Джей Данлэп — американский хронобиолог и фотобиолог, внесший значительный вклад в область хронобиологии, исследуя основные механизмы циркадных систем у Neurospora , гриба, обычно используемого в качестве модельного организма в биологии, а также у мышей и моделей клеточных культур млекопитающих. Основные вклады Джея Данлэпа включают его работу по исследованию роли генов frq и wc clock в циркадной ритмичности, а также его руководство в координации всей коллекции геномных нокаутов для Neurospora . В настоящее время он является профессором молекулярной и системной биологии имени Натана Смита в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте . Он и его коллега Дженнифер Лорос были наставниками многочисленных студентов и постдокторантов, многие из которых в настоящее время занимают должности в различных академических учреждениях.
Родился в Ладлоу, штат Массачусетс , 9 мая 1952 года, Джей Данлэп вырос в Йорке, штат Пенсильвания, третьим из четырех детей. [1] Данлэп заинтересовался биохимической океанографией во время летней программы в старшей школе и решил продолжить этот интерес в колледже. Он окончил Вашингтонский университет со степенью бакалавра наук по океанографии и степенью бакалавра наук по химии в 1974 году. [1]
Первоначально Данлэп планировал изучать океанографию в аспирантуре. Однако после встречи с Джоном Вудлендом Гастингсом , который изучал циркадную регуляцию биолюминесценции у морских организмов, Данлэп решил изучать биологию в аспирантуре Гарвардского университета . Во время учебы у Гастингса Данлэп сменил область исследований на циркадную биологию . [1] [2]
Для получения постдокторской стипендии Данлэп поступил в Калифорнийский университет в Санта-Крузе и начал работать с Джерри Фельдманом, который успешно изолировал мутанты гена часов в Neurospora , которые имеют аномально длинные или короткие периоды циркадных колебаний . Данлэп не смог клонировать частоту , ген, который играет важную роль в отрицательной обратной связи транскрипции-трансляции (TTFL) , которая управляет циркадными ритмами в Neurospora , поскольку в лаборатории Санта-Круз не было молекулярных инструментов, необходимых для глубокого изучения молекулярной биологии Neurospora . [3] Данлэп изучил основные молекулярные методы, работая вместе с коллегами-аспирантами-биологами в других лабораториях. В какой-то момент Данлэп работал с Гарри Ф. Ноллером , известным биохимиком, чья лаборатория «неофициально усыновила» Данлэпа. [3]
В 1984 году Данлэп получил должность младшего преподавателя на кафедре биохимии в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте . Он стал профессором биохимии в 1994 году, прежде чем был назначен первым заведующим кафедрой генетики в 1999 году. В 2010 году Данлэп был назначен профессором Натана Смита, а в 2016 году он был назначен первым заведующим кафедрой молекулярной и системной биологии, которая включала генетику и другие кафедры. [4]
Тесно сотрудничая с лабораторией Дженнифер Лорос , исследования Данлэпа были в первую очередь сосредоточены на молекулярной основе циркадных ритмов, используя Neurospora в качестве модельной системы для дальнейшего понимания циркадных часов млекопитающих. Хотя мутации генов часов были также выявлены у Drosophila и Chlamydomonas , [1] Данлэп изучал Neurospora в своей постдокторской работе, поскольку в то время к этому виду был применим более широкий спектр биохимических и генетических инструментов. [3] Neurospora была простым модельным организмом и мощным инструментом для изучения молекулярной генетики; ее тогда неизвестные молекулярные часы представляли прекрасную возможность для исследования. [4]
На основе работы Данлэпа и других теперь считается, что часовые гены кодируют белки, которые участвуют в самоподдерживающейся отрицательной обратной связи : транскрипционные активаторы управляют экспрессией специфических мРНК часовых генов , которые транслируются в часовые белки, которые проникают в ядро и подавляют активность транскрипционных активаторов, управляющих экспрессией часовых генов. [5] Однако, когда Данлэп начал свои исследования в качестве доцента в 1984 году, часовые гены еще не были клонированы. Данлэп правильно предсказал, что отдельные клетки, включая клетки млекопитающих, могут действовать как автономные осцилляторы со своими собственными внутренними циркадными ритмами. [6]
Данлэп расшифровал циркадную систему, сформулировав и решив три проблемы клеточного метаболизма:
