Ген частоты ( frq ) кодирует частоту белка (FRQ), который функционирует в циркадных часах Neurospora crassa . Белок FRQ играет ключевую роль в циркадном осцилляторе, служа для зарождения комплекса отрицательного элемента в ауторегуляторной петле отрицательной обратной связи транскрипции-трансляции (TTFL), которая отвечает за циркадные ритмы у N. crassa . [1] Похожие ритмы обнаружены у млекопитающих, дрозофилы и цианобактерий. Недавно гомологи FRQ были идентифицированы у нескольких других видов грибов. [2] Экспрессия frq контролируется двумя факторами транскрипции white collar-1 (WC-1) и white collar-2 (WC-2), которые действуют вместе как комплекс белого воротничка (WCC) и служат положительным элементом в TTFL. Экспрессия frq также может быть вызвана воздействием света в зависимости от WCC. Генетика будущего создала множество аллелей frq, что привело к появлению штаммов, циркадные часы которых различаются по продолжительности периода.
Локус frq был открыт Джерри Ф. Фельдманом. Фельдман был аспирантом Колина Питтендрига в Принстоне и отправился в Калтех в 1967 году, чтобы начать генетический скрининг мутантов циркадных часов. Скринингу способствовала недавняя работа, которая улучшила выражение ритма у Neurospora . Колин Питтендриг и его коллеги подтвердили в 1959 году, что суточный цикл бесполого развития, описанный у Neurospora crassa ранее Брандтом, [3] на самом деле был обусловлен регуляцией циркадных часов . [4] В работе, опубликованной незадолго до прибытия Фельдмана в Калтех, Малкольм Л. Сарджент, Уинслоу Р. Бриггс и Доу О. Вудворд из Стэнфордского университета сообщили, что явное выражение ритма развития в конидиях было усилено у штамма Neurospora под названием Timex. [5] (Этот штамм содержал мутацию в локусе band (bd) , которая, как позже было показано, кодирует умеренно гиперактивный аллель ras-1, поэтому штаммы теперь известны как ras-1[bd] . [6] Поскольку ритмы в штаммах, включающих ras-1[bd], легче обнаружить, ras-1[bd] часто включается в штаммы, используемые для изучения циркадной биологии Neurospora . [6] ). Результаты циркадных часов Neurospora включают синтез каротиноидов , а также бесполое образование спор, наблюдаемое в гонных трубках, и последние данные свидетельствуют о том, что тысячи генов находятся под циркадным контролем. [7] [2]
Фельдман использовал нитрозогуанидин в качестве мутагена и использовал гоночные трубки для скрининга отдельных штаммов, выживших после мутагенеза, на предмет длительности их циркадного периода. Гоночные трубки представляют собой длинные полые стеклянные трубки, изогнутые с обоих концов, чтобы удерживать агаровую питательную среду. Когда Neurospora инокулируется на одном конце трубки, она будет расти на другом конце, и в постоянной темноте проявляется ежедневный циркадный цикл роста и развития. [8] Хотя скрининги Фельдмана были успешными, он не спешил публиковать результаты, поэтому идентификация мутантных генов frq [1], frq [2] и frq [3] не была опубликована до 1973 года. [9] В 1986 году frq был клонирован Джеем Данлэпом и его коллегами с использованием стратегии, которая включала длительную хромосомную прогулку и успешное применение тогда еще неиспробованной стратегии спасения аритмичного поведенческого мутанта путем трансформации экзогенной ДНК, возникающей в результате хромосомной прогулки. Успех этой стратегии и клонирования гена часов вызвал интерес к дальнейшему исследованию и пониманию циркадных часов N. crassa . [10] Позднее было показано , что экспрессия frq ритмически циклична; более того, когда были созданы штаммы Neurospora , в которых экспрессия frq могла управляться из области, отличной от резидентного гена дикого типа , было обнаружено, что FRQ подавляет свою собственную экспрессию и что никакой уровень постоянной экспрессии не может поддерживать циркадные часы. [11] Эти эксперименты были первыми, в которых манипулировали экспрессией гена часов с помощью средств, которые сами по себе не влияли на часы, и было установлено, что в основе циркадного осциллятора лежит ауторегуляторная отрицательная обратная связь, вызывающая циклическую экспрессию гена часов.
