Ассимилируемый дрожжами азот или YAN представляет собой комбинацию свободного аминоазота (FAN), аммиака (NH 3 ) и аммония (NH 4 + ), которая доступна дрожжам, например, винным дрожжам Saccharomyces cerevisiae , для использования во время брожения . Помимо сбраживаемых сахаров глюкозы и фруктозы , азот является наиболее важным питательным веществом, необходимым для проведения успешного брожения, которое не заканчивается до предполагаемой точки сухости или не приводит к появлению посторонних запахов и связанных с этим дефектов вина . В связи с этим виноделы часто дополняют имеющиеся ресурсы YAN азотными добавками, такими как диаммонийфосфат (DAP). [1]
Однако добавление избыточного количества азота также может создать опасность, поскольку другие организмы, помимо полезных винных дрожжей, могут использовать питательные вещества. К ним относятся такие организмы, вызывающие порчу, как Brettanomyces , Acetobacter и молочнокислые бактерии из родов Lactobacillus и Pediococcus . Вот почему многие винодельни измеряют YAN после сбора урожая и дробления , используя один из нескольких методов, доступных сегодня, включая азот с помощью анализа о-фтальдиальдегида (NOPA), который требует использования спектрометра или метода титрования формолом . Знание YAN в сусле позволяет виноделам рассчитать правильное количество добавки, необходимое для прохождения ферментации, оставляя только «питательную пустыню» для любых организмов, вызывающих порчу, которые появятся впоследствии. [2]
Количество YAN, которое виноделы увидят в виноградном сусле, зависит от ряда компонентов, включая сорт винограда , подвой , почву виноградника и методы виноградарства (такие как использование удобрений и управление пологом ), а также климатические условия конкретных урожаев . [3]
YAN — это измерение основных органических (свободные аминокислоты) и неорганических (аммиак и аммоний) источников азота, которые могут усваиваться S. cerevisiae . В сусле и вине содержится несколько азотистых соединений, включая пептиды , более крупные белки , амиды , биогенные амины , пиридины , пурины и нуклеиновые кислоты , но они не могут напрямую использоваться дрожжами для метаболизма. В совокупности общее содержание азота в виноградном сусле может составлять от 60 до 2400 мг азота на литр, однако не весь этот азот будет усваиваться. [1] Отсутствие ферментов протеазы , которые расщепляют более крупные пептиды на более мелкие компоненты, которые могут работать вне клетки, ограничивает размер молекул, которые дрожжи могут использовать в качестве источника азота. [3] [4]
Количество YAN, которое виноделы увидят в виноградном сусле, зависит от ряда компонентов, включая сорт винограда, подвой, почвы виноградника и методы виноградарства (такие как использование удобрений и управление пологом), а также климатические условия конкретных урожаев. Заражения плесенью, такой как Botrytis cinerea (известная как благородная гниль, когда это желательно) могут снизить содержание аминокислот в виноградном сусле на целых 61%. [1] Некоторые регионы известны низким содержанием YAN, например, штат Вашингтон , где во время типичного урожая 90% тестируемого сусла будут ниже 400 мг N/л [5] и почти четверть будут ниже 150 мг N/л. [2]
В винограднике азот поглощается виноградной лозой в виде нитрата (NO 3 − ), аммония или мочевины , которые восстанавливаются до аммиака. В результате дополнительных реакций азот включается в глутамин и глутамат и в конечном итоге используется в синтезе других аминокислот и азотистых соединений. [1] После сбора урожая большая часть (около 80%) доступных азотистых соединений, содержащихся в винограде, концентрируется в кожице и семенах. Эти соединения высвобождаются в сусло в процессе дробления и во время мацерации /контакта с кожицей. [4] Даже после прессования до 80% первоначального содержания азота в каждой виноградной ягоде останется в выжимке . [ 3]