До принятия транскрипционных репортеров, таких как люцифераза , исследования циркадных часов Neurospora использовали ритмическое развитие бесполых спор (конидий) , анализируемое с помощью гоночной трубки. [7] Конидиальное производство достигает пика в субъективную ночь — поведенческий фенотип, отсутствующий в аритмичных штаммах. Во время своей дипломной работы Дженнифер Лорос наблюдала мутант frq 9 как рецессивный, аритмичный и фенотипически нулевой аллель в гене frq . [8] Ее наблюдение, в сочетании с возможностью трансформировать Neurospora с помощью экзогенной ДНК , послужило основой для новой стратегии клонирования frq , а именно путем трансформационного восстановления нулевого мутантного поведенческого фенотипа. Используя двунаправленный обход хромосомы, начинающийся с oli , гена в той же группе сцепления, что и frq , Данлэп и коллеги прошли более 200 кб по frq . [3] Местоположение frq было подтверждено в 1986 году путем трансформации космид в frq 9 и путем спасения циркадного ритма. Таким образом, frq был вторым клонированным часовым геном после Drosophila per . Кроме того, лаборатория вручную секвенировала примерно 9 кб и провела картирование транскриптов в геномной области frq ; результаты были опубликованы в Nature в 1989 году. [3] В последующей работе Данлэп и коллеги показали, что frq ритмически экспрессируется и смогли манипулировать экспрессией frq в достаточной степени, чтобы создать нулевой мутант . Они реализовали систему, в которой гетерологичный промотор — индуцированный таким образом, чтобы не влиять на часы — мог использоваться для управления регулируемой экспрессией frq . Используя эту систему, они продемонстрировали, что продукт frq подавляет свой собственный синтез; он был ауторегуляторным . Данлэп и коллеги наблюдали, что постоянная сверхэкспрессия frq приводит к аритмичности, и они определили фазу ритма часов как время, в которое клетка возвращается к нормальным уровням экспрессии frq . Они пришли к выводу в статье в журнале Science в 1994 году, что основной пейсмейкер Часы Neurospora регулируются посредством отрицательной обратной связи с помощью часовых белков, а frq определяет свою собственную экспрессию посредством саморегуляции посредством отрицательной обратной связи, демонстрируя, что внутриклеточная, саморегулирующаяся отрицательная обратная связь является основой циркадного осциллятора. [9] [10]
Работа Данлэпа над механизмом саморегуляции включала моделирование отрицательной обратной связи циркадных часов и обнаружение ролей и связей между активаторами (которые он идентифицировал как белки с доменами PAS ) и репрессорами (продуктами генов часов). [11] Кроме того, Данлэп продемонстрировал роль фосфорилирования белков в механизме часов и провел исследование, включающее роль этих белков (а именно казеинкиназы 2 ) в механизме температурной компенсации. В 2009 году Данлэп и его коллеги показали, что белок FRQ фосфорилируется в более чем 100 участках в высоковоспроизводимой и специфичной для времени суток манере [12] и что казеинкиназа 2 устанавливает и поддерживает температурную компенсацию в пределах циркадных часов. [13] Четыре года спустя, в 2013 году, Данлэп и его коллеги обнаружили, что FRQ является внутренне неупорядоченным белком , стабильность которого определяется его взаимодействием с партнерским белком FRH. Кроме того, Данлэп и его коллеги обнаружили, что ежедневное фосфорилирование FRQ управляет его способностью взаимодействовать с белками в комплексе отрицательных элементов. [14] Кинетика этих циркадных процессов, как обнаружил Данлэп, в значительной степени зависит от прогрессивного фосфорилирования FRQ. [15]
После идентификации frq как часового гена, обилие продукта которого имеет тенденцию быть изменчивым и ритмичным, Данлэп, Лорос и коллеги показали, как экологическая регуляция его экспрессии привела к пониманию молекулярной основы циркадной синхронизации светом: через индукцию экспрессии frq светом. [16]
В 1995 году Лорос и Данлэп работали над раскрытием молекулярной основы, лежащей в основе того, как свет сбрасывает часы, механизм, который позже был показан в совместной работе с Хитоши Окамурой , сохранялся у млекопитающих. [17] Суточный цикл уровней транскриптов frq в сочетании со способностью света остро индуцировать экспрессию frq , объяснял сброс света (прогрессы и задержки, наблюдаемые на кривой фазового отклика ). Если свет был предоставлен и индуцировал frq -мРНК , когда она поднималась до пиковых уровней (поздняя субъективная ночь), свет быстро доводил уровни frq -мРНК до пиковых значений, что приводило к продвижению. Если свет индуцировал frq -мРНК , когда ее уровни падали (ранняя субъективная ночь), frq -мРНК быстро возвращалась к пиковым уровням, вызывая задержку фазы. Результаты этого исследования привели к выводу, что световая индукция frq ответственна за фазоспецифические опережения и задержки, наблюдаемые у Neurospora , и дали общее объяснение тому, как однонаправленная реакция компонента часов на сигнал окружающей среды (свет) может привести к двунаправленной реакции часов, специфичной для времени суток (опережения или задержки): основа для циркадного увлечения. [2] Эти эксперименты в конечном итоге привели к всеобщему признанию увлечения посредством вызванных светом изменений в определенной переменной циркадного осциллятора, позднее наблюдавшихся у Drosophila и млекопитающих.