Отражая его роль как основного часового белка, удаление гена frq приводит к аритмичности, и в Neurospora единственная функция FRQ заключается в циркадных часах. Ген frq может быть активирован из двух различных цис-действующих последовательностей в его промоторе, дистального сайта, clock-box, используемого в контексте циркадной регуляции, и сайта, близкого к основному месту начала транскрипции, который используется для светоиндуцированной экспрессии (проксимальный светорегулирующий элемент или PLRE). Оба этих транскрипта frq обладают способностью кодировать два белка FRQ, длинную форму из 989 аминокислот (lFRQ) и короткую форму из 890 аминокислот (sFRQ); как lFRQ, так и sFRQ необходимы для сильной ритмичности, хотя часы способны сохраняться при определенных температурах, хотя и с более слабой ритмичностью, при наличии только одного из белков. [13] Выбор белка является результатом температурно-зависимого сплайсинга первичного транскрипта, так что он включает или исключает стартовый кодон ATG для lFRQ. [14] Две формы FRQ предоставляют часам Neurospora больший диапазон температур, в котором они могут работать оптимально. Повышение температуры приводит к увеличению экспрессии lFRQ, в то время как sFRQ не затрагивается. Более высокие температуры вызывают более эффективный сплайсинг интрона в месте начала трансляции. [7] Поскольку sFRQ благоприятствует более длительному периоду, чем lFRQ, свободно текущие ритмы в диком типе Neurospora несколько снижаются с повышением температуры. [7]
Было также показано, что FRQ взаимодействует с несколькими другими белками. Он постоянно взаимодействует с FRH (FRQ-взаимодействующая РНК- хеликаза ; важная DEAD-box -содержащая РНК-хеликаза в Neurospora ) с образованием комплекса FRQ/FRH (FFC). [15] [16] FRQ также стабильно взаимодействует с казеинкиназой 1 (CK1), хотя сила взаимодействия меняется в зависимости от времени суток. Известны дополнительные взаимодействия с другими киназами, включая PRD-4 (CHK2) [17] и казеинкиназу 2 (CKII).
Программы структурного прогнозирования предполагают, что только несколько областей FRQ, вероятно, будут складываться в стабильные структуры, и в соответствии с этим множество экспериментальных данных указывают на то, что FRQ является внутренне неупорядоченным белком . [18] В отсутствие своего партнера FRH FRQ очень нестабилен. Предполагается, что множество фосфорилирований, специфичных для времени суток, которые характеризуют FRQ, обеспечивают структуру этого в противном случае неупорядоченного белка. Не существует известной структуры домена для FRQ из-за его сильно неупорядоченной структуры.
Обычно белки демонстрируют смещение использования кодонов, при котором они с большей вероятностью выбирают синонимичные кодоны, которые более доступны в их пуле тРНК . Neurospora crassa имеет относительно сильное смещение использования кодонов по сравнению с S. cerevisiae , широко используемым организмом для анализа оптимизации кодонов. Однако, поскольку FRQ является внутренне неупорядоченным белком, он не демонстрирует смещения использования кодонов. Фактически, когда его кодоны оптимизируются, белок теряет свою функцию, и часы нарушаются. Это не относится к генам часов цианобактерий , kaiB и kaiC , которые оба привели к более надежной функции часов. [19]
Описание регуляции frq и FRQ требует описания цикла часов. Молекулярная основа циркадного осциллятора в Neurospora начинается с двух белковых комплексов. Один из них — FFC, комплекс отрицательного элемента, состоящий из двух копий FRQ, FRH и казеинкиназы 1, а также, вероятно, других менее сильно связанных белков. [16] Другой комплекс, который действует как положительный элемент в петле обратной связи, включает WC-1 и WC-2; они являются факторами транскрипции GATA , которые вместе образуют гетеродимерный WCC через свои домены PAS . [21] Когда WCC высвобождается из комплекса отрицательного элемента FFC во время субъективной ночи, он связывается с часовым боксом внутри промотора гена частоты ( frq ) и активирует транскрипцию frq . [22] [23] Недавно было показано, что гистон H3 лизин 36 метилтрансфераза , SET-2, отвечает за метилирование гена frq для установления состояния хроматина, которое позволит транскрипцию frq с помощью WCC. [24]
Белок частоты (FRQ) накапливается и постепенно фосфорилируется CKI, CKII и кальций/кальмодулин-зависимой киназой (CAMK-1) и дополнительными киназами, достигая своего пика примерно в середине субъективного дня. [25] [26] [27] Ингибиторы киназы уменьшают деградацию FRQ, предотвращая фосфорилирование. [28] FRQ фосфорилируется в более чем 100 местах на основе анализов in vitro с использованием масс-спектрометрии пептидов lFRQ. Эти места появляются в белке в высоковоспроизводимой манере, указывая на то, что время фосфорилирования важно. Более того, мутация мест показывает, что они работают в доменах, при этом некоторые фосфорилирования служат для удлинения периода, а другие для его сокращения. [16]
FRQ привлекает киназы , такие как казеинкиназа 1a (CK-1a), которые фосфорилируют WCC, хотя функция этих фосфорилирований неясна, поскольку гиперфосфорилированный WCC остается активным. В конце концов, репрессия ослабевает, когда FRQ становится настолько сильно фосфорилированным, что FFC больше не взаимодействует с WCC. Этот процесс происходит с периодичностью около 22 часов в постоянных условиях. [29] В более позднее время и с кинетикой, которая не влияет на циркадный цикл, этот гиперфосфорилированный FRQ деградирует через путь убиквитин/протеасома. Сильно фосфорилированный FRQ претерпевает конформационное изменение, которое обнаруживается белком FWD-1, который является частью лигазы E3 типа SCF. [30]
FRQ образует гомодимер через свой домен спиральной спирали, расположенный около N-конца. Эта димеризация необходима для взаимодействия FRQ с WCC и подавления его собственной экспрессии. [31] Удаление WCC приводит к неспособности образовывать гомодимер, что приводит к тому, что frq больше не регулируется отрицательно концентрацией FRQ. [31] Это приводит к аритмичности. [31]
Была предложена положительная обратная связь между FRQ и WCC, но подробности пока неизвестны. Считается, что WCC деградирует, когда он транскрипционно активен, и что предотвращение этого, вызванное FFC, позволяет накапливать WCC. [32] Было показано, что этот предложенный механизм, возможно, более сложен, поскольку FRQ может регулировать WC-1 и WC-2 независимо. [33] Недавно фактор транскрипции ADV-1 был идентифицирован как необходимый преобразователь выходных сигналов часов, включая циркадную ритмичность в генах, критически важных для слияния соматических клеток . [34]
Ген frq сильно индуцируется кратковременным воздействием света. Поскольку ядро часов основано на ритмической экспрессии frq , острая световая индукция обеспечивает простой способ сброса часов. [35] Часы млекопитающих сбрасываются светом почти идентичным механизмом, при этом транскрипты mPer1 индуцируются короткими вспышками света за пределами субъективного дня. Механизм mPer1 в часах млекопитающих имеет большее сходство с механизмом в Neurospora, чем с механизмом его гомолога в Drosophila , per . [36]
Прямая генетика использовалась для создания мутантов часов Neurospora с различными периодами конидий . Хотя было описано девять аллелей, происходящих из прямой генетики, анализ последовательности после клонирования frq показал, что frq [2], frq [4] и frq [6] разделяют одно и то же изменение основания, а frq [7] и frq [8] имеют одно и то же изменение основания, поэтому избыточные аллели были отброшены. [37] Периоды различных мутантов frq , которые возникли в результате прямых скринингов, следующие при измерении при 25 °C, хотя, поскольку frq [3] и frq [7] приводят к часам с измененной температурной компенсацией, периоды будут другими при других температурах:
Было обнаружено несколько идентифицируемых отдельных осцилляторов за пределами системы FRQ/WCC; однако ни один из этих осцилляторов без FRQ (FLO) не удовлетворяет характеристикам, чтобы быть классифицированным как циркадный осциллятор. [38] Было показано, что циркадный осциллятор FRQ-WCC (FWO) с помощью люциферазного отчета продолжает работать даже тогда, когда FLO (осциллятор CDO или дефицита холина, который контролирует конидиообразование в условиях ограничения холина) контролирует конидиообразование. [38] У мутанта frq[9] Neurospora crassa некомпенсированный температурой ритм развития конидиоспор все еще наблюдался в постоянной темноте (DD). [39] Период для мутантов без frq варьировался от 12 до 35 часов, но мог быть стабилизирован добавлением фарнезола или гераниола . Однако этот механизм не совсем понятен. [40] Хотя этот ритм без FRQ утратил некоторые характеристики часов, такие как температурная компенсация, температурных импульсов было достаточно, чтобы сбросить часы. [41] Другой FLO — это NRO или осциллятор нитратредуктазы, который появляется в условиях нитратного голодания и, как полагают, возникает из-за петель обратной связи в пути ассимиляции нитрата; он имеет длину периода около 24 часов, но не компенсируется температурой. [42] Короче говоря, есть много доказательств в поддержку осцилляторов без FRQ у Neurospora crassa. Один из способов рационализировать это — предположить, что многие из них являются «рабами» осциллятора частоты/белого воротничка; они не обладают всеми характеристиками циркадных часов сами по себе, потому что это обеспечивается FWO. [40] Однако ритмы в контролируемом часами гене-16 (ccg-16) связаны с FWO, но функционируют автономно, что свидетельствует о том, что Neurospora crassa содержит по крайней мере 2 потенциальных водителя ритма, но только один из них может быть сброшен светом и температурой, сохраняя при этом температурную компенсацию. [40] [43] Никогда не было доказано, что осциллятор без FRQ влияет на истинные циркадные часы. [43] Механизм и значение осцилляторов без FRQ (FLO) все еще изучаются.
Белок FRQ сохраняется в пределах Sordariacea , но расходится за пределы этой группы. [2] [44] Тем не менее, настоящие циркадные петухи на основе FRQ были обнаружены у организмов, отличных от Neurospora , как в пределах Sordariacea , например, у выдающегося грибкового патогена Botrytis, [45] , так и в таких далеких местах, как Pyronema [46] в пределах Pezizomycetes, рано расходящейся линии нитчатых аскомицетов. Frq был обнаружен даже в группе грибов, не относящихся к Dikarya. Обнаружение frq и сохраненного механизма циркадных часов внутри не относящихся к Dikarya, арбускулярных микоризных грибов расширило эволюционную историю этого гена в царстве грибов. [47] frq, по-видимому, очень быстро расходится в ходе своей эволюции. Одной из причин, по которой первичная аминокислотная последовательность FRQ расходится так быстро, может быть то, что это изначально неупорядоченный белок и, как следствие, у него отсутствуют структурные ограничения, ограничивающие изменения последовательности. [48] [18] Поскольку оптимизация кодонов гена frq приводит к нарушению функции циркадной петли обратной связи , frq демонстрирует неоптимальное смещение использования кодонов по всей его открытой рамке считывания в отличие от большинства других генов. [49] FRQ — изначально неупорядоченный белок, который не очень хорошо сохраняется даже у грибов. [50] Однако, в отличие от FRQ, WC-1 очень хорошо сохраняется. Он является основателем семейства фоторецепторов синего света, используемых во всем царстве грибов. Более того, он похож по структуре и функции на BMAL1 . Казеинкиназа 2 сохраняется в циркадных осцилляторах растений ( Arabidopsis ) и мух ( Drosophila ). [30] Похожая форма CKI необходима для деградации белков периода (PER) у дрозофилы и млекопитающих. [30] Ген slimb у дрозофилы ортологичен FWD1 у нейроспоры , оба из которых имеют решающее значение для деградации часового белка. [30] В целом, TTFL, обнаруженные у грибов и животных, имеют схожую регуляторную архитектуру с одношаговой отрицательной обратной связью, гетеродимерными активаторами PAS-PAS, которые консервативны, и белками отрицательных элементов, которые в значительной степени лишены структуры и гораздо менее консервативны. Похожая палитра киназ модифицирует часовые белки во всех случаях.