Из свободного аминоазота (FAN), входящего в состав YAN, наиболее распространены аминокислоты аргинин , пролин и глутамин, за которыми следуют аланин , треонин , серин и аспарагиновая кислота в гораздо меньших концентрациях [1], хотя следовые количества большинства известных аминокислот можно обнаружить в виноградном сусле. [2] Пролин обычно наиболее концентрирован и может составлять до 30% от общего количества аминокислот. [4] Точное количество FAN будет варьироваться и может составлять от 22 до 1242 мг азота/литр YAN, полученного из свободных аминокислот. [5]
В то время как аргинин, глутамин и другие аминокислоты быстро потребляются, часто на очень ранней стадии брожения, пролин вообще не потребляется дрожжами в обычных анаэробных условиях брожения. Это связано с тем, что один из ферментов, необходимых для его использования, — это оксидаза ( требующая молекулярного кислорода), а другой подавляется присутствием аммония (еще один источник усваиваемого азота, необходимого дрожжам) в сусле. Однако хорошо аэрированные заквасочные культуры , содержащие сусло, в которое не добавлялся диаммонийфосфат, обычно демонстрируют некоторое использование пролина до того, как вступят в силу анаэробные условия брожения. [1] Когда виноделы измеряют FAN, им нужно знать, включает ли их анализ пролин, так как это увеличит их измерение YAN. Шардоне и Каберне Совиньон — это два сорта Vitis vinifera , которые, как известно, имеют очень высокий уровень пролина, в то время как Рислинг и Совиньон Блан обычно имеют очень низкий уровень. [4]
Дрожжи транспортируют аминокислоты и небольшие пептиды (менее 5 аминокислотных остатков ) в клетку посредством активного транспортного процесса, который использует специализированные мембранные белки и разницу в градиенте pH кислого винного раствора (pH между 3-4) и почти нейтральным pH цитоплазмы внутри дрожжевых клеток. Протонные симпортные белки в мембране принимают аминокислоту, связанную с ионом водорода, который позже выталкивается клеткой через водородный ионный насос . Это энергозависимый процесс, который становится более энергетически невыгодным для дрожжевой клетки по мере того, как ферментация прогрессирует и уровни этанола увеличиваются, создавая «пассивную утечку» избыточных ионов водорода в клетку. Водородные ионные насосы клетки должны работать еще усерднее, чтобы поддерживать свой внутренний pH, поэтому она посылает сигнал симпортным белкам прекратить подачу других ионов. Это одна из причин, по которой поздние добавки азота на стадии ферментации малоэффективны или неэффективны, поскольку механизмы транспортировки азота в клетку отключаются. [4]
На протяжении всего процесса брожения аммоний является основной формой усваиваемого азота, доступного дрожжам. [1] Однако при дроблении сок может содержать от 0 до 150 мг/л солей аммония, в зависимости от того, сколько азота виноградная лоза получила в винограднике. [4]
В клетке неорганический аммиак и ионы аммония «фиксируются» посредством серии химических реакций, которые в конечном итоге дают органический источник азота глутамат. [2] Ион аммония также служит аллостерическим регулятором для одного из ферментов, используемых в гликолизе , и может также влиять на то, как дрожжевая клетка транспортирует глюкозу и фруктозу в клетку. [4] Было показано, что белки, используемые в основной системе транспорта глюкозы, имеют период полураспада 12 часов. В исследованиях, в которых дрожжевые клетки подвергались «аммиачному голоданию», вся система отключалась через 50 часов, что дает веские доказательства того, что недостаток аммиака/аммония может создать повышенный риск остановки ферментации. [3]
Глутатион (GSH: L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин) присутствует в высоких концентрациях до 10 мМ в дрожжевых клетках. Он играет ключевую роль в ответ на серное и азотное голодание. [6]
Аммиак не используется такими бактериями, как Acetobacter и молочнокислыми бактериями, используемыми в яблочно-молочном брожении . [2]