Механизм, посредством которого frq индуцируется светом, был неизвестен на момент объяснения увлечения, и исследования, направленные на идентификацию белков, ответственных за световую индукцию frq, привели к идентификации White Collar-1 и White Collar-2 как компонентов комплекса циркадного активатора. [18] Работа Джузеппе Мачино показала, что White Collar-1 связывается через домены PAS с White Collar-2 , создавая комплекс White Collar; Данлэп, Лорос и коллеги показали, как этот гетеродимерный комплекс является фактором транскрипции, который действует в темноте, чтобы управлять экспрессией frq , тем самым выступая в качестве активатора в петле циркадной отрицательной обратной связи. Это наблюдение связывало определенные биохимические активности, связывание ДНК и активацию транскрипции с известными часовыми белками, что позволяет сформулировать осциллятор как одношаговую петлю отрицательной обратной связи транскрипции-трансляции. [18] Позже, в 1997 году, было показано, что первый ген часов млекопитающих ( CLOCK ) кодирует белок, также имеющий домены PAS , а затем связывается через домены PAS с другим белком, BMAL1, снова образуя гетеродимерный белковый комплекс, который действовал как активатор транскрипции; похожие белки были идентифицированы в 1998 году у Drosophila . Это подтвердило общую модель для петель отрицательной обратной связи транскрипции-трансляции у грибов и животных: положительный элемент, состоящий из двух разных белков, взаимодействующих через домены PAS, управляет экспрессией отрицательных элементов, таких как FRQ или PER , которые в сочетании с другими белками подавляют активность гетеродимерных активаторов: отрицательная обратная связь. [19] Эти наблюдения способствовали присвоению Circadian Rhythms первого места в номинации Breakthrough of the Year in Science в 1997 году.
Хотя было установлено, что гетеродимерный фактор транскрипции WC-1 / WC-2 необходим для световой индукции frq , исследователи полагали, что WC-1 и WC-2 не играют прямой роли в процессе фоторецепции . Вместо этого предполагалось, что фактор транскрипции WC-1 / WC-2 является конечной целью каскада передачи сигнала, инициируемого действием света на отдельный фоторецептор синего света . В 2002 году Данлэп и его коллеги биохимически изучили WC-1 / WC-2 in vitro, чтобы показать, что WC-1 связывает FAD в качестве кофактора (также независимо показано И Лю), а анализ связывания с ДНК комплексом WC-1 / WC-2 показал, что свет приводит к структурным изменениям в гетеродимере. Дозовый ответ и спектр действия для этого структурного изменения in vitro в WC-1 зависели от FAD и соответствовали дозовому ответу и спектру действия in vivo для подавления циркадной полосатости светом, определенному Бриггсом и коллегами в 1967 году. Эти результаты показали, что WC-1 является фоторецептором синего света и циркадным фоторецептором; каскад передачи сигнала от фоторецептора к фактору транскрипции происходит внутри одного и того же белка. [21] [15] WC-1 является основателем семейства фоторецепторов синего света, общих для всех грибов . [22] Циркадные фоторецепторы были позднее идентифицированы у животных и зеленых растений и, как было показано, отличаются от WC-1 .
