Бейкер Д. (июнь 2015 г.). «Дизайн упорядоченных двумерных массивов, опосредованный нековалентными интерфейсами белок-белок». Наука . 348 (6241): 1365–1368. Бибкод : 2015Sci...348.1365G. дои : 10.1126/science.aaa9897 . ПМИД  26089516.
  21. ^ Джен А., Меркл HP (ноябрь 2001 г.). «Необработанные алмазы: кристаллы белка с точки зрения рецептуры». Фармацевтические исследования . 18 (11): 1483–8. дои : 10.1023/а: 1013057825942. PMID  11758753. S2CID  21801946.

дальнейшее чтение

Внешние ссылки