Усваиваемый азот является важным питательным веществом, необходимым винным дрожжам для полного завершения брожения с минимальным количеством нежелательных побочных продуктов (таких как соединения, такие как сероводород , которые могут создавать неприятные запахи). В ходе брожения дрожжи могут использовать до 1000 мг/л аминокислот, хотя часто гораздо меньше необходимого количества. [2] Дрожжи могут хранить аминокислоты во внутриклеточных вакуолях , а затем либо использовать их напрямую, включая их в белки, либо расщеплять их и использовать их углеродные и азотные компоненты по отдельности. [4]
При отсутствии азота дрожжи начнут отключаться и отмирать. Некоторые штаммы начнут расщеплять серосодержащие аминокислоты, такие как цистеин и метионин, высвобождая атом серы, который может соединяться с водородом, образуя сероводород ( H
2S ), который может придать вину запах тухлых яиц. Однако прямой корреляции между уровнями YAN и выработкой сероводорода нет, поскольку H 2 S может вырабатываться дрожжами даже при наличии большого количества азота, но при отсутствии других жизненно важных питательных веществ (таких как витамин пантотеновая кислота ). Существуют даже некоторые штаммы S. cerevisiae , которые вырабатывают H 2 S в ответ на избыток доступного азота (в частности, слишком много глутаминовой кислоты и аланина [3] ). Вот почему профилактический подход беспорядочного добавления азотных добавок к каждой ферментации может не дать желаемых результатов по предотвращению H 2 S. [2]
Уровень азота в вине может влиять на многие сенсорные аспекты полученного вина, включая синтез многих ароматических соединений. Сивушные спирты производятся путем деградации аминокислот, хотя в присутствии высоких уровней аммиака и мочевины их производство снижается. Когда доступный азот ограничен, уровни глицерина и трегалозы , которые могут влиять на вкусовые ощущения , выше. [3]
Количество необходимого YAN будет зависеть от целей винодела в отношении ферментации, в частности, от того, желательно ли дикое брожение или вино будет полностью ферментировано досуха. Состояние винограда и условия ферментации будут влиять на количество необходимого азота. Поврежденные, заплесневелые или зараженные серой гнилью ягоды обычно будут более истощены азотом (а также другими витаминными ресурсами), когда они поступают с виноградника, чем чистый, неповрежденный виноград. Это истощение может быть еще больше усугублено чрезмерным осветлением сусла и высоким содержанием сахара. Вина, ферментированные при более высоких температурах, как правило, прогрессируют более быстрыми темпами, требуя больше азота, чем при более длительной, более холодной ферментации. Также количество воздействия кислорода будет влиять на скорость поглощения азота дрожжами, когда вино ферментируется в полностью анаэробных условиях (например, многие белые вина в резервуарах из нержавеющей стали), требуя меньше азота, чем вина, ферментируемые в бочках или открытых ферментерах. [7]
Диапазон, предлагаемый энологами, варьируется от 150 мг/л YAN [8] до 400 мг азота на литр. [9] Некоторые исследования показали, что максимальные скорости ферментации могут быть достигнуты при YAN в диапазоне от 400 до 500 мг N/л. [10] Однако не все виноделы захотят, чтобы ферментация проходила на максимальной скорости (с точки зрения биомассы дрожжей, температуры и скорости) из-за влияния, которое это может оказать на другие сенсорные аспекты вина, такие как развитие аромата и сохранение фруктовости. [3]
Исследование, проведенное кафедрой виноградарства и энологии Калифорнийского университета в Дэвисе, показало, что рекомендации по оптимальному уровню азота для успешного завершения ферментации можно дать на основе уровня Брикса урожая , который был принят многими производителями дрожжей и питательных веществ. [11] [12]