В 1989 году работа Данлэпа с Дженнифер Лорос привела к первому целевому скринингу генов, регулируемых циркадными часами, что проложило путь для систематического анализа выходных путей часов. [23] Термин «гены, контролируемые часами» (CCG) был придуман в этом исследовании. CCG определяются как гены, уровень экспрессии которых регулируется циркадными часами , но чья активность не влияет на работу часов. Циркадный контроль экспрессии генов в настоящее время широко считается основным средством, посредством которого часы контролируют биологию клеток, в которых они работают. Последующая работа расширила вселенную CCG в Neurospora , а затем и в клетках млекопитающих , [24] и выявила связь между циркадными и клеточными циклами, в которых часы регулируют реакцию на повреждение ДНК, которая, в свою очередь, может регулировать часы. [25] Поиски CCGs в конечном итоге привели к полному описанию циркадного транскриптома Neurospora , где до 40% генома ежедневно контролируется часами. [26]
Дипломная работа Джея Данлэпа в Гарварде с Дж. В. Хастингсом была сосредоточена на биолюминесценции в морском организме Gonyaulax . Их работа раскрыла структуру люциферина Gonyaulax . После очистки люциферазы они определили, что она регулируется посредством ежедневного синтеза и разрушения. [3] Это был один из первых ферментов, регулируемых часами, метод регуляции которого был определен в экспериментальных условиях. Одна часть механизма заключается в том, что Gonyaulax производит люциферин и люциферазу ночью, когда можно увидеть излучаемый свет, в то время как производство субстрата и белка уменьшается на рассвете. Осознание того, что полное понимание этого биохимического процесса также потребует комбинированного генетического подхода, привело Данлэпа к началу его изучения циркадных часов Neurospora . [ 2]
Данлэп и коллеги позже разработали биолюминесценцию в качестве репортера для экспрессии генов в Neurospora . До использования биолюминесценции единственным анализом ритмичности в Neurospora был суточный цикл бесполого развития ( конидиогенез ). В результате штаммы, несущие мутации, которые мешали развитию, не могли быть точно проанализированы на ритмичность. Данлэп вместе с Дженнифер Лорос , Аруном Мехрой и Ван Гучем адаптировали люциферазу светлячков для экспрессии в Neurospora , тем самым значительно расширив возможности анализа штаммов. [7] Люцифераза , управляемая промотером frq, является исключительно чувствительным репортером для основного осциллятора и использовалась для того, чтобы показать, что ритмы развития, не требующие frq, не являются истинно циркадными , [27] и что ежедневное фосфорилирование белка FRQ, но не ежедневный оборот белка FRQ, требуется для замыкания петли отрицательной обратной связи . [28] Новый метод, использованный Данлэпом и его коллегами для характеристики и использования гена люциферазы, улучшил экспрессию на 3 порядка логарифма и позволил исправить несколько ошибок в литературе по Neurospora . Данлэп и Лорос сотрудничали с Кассиусом Стевани, чтобы показать, что биолюминесценция базидиомицета (гриба) Neonothopanus gardneri регулируется циркадными ритмами посредством регулируемой экспрессии люциферазы , люциферина и необходимой редуктазы . [29] N. gardneri растет под пальмами в амазонских лесах, и считается, что ночная биолюминесценция используется грибом для привлечения насекомых ночью в качестве помощи для распространения спор. [30]
Данлэп и его коллеги внесли большой вклад в прогресс в использовании технологий в области молекулярной биологии . Эти методологические достижения имели важные последствия как для биологии грибов, так и для хронобиологии и их будущих направлений. Например, лаборатория Данлэпа разработала первую замену гена для Neurospora в 1991 году. Эти технологии, а также поддержка Данлэпа внесли большой вклад в секвенирование генома Neurospora (что было завершено в 2002 году). Впоследствии Данлэп и его команда улучшили замену генов. Он возглавил движение по удалению всех 10 000 генов в геноме Neurospora и построению карты полиморфизма одного нуклеотида высокой плотности . Наконец, Данлэп произвел революцию в роли экспрессии люциферазы , изучив смещение кодонов , и использует его последствия для Neurospora и других организмов. [7]
Данлэп продолжает исследовать циркадные часы, используя Neurospora и другие организмы, такие как Aspergillus fumigatus . [31] В результате проекта генома Neurospora crassa , [32] результаты которого были опубликованы в 2003 году, и разработки нокаутов для каждого гена, которые хранятся в Fungal Genetics Stock Center , Данлэп полагает, что молекулярная основа циркадных часов Neurospora может быть первой, которая будет полностью понята. Из-за высококонсервативной природы биологических часов, механизмы часов развивались относительно мало раз и схожи между видами. Знание систем Neurospora может привести к приложениям, имеющим отношение к здоровью человека. Циркадная природа клеточных процессов у людей может быть использована для более эффективного нацеливания на раковые клетки и лечения нарушений сна.
