stringtranslate.com

Окраска по Граму

Микрофотография грамположительного кокка и грамотрицательной палочки.
Окраска по Граму смешанных Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, грамположительные кокки, фиолетовый цвет) и Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, грамотрицательные бациллы, красный цвет), наиболее распространенных эталонных бактерий, окрашиваемых по Граму.

Окрашивание по Граму ( окрашивание по Граму или метод Грама ) — это метод окрашивания , используемый для разделения видов бактерий на две большие группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии . Его также можно использовать для диагностики грибковой инфекции . [1] Название происходит от датского бактериолога Ганса Кристиана Грама , который разработал эту методику в 1884 году. [2]

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать бактерии по химическим и физическим свойствам их клеточных стенок . Грамположительные клетки имеют толстый слой пептидогликана в клеточной стенке, который сохраняет первичное окрашивание – кристаллический фиолетовый . Грамотрицательные клетки имеют более тонкий слой пептидогликана, который позволяет кристаллическому фиолетовому вымываться при добавлении этанола . Они окрашиваются в розовый или красный цвет при помощи контрастного красителя , [3] обычно сафранина или фуксина . Раствор Люголя всегда добавляют после добавления кристаллического фиолетового для усиления связи пятна с клеточной мембраной .

Окрашивание по Граму почти всегда является первым шагом в идентификации бактериальной группы. Хотя окрашивание по Граму является ценным диагностическим инструментом как в клинических, так и в исследовательских целях, не все бактерии можно окончательно классифицировать с помощью этого метода. Это приводит к образованию грамм-переменных и грамм-неопределенных групп.

История

Метод назван в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Кристиана Грама (1853–1938), который разработал методику во время работы с Карлом Фридлендером в морге городской больницы Берлина в 1884 году. Грам разработал свою методику не с целью не только отличать один тип бактерий от другого, но и делать бактерии более заметными на окрашенных участках легочной ткани. [4] Он опубликовал свой метод в 1884 году и включил в свой краткий отчет наблюдение, что тифозная палочка не сохраняет пятно. [5]

Использование

Окраска по Граму Candida albicans из влагалищного мазка. Мелкие овальные хламидоспоры диаметром 2–4 мкм .

Окрашивание по Граму — бактериологический лабораторный метод [6] , используемый для дифференциации видов бактерий на две большие группы ( грамположительные и грамотрицательные ) на основе физических свойств их клеточных стенок . [7] [ нужна страница ] Окрашивание по Граму также можно использовать для диагностики грибковой инфекции . [1] Окрашивание по Граму не используется для классификации архей , поскольку эти микроорганизмы дают самые разнообразные реакции, не соответствующие их филогенетическим группам . [8]

Некоторые организмы являются грамизменчивыми (это означает, что они могут окрашиваться как отрицательно, так и положительно); некоторые из них не окрашены красителями, используемыми в технике Грамма, и не видны.

Медицинский

Пример алгоритма исследования возможной бактериальной инфекции в случаях, когда не указаны конкретные цели (небактерии, микобактерии и т. д.), с наиболее распространенными ситуациями и агентами, наблюдаемыми в условиях общественной больницы Новой Англии. В этом случае окрашивание по Граму используется даже перед посевом на агаровые чашки образцов крови и спинномозговой жидкости. Кроме того, в случаях, когда был проведен посев, окраска по Граму является основным фактором, определяющим дальнейшее исследование.

При подозрении на инфекцию проводят окраску по Граму жидкости организма или биопсию . Окрашивание по Граму дает результаты гораздо быстрее, чем культивирование , и особенно важно, когда инфекция может иметь важное значение в лечении и прогнозе пациента; примерами являются спинномозговая жидкость при менингите и синовиальная жидкость при септическом артрите . [9] [10]

Механизм окрашивания

Грамположительные, окрашенные в фиолетовый цвет (слева) и грамотрицательные, окрашенные в розовый цвет (справа).

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатую клеточную стенку, состоящую из пептидогликана (50–90% клеточной оболочки), и в результате окрашиваются в фиолетовый цвет кристаллическим фиолетовым, тогда как грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой (10% клеточной оболочки). конверт), поэтому не сохраняют пурпурное пятно и окрашиваются сафранином в розовый цвет. Окраска по Граму состоит из четырех основных этапов:

  1. Нанесение первичного красителя ( кристалвиолета ) на термофиксированный мазок бактериальной культуры. Термофиксация убивает некоторые бактерии, но в основном используется для прикрепления бактерий к предметному стеклу, чтобы они не смывались во время процедуры окрашивания.
  2. Добавление йода , который связывается с кристаллическим фиолетовым и удерживает его в клетке.
  3. Быстрое обесцвечивание этанолом или ацетоном
  4. Докраска сафранином . _ [11] Карболфуксин иногда заменяют сафранином, поскольку он более интенсивно окрашивает анаэробные бактерии, но реже используется в качестве контрастного красителя. [12]

Кристаллический фиолетовый (CV) диссоциирует в водных растворах на CV.+
и хлорид ( Cl−
) ионы. Эти ионы проникают через клеточную стенку как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. Резюме _+
ион взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивает клетки в фиолетовый цвет. [13]

Йодид ( я−
или я−
3) взаимодействует с резюме+
и образует большие комплексы кристаллического фиолетового и йода (CV – I) во внутренних и внешних слоях клетки. Йод часто называют протравой , но он является улавливающим агентом, который предотвращает удаление комплекса CV-I и, следовательно, окрашивает клетку. [14]

Когда добавляется обесцвечиватель, такой как спирт или ацетон, он взаимодействует с липидами клеточной мембраны. [15] Грамотрицательная клетка теряет внешнюю липополисахаридную мембрану, а внутренний слой пептидогликана остается открытым. Комплексы CV–I вымываются из грамотрицательной клетки вместе с внешней мембраной. [16] Напротив, грамположительные клетки обезвоживаются в результате обработки этанолом. Большие комплексы CV-I задерживаются внутри грамположительной клетки из-за многослойной природы ее пептидогликана. [16] Этап обесцвечивания имеет решающее значение и должен быть правильно рассчитан по времени; Окраска кристаллическим фиолетовым удаляется как с грамположительных, так и с отрицательных клеток, если обесцвечивающее средство остается на слишком долгое время (в течение нескольких секунд). [17]

После обесцвечивания грамположительная клетка остается фиолетовой, а грамотрицательная клетка теряет фиолетовый цвет. [17] Контракраситель, который обычно представляет собой положительно заряженный сафранин или основной фуксин, применяется последним, чтобы придать обесцвеченным грамотрицательным бактериям розовый или красный цвет. [3] [18] Как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии улавливают контрастное окрашивание. Однако контрастное окрашивание незаметно для грамположительных бактерий из-за более темного пятна кристаллического фиолетового.

Примеры

Грамположительные бактерии

Окраска по Граму грамположительных стрептококков , окруженных гнойными клетками

Грамположительные бактерии обычно имеют одну мембрану ( монодерма ), окруженную толстым пептидогликаном. Этому правилу следуют два типа: Bacillota (за исключением классов Mollicutes и Negativicutes ) и Actinomycetota . [7] [19] Напротив, представители Chloroflexota (зеленые несерные бактерии) являются монодермами, но обладают тонким или отсутствующим (класс Dehalococcoidetes ) пептидогликаном и могут окрашиваться отрицательно, положительно или неопределенно; представители Deinococta окрашиваются положительно, но представляют собой дидермы с толстым слоем пептидогликана. [7] [ нужна страница ] [19]

Исторически грамположительные формы составляли тип Firmicutes , название, которое сейчас используется для самой большой группы. Он включает в себя множество известных родов, таких как Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus и Clostridium . [20] Он также был расширен за счет включения Mollicutes, бактерий, таких как Mycoplasma и Thermoplasma, у которых отсутствуют клеточные стенки и поэтому их нельзя окрашивать по Граму, но которые происходят из таких форм. [21]

У некоторых бактерий клеточные стенки особенно хорошо удерживают пятна. При окраске по Граму они будут казаться положительными, даже если они не являются тесно связанными с другими грамположительными бактериями. Их называют кислотоустойчивыми бактериями , и отличить их от других грамположительных бактерий можно только с помощью специальных процедур окрашивания . [22]

Грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные Neisseria gonorrhoeae и гнойные клетки

Грамотрицательные бактерии обычно имеют тонкий слой пептидогликана между двумя мембранами ( дидермой ). [23] Липополисахарид (ЛПС) является наиболее распространенным антигеном на поверхности клеток большинства грамотрицательных бактерий, составляя до 80% внешней мембраны E. coli и сальмонеллы . [24] Большинство типов бактерий являются грамотрицательными, включая цианобактерии , зеленые серные бактерии и большинство Pseudomonadota (исключение составляют некоторые представители Rickettsiales и насекомые-эндосимбионты Enterobacteriales ) . [7] [ нужна страница ] [19]

Грамотвариабельные и грамотрицательные бактерии.

Некоторые бактерии после окраски красителем по Граму дают грамвариабельную картину: видна смесь розовых и пурпурных клеток. [16] [25] В культурах Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium уменьшение толщины пептидогликана во время роста совпадает с увеличением количества клеток, окрашивающих грамотрицательные клетки. [25] Кроме того, у всех бактерий, окрашенных красителем по Граму, возраст культуры может влиять на результаты окрашивания. [25]

Грамотдетерминантные бактерии не реагируют предсказуемо на окрашивание по Граму и, следовательно, не могут быть определены как грамположительные или грамотрицательные. Примеры включают многие виды Mycobacterium , в том числе Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae и Mycobacterium Tuberculosis , две последние из которых являются возбудителями проказы и туберкулеза соответственно. [26] [27] У бактерий рода Mycoplasma отсутствует клеточная стенка вокруг клеточных мембран , [9] что означает, что они не окрашиваются по методу Грама и устойчивы к антибиотикам, воздействующим на синтез клеточной стенки. [28] [29]

Орфографическое примечание

Термин «окрашивание по Граму» происходит от фамилии Ганса Христиана Грама ; Поэтому эпоним (Грам) пишется с заглавной буквы, а не нарицательное существительное (пятно) , как обычно для научных терминов. [30] Начальные буквы грамположительных и грамотрицательных , которые являются одноименными прилагательными , могут быть как заглавными G , так и строчными g , в зависимости от того, какое руководство по стилю (если таковое имеется) регулирует написанный документ. Стиль строчных букв используется Центрами США по контролю и профилактике заболеваний, а также другими режимами стиля, такими как стиль AMA . [31] Словари могут использовать строчные буквы, [32] [33] прописные буквы, [34] [35] [36] [37] или оба варианта. [38] [39] Использование заглавных букв грамположительных или грамотрицательных слов также распространено во многих статьях и публикациях научных журналов . [39] [40] [41] Когда статьи отправляются в журналы, каждый журнал может применять или не применять собственный стиль к послепечатной версии. Препринтные версии содержат тот стиль, который использовал автор. Даже в схемах оформления, в которых прилагательные «грамположительный» и «грамотрицательный» используются строчными буквами, для обозначения окраски по Граму обычно используется заглавная буква .

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ ab «Окраска по Граму: медицинский тест MedlinePlus» . medlineplus.gov .
  2. ^ Колко, Р. (2005). «Окраска по Граму». Современные протоколы в микробиологии . Приложение 3 (1): Приложение 3C. doi : 10.1002/9780471729259.mca03cs00. ISBN 978-0471729259. PMID  18770544. S2CID  32452815.
  3. ^ аб Беверидж, Ти Джей; Дэвис, Дж. А. (ноябрь 1983 г.). «Клеточные реакции Bacillus subtilis и Escherichia coli на окрашивание по Граму». Журнал бактериологии . 156 (2): 846–58. дои : 10.1128/JB.156.2.846-858.1983. ПМК 217903 . ПМИД  6195148. 
  4. ^ Австриец, Р. (1960). «Окраска по Граму и этиология крупозной пневмонии, историческая справка». Бактериологические обзоры . 24 (3): 261–265. дои :10.1128/MMBR.24.3.261-265.1960. ПМК 441053 . ПМИД  13685217. 
  5. ^ Грам, Ганс Кристиан (1884). «Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten». Fortschritte der Medizin (на немецком языке). 2 : 185–189..
    Английский перевод: Brock, TD (1999). Вехи микробиологии 1546–1940 (2-е изд.). АСМ Пресс. стр. 215–218. ISBN 978-1-55581-142-6.
    Перевод также находится по адресу: Brock, TD «Пионеры медицинских лабораторных исследований: Кристиан Грам, 1884 г.». HOSLink.com . Проверено 27 июля 2010 г.
  6. ^ Райан, К.Дж.; Рэй, CG, ред. (2004). Медицинская микробиология Шерриса (4-е изд.). МакГроу Хилл. стр. 232ф. ISBN 978-0838585290.
  7. ^ abcd Мэдиган, Монтана; Мартинко, Дж.; Паркер, Дж. (2004). Брок Биология микроорганизмов (10-е изд.). Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. ISBN 978-0-13-066271-2.
  8. ^ Беверидж, Ти Джей (2001). «Использование окраски по Граму в микробиологии». Биотехника и гистохимия . 76 (3): 111–118. дои : 10.1080/714028139. ПМИД  11475313.
  9. ^ ab Райан К.Дж., Рэй К.Г. (редакторы) (2004). Медицинская микробиология Шерриса (4-е изд.). МакГроу Хилл. стр. 409–12. ISBN 978-0-8385-8529-0. {{cite book}}: |author=имеет общее имя ( справка )
  10. ^ Согаард, М.; Норгаард, М.; Шёнхейдер, Х. (2007). «Первое уведомление о положительных посевах крови: высокая точность отчета об окраске по Граму». Журнал клинической микробиологии . 45 (4): 1113–1117. дои : 10.1128/JCM.02523-06. ПМК 1865800 . ПМИД  17301283. 
  11. ^ Блэк, Жаклин Г. (1993). Микробиология: принципы и исследования . Прентис Холл. п. 65.
  12. ^ "Медицинско-химическая корпорация". Med-Chem.com . Проверено 9 марта 2016 г.
  13. ^ Лебофф, Майкл (2014). Теория и применение микробиологической лаборатории (3-е изд.). Энглвуд, Колорадо: Издательская компания Мортона. п. 105. ИСБН 978-1617312809.
  14. ^ «Теория пятен - чем не является протрава» . StainsFile.info . Архивировано из оригинала 9 марта 2016 года . Проверено 9 марта 2016 г.
  15. ^ "Пятно по Граму". Микробагз . Общественный колледж Остина . Проверено 26 мая 2017 г.
  16. ^ abc Тим, Сэндл (21 октября 2015 г.). Фармацевтическая микробиология: основы обеспечения и контроля качества . Эльзевир Наука. ISBN 9780081000229. ОКЛК  923807961.
  17. ^ Аб Харди, Джей; Мария, Санта. «Случайное пятно бабушки» (PDF) . Диагностика Харди . Архивировано (PDF) из оригинала 24 марта 2017 г.
  18. ^ Дэвис, Дж. А.; Андерсон, ГК; Беверидж, Ти Джей; Кларк, ХК (ноябрь 1983 г.). «Химический механизм окраски по Граму и синтез нового электронно-непрозрачного маркера для электронной микроскопии, заменяющего йодную протраву окраски». Журнал бактериологии . 156 (2): 837–845. дои : 10.1128/JB.156.2.837-845.1983. ПМК 217902 . ПМИД  6195147. 
  19. ^ abc Бреннер, Дон Дж.; Криг, Ноэль Р.; Стейли, Джеймс Т. (26 июля 2005 г.) [1984]. Гаррити, Джордж М. (ред.). Вводные эссе. Руководство Берджи по систематической бактериологии. Том. 2А (2-е изд.). Нью-Йорк: Спрингер. п. 304. ИСБН 978-0-387-24143-2. Британская библиотека №. GBA561951.
  20. ↑ Гальперин, Майкл Ю. (27 декабря 2013 г.). «Геномное разнообразие спорообразующих фирмикутов». Микробиологический спектр . 1 (2): TBS-0015-2012-. doi : 10.1128/microbiolspectrum.tbs-0015-2012. ISSN  2165-0497. ПМК 4306282 . ПМИД  26184964. 
  21. ^ Хашем, Хэмс Х. «Практическая медицинская микробиология». Университет Аль-Кадисия .
  22. ^ «Кислотностойкое пятно». www2.Highlands.edu . Колледж Джорджии Хайлендс. Архивировано из оригинала 10 июня 2017 года . Проверено 10 июня 2017 г.
  23. ^ Мегриан Д., Тайб Н., Витвиновски Дж., Грибальдо С. (2020). «Одна или две мембраны? Diderm Firmicutes бросает вызов разделению на грамположительные и грамотрицательные». Молекулярная микробиология . 113 (3): 659–671. дои : 10.1111/mmi.14469 . PMID  31975449. S2CID  210882600.
  24. ^ Авила-Кальдерон ЭД, Руис-Пальма MD, Контрерас-Родригес А (2021). «Везикулы наружной мембраны грамотрицательных бактерий: взгляд на биогенез». Границы микробиологии . 12 : 557902. дои : 10.3389/fmicb.2021.557902 . ПМЦ 7969528 . ПМИД  33746909. 
  25. ^ abc Беверидж, Терри Дж. (март 1990 г.). «Механизм граммовой изменчивости некоторых бактерий». Журнал бактериологии . 172 (3): 1609–1620. дои : 10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990. ПМК 208639 . ПМИД  1689718. 
  26. ^ Блэк, Жаклин (2012). Микробиология: принципы и исследования (8-е изд.). Джон Уайли и сыновья. п. 68. ИСБН 978-0-470-54109-8.
  27. ^ Рейнольдс, Дж.; Мойес, РБ; Брейквелл, ДП (2009). «Приложение 3». Дифференциальное окрашивание бактерий: кислотоустойчивое окрашивание . Том. Приложение 3. стр. H. doi :10.1002/9780471729259.mca03hs15. ISBN 978-0471729259. PMID  19885935. S2CID  45685776. {{cite book}}: |journal=игнорируется ( помощь )
  28. ^ Ли Э.Х., Винтер Х.Л., ван Дийл Дж.М., Метцемакерс Дж.Д., Арендс Дж.П. (декабрь 2012 г.). «Диагностика и противомикробная терапия микоплазменного менингита у взрослых». Международный журнал медицинской микробиологии . 302 (7–8): 289–92. doi :10.1016/j.ijmm.2012.09.003. ПМИД  23085510.
  29. ^ Готье-Бушардон А.В. (июль 2018 г.). «Устойчивость к противомикробным препаратам у Mycoplasma spp». Микробиологический спектр . 6 (4): 425–446. doi : 10.1128/microbiolspec.ARBA-0030-2018. ISBN 9781555819798. PMID  30003864. S2CID  51616821.
  30. ↑ Уоддингем, Энн (28 августа 2014 г.). Правила Нью-Харта: Оксфордское руководство по стилю. Издательство Оксфордского университета. п. 105. ИСБН 978-0199570027.
  31. ^ «Предпочтительное использование». Руководство по стилю в отношении новых инфекционных заболеваний . Центры по контролю и профилактике заболеваний .
  32. ^ «Иллюстрированный медицинский словарь Дорланда» (32-е изд.). Эльзевир . Проверено 5 июня 2020 г.Используйте поисковые запросы, такие как gram-negative.
  33. ^ «грамположительный», Merriam-Webster , Британская энциклопедия, Inc.
  34. ^ «Грамположительный». CollinsDictionary.com . ХарперКоллинз.
  35. ^ «Окраска по Граму». Лексико.com . Издательство Оксфордского университета. Архивировано из оригинала 5 июня 2020 года.
  36. ^ «Грамположительный». МедицинаНет .
  37. ^ «Грам-отрицательный/положительный». BusinessDictionary.com . Архивировано из оригинала 20 октября 2016 г. Проверено 20 октября 2016 г.
  38. ^ "грамположительный" или "грамположительный" . Словарь американского наследия . Хоутон Миффлин.
  39. ^ ab "Грамположительный". Словарь.com .
  40. ^ Браун, Лиза; Вольф, Джули М.; Прадос-Росалес, Рафаэль; Касадевалл, Артуро (2015). «Сквозь стену: внеклеточные везикулы грамположительных бактерий, микобактерий и грибов». Обзоры природы Микробиология . 13 (10): 620–630. doi : 10.1038/nrmicro3480. ПМЦ 4860279 . ПМИД  26324094. 
  41. ↑ Мюллер, Кристен Л. (12 июня 2015 г.). «Обнаружение грамотрицательных бактерий». Наука . 348 (6240): 1218. doi :10.1126/science.348.6240.1218-o.

Внешние ссылки

Викискладе есть медиафайлы по теме пятен по Граму .
В Wikibook School Science есть страница на тему: Окрашивание по Граму.