Однако другие исследования показали, что успешная ферментация может проводиться и при уровнях YAN ниже этих рекомендаций, а также вялая/застрявшая ферментация может происходить даже тогда, когда уровни YAN соответствуют рекомендациям. [1]
Как и дрожжи, молочнокислые бактерии (LAB), используемые в яблочно-молочном брожении (обычно Oenococcus oeni ), требуют азота. Однако, в отличие от S. cerevisiae, LAB не могут использовать аммиак, а такие добавки, как диаммонийфосфат (DAP), не дают никаких питательных преимуществ. Виноделы, которые непреднамеренно используют DAP в качестве питательной добавки для своей инокуляции ЯМБ, рискуют предоставить питательные вещества вместо этого для порчи организмов, таких как Brettanomyces . [2]
В то время как некоторые виноделы инокулируют свои LAB питательными веществами, включающими азот, большинство питательных веществ, необходимых для ЯМФ, поступают из распада (или автолиза ) мертвых дрожжевых клеток. Кроме того, большинство бактерий, используемых в ЯМФ, обладают способностью вырабатывать внеклеточные протеазные ферменты, которые также могут расщеплять более крупные пептидные цепи на их базовые аминокислотные остатки, которые затем могут использоваться для метаболизма. [4]
Анализ азота с помощью о-фтальдиальдегида (NOPA) используется для измерения доступных первичных аминокислот в виноградном соке с использованием спектрофотометра , который может измерять при длине волны 335 нм . Поскольку анализ измеряет только первичные аминокислоты, полученные результаты не будут включать концентрации пролина или аммиака. [13] Пролин можно измерить отдельно с помощью анализа, который использует нингидрин для реакции с аминокислотой в присутствии муравьиной кислоты , что дает соединение, которое может быть поглощено при 517 нм. [1]
Титрование формолом , изобретенное датским химиком С.П.Л. Сёренсеном в 1907 году, использует формальдегид в присутствии гидроксида калия или натрия для измерения концентрации аминокислот и аммиака с помощью pH-метра . Реагенты также будут реагировать с пролином, что может дать немного более высокое измерение YAN, чем NOPA. [14] Формальный метод также имеет недостатки, связанные с использованием и утилизацией формальдегида, который является известным канцерогеном [15] , и высокотоксичного реагента хлорида бария . [1]
Аммиак и аммоний можно измерить с помощью ионселективного электродного зонда и pH-метра. [1]
Виноделы давно знали, что некоторые ферментации проходили более предсказуемо и «здоровее», если в партию добавляли выжимки (твердые кожицы, семена и остатки, оставшиеся после прессования ) из другого вина. Этот метод до сих пор используется для изготовления итальянского вина Ripasso . В Тоскане 14 века техника governo , используемая в некоторых из самых ранних Кьянти, включала добавление сушеного винограда в партию. [16] Хотя это также добавляло сахар, оба метода обеспечивали дополнительный азот и другие питательные вещества, все еще имеющиеся в кожице и семенах. [17]
Когда энологи стали лучше понимать науку брожения, азот был идентифицирован как основное питательное вещество, и виноделы еще в 1900-х годах начали добавлять соли аммония в свое сусло. [4] Мочевина также использовалась в качестве ранней азотной добавки, но исследования, связывающие ее с разработкой этилкарбамата, привели к ее запрету во многих странах, включая Соединенные Штаты с 1990 года. [2] [18] [19]
Существует множество типов азотных добавок, доступных для использования виноделами. Большинство из них представляют собой сложные формулы, включающие азот (из аминокислот или солей аммония) вместе с витаминами, минералами и другими факторами роста, и продаются под такими торговыми марками, как Go-Ferm , Superfood , Fermaid K (последние две также содержат некоторое количество DAP). [2] Аминокислоты можно добавлять непосредственно в сусло, хотя с 2010 года в Соединенных Штатах разрешено добавлять в сусло только глицин . [4]
Дрожжевые оболочки (или дрожжевые призраки) — это остатки клеточных стенок дрожжей, оставшиеся после коммерческого производства штаммов дрожжей, которые будут использоваться для инокуляции. Помимо предоставления источника усваиваемого азота из аминокислот, они также обеспечивают липиды и стерины , которые могут использоваться клетками для укрепления их плазматической мембраны, что позволяет усваивать другие источники азота. [2]
Азотные добавки, в частности DAP, стимулируют размножение дрожжей и могут значительно увеличить биомассу. Это может привести к ускорению скорости ферментации быстрее, чем того хочет винодел, а также повысить температуру ферментации из-за тепла, вырабатываемого дрожжами. Избыточная биомасса может также создать дефицит других питательных веществ для дрожжей, таких как витамины и стерины, из-за усиления конкуренции и может привести к образованию неприятных запахов (например, сероводорода) и даже к остановке ферментации. [1]
Избыточные уровни аминокислоты аргинина (более 400 мг/л), особенно ближе к концу ферментации, могут представлять риск увеличения производства этилкарбамата. Это происходит потому, что аргинин расщепляется на мочевину, которая может быть повторно поглощена и использована дрожжами или метаболизирована в аммиак. Однако мочевина также реагирует с этанолом , если она не полностью метаболизируется, что в сочетании с длительным воздействием (а также высокими температурами) может привести к производству эфира этилкарбамата . [1]
Однако наибольший риск избыточного добавления сусла заключается в том, что после завершения ферментации останется избыток азота и других питательных веществ. Это может привести к микробной нестабильности, поскольку организмы, вызывающие порчу, могут использовать эти избытки питательных веществ. [3]
В Соединенных Штатах Бюро по налогам и торговле алкоголем и табаком (TTB) ограничивает использование диаммонийфосфата в качестве азотной добавки до 968 мг/л (8 фунтов/1000 галлонов), что обеспечивает 203 мг N/л YAN. В Европейском союзе большинство стран следуют рекомендациям Международной организации винограда и вина (OIV), которая устанавливает предел в 300 мг/л. В Австралии предел основан на уровне неорганического фосфата с максимально допустимым пределом 400 мг/л фосфата. [2]
Поскольку большинство питательных добавок питают все живые микроорганизмы в сусле (желательные или нет), виноделы часто ждут, чтобы добавить питательные вещества, пока они не будут готовы инокулировать сусло желаемым штаммом S. cerevisiae . Производители, которые используют дикие ферменты, также могут подождать, пока добавки диоксида серы не убьют нежелательные микробы или начать подкормку раньше, потому что они хотели бы получить потенциальную сложность, которую другие микробы могут добавить вину. При добавлении азот обычно находится в форме аминокислот в сочетании с витаминами и минералами, чтобы помочь запустить ферментацию. [2]
Вскоре после инокуляции дрожжи начинают быстро потреблять доступный усваиваемый азот, при этом до 46% YAN полностью потребляется к началу полной ферментации. [1] Поскольку неорганический азот, такой как соли аммония в DAP, токсичен для дрожжей в высоких концентрациях, его никогда не добавляют во время инокуляции, когда биомасса вновь регидратированных дрожжей низкая. Многие виноделы разделяют дозировку DAP, причем первое добавление производится в конце лаг-фазы , когда дрожжи входят в период экспоненциального роста и начинается спиртовое брожение. В большинстве сусел это происходит примерно через 48–72 часа после инокуляции. Вторая доза затем часто добавляется примерно на трети пути через ферментацию сахара и часто до того, как уровень сахара достигнет 12-10 Брикс (6,5-5,5 Боме, 48,3-40,0 Эксле), потому что по мере ферментации дрожжевые клетки больше не могут переносить азот в клетку из-за растущей токсичности этанола, окружающего клетки. Это оставляет азот неиспользованным и доступным для порчи организмов, которые могут появиться позже. [2] [3]
.svg/1280px-Goblet_Glass_(Banquet).svg.png){kind=small}