Данлэп также интересуется взаимодействием между биологическими часами и метаболическими процессами. В то время как циркадные ритмы управляют аспектами метаболизма, продукты метаболизма могут давать обратную связь внутренним часам организма. [33] Эта форма коммуникации может оказаться адаптивной особенностью биологических часов и обеспечить полезные ответы на изменения окружающей среды. Кроме того, Данлэп работает с Уильямом Кэнноном и Дженнифер Херли над разработкой математических моделей, описывающих функцию циркадных часов. В этой работе будут использоваться статистические методы для моделирования как реакций, происходящих в метаболизме , так и общих часов.
Данлэп также принимал участие в работе по изучению иерархической сети факторов транскрипции , которые управляют циркадным выходом. Основной осциллятор генерирует ритмическую активность гетеродимерного циркадного активатора ( WC-1 / WC-2 или CLOCK/BMAL1), но пиковая активность ограничена одним временем суток. Таким образом, в Neurospora основной осциллятор, который генерирует время, создает ритмическую активность гетеродимера WC-1 / WC-2 , которая достигает пика утром. WC-1 / WC-2 находится на вершине сети факторов транскрипции , где различные уровни регуляторов работают вместе, чтобы действовать как динамический фильтр для информации о времени, изменяя утреннюю пиковую активность WC-1 / WC-2 в сигнал, который может управлять экспрессией циркадных генов в любое время суток. Частью этого является фактор транскрипции ADV-1. [34] Этот фактор , обнаруженный в Neurospora , реагирует на свет и регулирует гены, участвующие в таких процессах, как рост клеток .
Недавно Данлэп рассмотрел эволюционную консервацию циркадных часов среди видов. В частности, он обнаружил, что белки, сохраняющиеся в механизмах биологических часов среди трех видов ( Drosophila melanogaster , Neurospora crassa и Mus musculus ), все демонстрируют высокие уровни внутреннего белкового беспорядка. Внутренне неупорядоченные белки не имеют стабильной вторичной структуры. В течение дня эти белки имеют разные уровни беспорядка. Изменяющиеся уровни беспорядка допускают стабильный циркадный ритм . Данлэп пришел к выводу, что, поскольку неупорядоченные белки так консервативны среди разных видов, эти белки должны быть необходимы для контроля циркадных ритмов между видами. [35]
В своей последней работе лаборатория Данлэпа исследовала регуляторы мРНК, кодирующих белок казеинкиназы 1; одним из таких регуляторов является РНК-связывающий белок, транслируемый с гена prd-2 . Они исследовали две мутации (созданной путем инверсии части гена prd-2 ) и обнаружили, что эти мутации радикально повлияли на уровни казеинкиназы . Эти мутации вызвали циркадные периоды, намного превышающие 24 часа. Он и его коллеги генетически увеличили уровни казеинкиназы 1 и обнаружили, что период восстанавливался, когда уровни казеинкиназы 1 увеличивались. Они пришли к выводу, что циркадный период зависит от уровней казеинкиназы 1. [36]
Во время работы Данлэпа в Санта-Крузе , одной из аспиранток биологического факультета, с которой он познакомился, была Дженнифер Лорос . Они завязали постоянные отношения и поженились 1 сентября 1984 года. У них двое детей. Когда он не занимается исследованиями, Данлэп любит заниматься садоводством. [3]
В настоящее время Джей Данлэп сотрудничает со следующими организациями:
Ранее он принимал участие в: