.pdf/page1-1280px-How_viral_vector_COVID-19_Vaccines_Work_(English).pdf.jpg)
Вирусные векторы — это модифицированные вирусы, предназначенные для доставки генетического материала в клетки . Этот процесс может осуществляться внутри организма или в культуре клеток . Вирусные векторы широко применяются в фундаментальных исследованиях, сельском хозяйстве и медицине.
Вирусы развили специализированные молекулярные механизмы для транспортировки своих геномов в инфицированных хозяев — процесс, называемый трансдукцией . Эта возможность была использована для использования в качестве вирусных векторов, которые могут интегрировать свой генетический груз — трансген — в геном хозяина, хотя также широко используются неинтегративные векторы. Помимо сельскохозяйственных и лабораторных исследований, вирусные векторы широко применяются в генной терапии : по состоянию на 2022 год все утвержденные методы генной терапии были основаны на вирусных векторах. Кроме того, по сравнению с традиционными вакцинами , внутриклеточная экспрессия антигена , обеспечиваемая вирусными векторными вакцинами, обеспечивает более надежную иммунную активацию.
Многие типы вирусов были преобразованы в платформы вирусных векторов, от ретровирусов до цитомегаловирусов . Различные классы вирусных векторов сильно различаются по своим сильным сторонам и ограничениям, некоторые из них подходят для конкретных применений. Например, для генной терапии обычно используются относительно неиммуногенные и интегративные векторы, такие как лентивирусные векторы . Также были разработаны химерные вирусные векторы, такие как гибридные векторы, обладающие свойствами как бактериофагов , так и эукариотических вирусов.
Вирусные векторы были впервые созданы в 1972 году Полом Бергом . Дальнейшие разработки были временно остановлены из-за моратория на исследования рекомбинантной ДНК после конференции Асиломар и строгих правил Национальных институтов здравоохранения . После отмены, в 1980-х годах появилась первая генная терапия рекомбинантным вирусным вектором и первая вакцина с вирусным вектором. Хотя в 1990-е годы наблюдались значительные успехи в области вирусных векторов, клинические испытания имели ряд неудач, кульминацией которых стала смерть Джесси Гелсингера . Однако в 21 веке вирусные векторы пережили возрождение и были одобрены во всем мире для лечения различных заболеваний. Их вводили миллиардам пациентов, особенно во время пандемии COVID-19 .
Вирусы , инфекционные агенты , состоящие из белковой оболочки, окружающей геном , являются наиболее многочисленными биологическими объектами на Земле. [1] [2] Поскольку они не могут размножаться независимо, им приходится заражать клетки и захватывать механизм репликации хозяина, чтобы производить свои копии . [2] Вирусы делают это, встраивая свой геном, который может представлять собой ДНК или РНК , одноцепочечный или двухцепочечный , в хозяина. [3] Некоторые вирусы могут интегрировать свой геном непосредственно в геном хозяина в форме провируса . [4]
Эта способность переносить чужеродный генетический материал была использована генными инженерами для создания вирусных векторов, которые могут трансдуцировать желаемый трансген в клетку-мишень. [2] Вирусные векторы состоят из трех компонентов: [5] [6]
Вирусные векторы обычно используются в фундаментальных исследованиях и могут вводить гены, кодирующие, например, комплементарную ДНК , короткую шпильку РНК или системы CRISPR/Cas9 для редактирования генов. [8] Вирусные векторы используются для клеточного перепрограммирования, например, для индукции плюрипотентных стволовых клеток или дифференциации взрослых соматических клеток в различные типы клеток. [9] Исследователи также используют вирусные векторы для создания трансгенных мышей и крыс для экспериментов. [10] Вирусные векторы можно использовать для визуализации in vivo посредством введения репортерного гена . Кроме того, трансдукция стволовых клеток может позволить проследить клеточное происхождение во время развития . [9]
Генная терапия направлена на модуляцию или иное влияние на экспрессию генов посредством введения терапевтического трансгена. Генная терапия с использованием вирусных векторов может осуществляться путем доставки in vivo путем непосредственного введения вектора пациенту или ex vivo путем извлечения клеток из организма пациента, их трансдукции и последующего повторного введения модифицированных клеток пациенту. [11] Генная терапия с использованием вирусных векторов также может использоваться для растений, ориентировочно повышая продуктивность сельскохозяйственных культур или способствуя устойчивому производству. [12]
Существует четыре широких категории генной терапии: замена генов, подавление генов , добавление генов или редактирование генов. [11] [13] По сравнению с другими неинтегративными подходами генной терапии, трансгены, введенные вирусными векторами, обеспечивают экспрессию в течение многих лет. [14]
_(51611494786).jpg/1280px-201021_Llegada_de_la_vacuna_conytra_COVID_-19_S-putnik_V_(12)_(51611494786).jpg)
Для использования в качестве платформ для вакцин можно сконструировать вирусные векторы, несущие специфический антиген , связанный с инфекционным заболеванием или опухолевым антигеном . [15] [16] Обычные вакцины не подходят для защиты от некоторых патогенов из-за уникальных стратегий уклонения от иммунитета и различий в патогенезе. [17] Например, вакцины на основе вирусных векторов могут в конечном итоге обеспечить иммунитет против ВИЧ-1 и малярии . [18]
В то время как традиционные субъединичные вакцины вызывают гуморальный ответ, [19] вирусные векторы обеспечивают внутриклеточную экспрессию антигена, которая активирует пути MHC как прямыми, так и перекрестными путями презентации. Это вызывает сильный адаптивный иммунный ответ. [20] [21] Вирусные векторные вакцины также обладают внутренними адъювантными свойствами за счет активации врожденной иммунной системы и экспрессии молекулярных структур, связанных с патогеном , что исключает необходимость в каком-либо дополнительном адъюванте. [22] [15] В дополнение к более сильному иммунному ответу по сравнению с другими типами вакцин, вирусные векторы обеспечивают эффективную трансдукцию генов и могут воздействовать на определенные типы клеток. [19] Однако существовавший ранее иммунитет к вирусу, используемому в качестве вектора, может стать серьезной проблемой. [18]
До 2020 года вирусные векторные вакцины широко применялись, но ограничивались ветеринарной медициной. [22] В глобальном ответе на пандемию COVID-19 вирусные векторные вакцины сыграли фундаментальную роль и были введены миллиардам людей, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. [23]
Ретровирусы — РНК-вирусы с оболочкой — являются популярными платформами вирусных векторов из-за их способности интегрировать генетический материал в геном хозяина. [2] Ретровирусные векторы включают два основных класса: гамма-ретровирусные и лентивирусные векторы. Фундаментальное различие между ними заключается в том, что гамма-ретровирусные векторы могут инфицировать только делящиеся клетки, тогда как лентивирусные векторы могут инфицировать как делящиеся, так и покоящиеся клетки. [24] Примечательно, что ретровирусные геномы состоят из одноцепочечной РНК и должны быть преобразованы в провирусную двухцепочечную ДНК (процесс, известный как обратная транскрипция ), прежде чем она будет интегрирована в геном хозяина с помощью вирусных белков, таких как интеграза . [25]
Наиболее часто используемый гаммаретровирусный вектор представляет собой модифицированный вирус мышиного лейкоза Молони (MMLV), способный трансдуцировать различные типы клеток млекопитающих. Векторы MMLV были связаны с некоторыми случаями канцерогенеза. [26] Гаммаретровирусные векторы были успешно применены к гемопоэтическим стволовым клеткам ex vivo для лечения множества генетических заболеваний. [27]
Большинство лентивирусных векторов происходят из вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), хотя также использовались модифицированный вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус иммунодефицита кошек (FIV) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV). [24] Поскольку все функциональные гены удалены или иным образом мутированы, векторы не являются цитопатическими и могут быть сконструированы так, чтобы быть неинтегративными. [28]
Лентивирусные векторы способны нести до 10 т.п.н. чужеродного генетического материала, хотя по состоянию на 2023 год оптимальным было 3-4 т.п.н. [24] [28] По сравнению с другими вирусными векторами лентивирусные векторы обладают наибольшей трансдукционной способностью из-за образование трехцепочечного «клапана ДНК» во время ретротранскрипции одноцепочечной лентивирусной РНК в ДНК внутри хозяина. [28]
Лентивирусные векторы , хотя в основном не являются воспалительными, [29] могут индуцировать устойчивые адаптивные иммунные ответы с помощью цитотоксических Т-клеток типа памяти и Т-хелперных клеток . [30] Во многом это связано с высоким тропизмом лентивирусных векторов к дендритным клеткам , которые активируют Т-клетки. [30] Однако они могут инфицировать все типы антигенпрезентирующих клеток. [31] Более того, поскольку они являются единственными ретровирусными векторами, способными эффективно трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, это делает их наиболее перспективными платформами для вакцин. [31] Их также испытывали в качестве вакцин против рака. [32]
Лентивирусные векторы использовались в качестве терапии in vivo , например, для непосредственного лечения генетических заболеваний, таких как гемофилия B , и для лечения ex vivo , такого как модификация иммунных клеток при терапии CAR T-клетками . [24] В 2017 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило тисагенлеклейцел , лентивирусный вектор, для лечения острого лимфобластного лейкоза . [33]
Аденовирусы — это вирусы с двухцепочечной ДНК, принадлежащие к семейству Adenoviridae . [34] [35] Их относительно большие геномы, примерно 30-45 т.п.н., делают их идеальными кандидатами для генетической доставки; [34] новые аденовирусные векторы могут нести до 37 т.п.н. чужеродного генетического материала. [36] Аденовирусные векторы демонстрируют высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгенов и могут инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. [37]
Аденовирусный капсид, икосаэдр , имеет волокнистый «шишечек» в каждой из 12 вершин. Эти белки-волокна опосредуют проникновение в клетку, что сильно влияет на эффективность и способствует ее широкому тропизму, особенно через аденовирусные рецепторы Коксаки (CAR). [34] [37] Аденовирусные векторы могут вызывать устойчивые врожденные и адаптивные иммунные реакции. [38] Его сильная иммуногенность обусловлена, в частности, трансдукцией дендритных клеток (ДК), повышающей экспрессию молекул MHC I и II и активирующей ДК. [39] Они обладают сильным адъювантным эффектом, поскольку демонстрируют несколько молекулярных паттернов, связанных с патогенами . [38] Одним из недостатков является то, что ранее существовавший иммунитет к серотипам аденовируса является обычным явлением, что снижает эффективность. [37] [40] Использование аденовирусов шимпанзе может обойти эту проблему. [41]
Хотя активация как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа является препятствием для многих терапевтических применений, она делает аденовирусные векторы идеальной платформой для вакцин. [35] Глобальный ответ на пандемию COVID-19 привел к разработке и использованию нескольких аденовирусных векторных вакцин, включая «Спутник V» , вакцину «Оксфорд-АстраЗенека» и вакцину «Янссен» . [42]
Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой относительно небольшие одноцепочечные ДНК-вирусы, принадлежащие к Parvoviridae , и, как и лентивирусные векторы, AAV могут инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. [43] AAV, однако, требуют присутствия «вируса-помощника», такого как аденовирус или вирус простого герпеса, для репликации внутри хозяина, хотя он может делать это независимо, если индуцируется клеточный стресс или гены вируса-помощника переносятся вектор. [44]
AAV встраиваются в определенный участок генома хозяина, особенно в AAVS1 на хромосоме 19 у человека. Однако были разработаны рекомбинантные AAV, которые не интегрируются. Вместо этого они сохраняются в виде эписом, которые в неделящихся клетках могут сохраняться годами. [45] Одним из недостатков является то, что они не могут переносить большое количество иностранного генетического материала. Более того, необходимость экспрессии цепи, комплементарной одноцепочечному геному, может задерживать экспрессию трансгена. [45]
По состоянию на 2020 год было идентифицировано 11 различных серотипов AAV, различающихся структурой капсида и, следовательно, тропизмом. [43] Тропизм аденоассоциированных вирусных векторов можно адаптировать путем создания рекомбинантных версий из нескольких серотипов, что называется псевдотипированием. [43] Благодаря своей способности инфицировать и вызывать долговременные эффекты в неделящихся клетках, AAV широко используются в фундаментальных нейробиологических исследованиях. [46] После одобрения AAV Alipogene typarvovec в Европе в 2012 году [47] в 2017 году FDA одобрило первую генную терапию in vivo на основе AAV — voretigene neparvovec — которая лечила врожденный амавроз Лебера, связанный с RPE65 . [33] По состоянию на 2020 год 230 клинических исследований с использованием методов лечения на основе AAV либо продолжались, либо были завершены. [47]
Вирус коровьей оспы , или поксвирус , является еще одним многообещающим кандидатом для разработки вирусных векторов. [48] Его использование в качестве вакцины против оспы , о котором впервые сообщил Эдвард Дженнер в 1798 году, привело к искоренению оспы и продемонстрировало, что вакцина безопасна и эффективна для людей. [49] [48] Более того, производственные процедуры, разработанные для массового производства запасов вакцины против оспы, могут ускорить производство вирусных векторов осповакцины. [50]
Vaccinia обладает большим ДНК-геномом и, следовательно, может нести до 40 т.п.н. чужеродной ДНК. [49] [51] [52] [51] Кроме того, вакцина вряд ли интегрируется в геном хозяина, что снижает вероятность канцерогенеза. [51] Были разработаны аттенуированные штаммы – реплицирующиеся и нереплицирующиеся. [49] Несмотря на то, что он широко охарактеризован из-за его использования против оспы, по состоянию на 2019 год функция 50 процентов генома коровьей оспы была неизвестна. Это может привести к непредсказуемым последствиям. [52]
В качестве платформы для вакцин векторы осповакцины демонстрируют высокоэффективную экспрессию трансгена и создают надежный иммунный ответ. [50] Вирус быстродействующий: его жизненный цикл дает зрелое потомство коровьей оспы в течение 6 часов и имеет три механизма распространения вируса. [52] Кормовая корова также оказывает адъювантный эффект , активируя сильный врожденный ответ через толл-подобные рецепторы . [50] Однако существенным недостатком, который может снизить ее эффективность, является уже существующий иммунитет против коровьей оспы у тех, кто получил вакцину против оспы. [50]
Из девяти вирусов герпеса , поражающих человека, вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) является наиболее хорошо изученным и наиболее часто используемым в качестве вирусного вектора. [53] ВПГ-1 имеет несколько преимуществ: он обладает широким тропизмом и может доставлять терапевтические средства через специализированные системы экспрессии. [54] Более того, ВПГ-1 может преодолевать гематоэнцефалический барьер, если его остановить с медицинской точки зрения, что позволяет ему воздействовать на неврологические заболевания. Кроме того, ВПГ-1 не интегрируется в геном хозяина и может нести большое количество чужеродной ДНК. Первая особенность предотвращает вредный мутагенез, который может происходить с ретровирусными и аденоассоциированными векторами. Были созданы штаммы с дефицитом репликации. [55]
В 2015 году FDA одобрило талимоген лагерпарепвек — вектор ВПГ-1, запускающий противоопухолевый иммунный ответ, для лечения меланомы . [56] По состоянию на 2020 год векторы ВПГ-1 экспериментально применялись против сарком и рака головного мозга, толстой кишки, простаты и кожи. [57]
Цитомегаловирус (ЦМВ), герпесвирус, также был разработан для использования в качестве вирусного вектора. [58] ЦМВ может инфицировать большинство типов клеток и, таким образом, может размножаться по всему организму. Хотя вакцина на основе ЦМВ обеспечивала значительный иммунитет против ВИО, тесно связанного с ВИЧ, у макак, сообщалось, что по состоянию на 2020 год разработка ЦМВ как надежного переносчика все еще находилась на ранних стадиях. [59] [60]
Вирусы растений также представляют собой сконструированные вирусные векторы для использования в сельском хозяйстве, садоводстве и биологическом производстве. [61] Эти векторы использовались для широкого спектра применений: от повышения эстетических качеств декоративных растений до биологической борьбы с вредителями , быстрой экспрессии рекомбинантных белков и пептидов и ускорения селекции сельскохозяйственных культур. [62] Было предложено использовать сконструированные вирусы растений для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур и содействия устойчивому производству. [12]
Обычно используются реплицирующиеся вирусные векторы. [63] РНК-вирусы, используемые для однодольных растений, включают вирус полосатой мозаики пшеницы и вирус полосатой мозаики ячменя , а для двудольных - вирус табачной погремушки . Также использовались вирусы с одноцепочечной ДНК, такие как геминивирусы . [63] Вирусные векторы можно вводить растениям несколькими путями, называемыми «агроинокуляцией», в том числе путем втирания, биолистической системы доставки , агроспрей, агроинъекции и даже через насекомые-векторы . [64] [62] Однако наиболее распространенным подходом является доставка вирусных векторов, опосредованная Agrobacterium , при которой бактерии трансформируются плазмидной ДНК , кодирующей конструкцию вирусного вектора. [65]
Разработаны химерные векторы, сочетающие в себе как бактериофаги, так и эукариотические вирусы, которые способны инфицировать эукариотические клетки. [66] [67] В отличие от векторов на основе эукариотических вирусов, такие бактериофаговые векторы не обладают врожденным тропизмом к эукариотическим клеткам, что позволяет создавать их с высокой специфичностью к раковым клеткам. [68]
Векторы бактериофагов также широко используются в молекулярной биологии. [69] Например, бактериофаговые векторы используются в непрерывной эволюции с помощью фагов , способствуя быстрому мутагенезу бактерий. [70] Хотя бактериофаги ограничены микобактериофагами и некоторыми фагами грамотрицательных бактерий , их можно использовать для прямого клонирования. [71]
Методы производства вирусных векторов часто различаются в зависимости от вектора, хотя в большинстве случаев используются адгезивные или суспензионные системы с клетками млекопитающих. [72] Для производства вирусных векторов в небольших лабораторных условиях обычно используются статические системы культивирования клеток, такие как чашки Петри. [73]
Методы, используемые в лаборатории, трудно масштабировать, поэтому в промышленном масштабе требуются разные подходы. [72] Производители обычно используют большие одноразовые культуральные системы и биореакторы . [72] Сосуды, например, с газопроницаемыми поверхностями, используются для максимизации плотности клеточной культуры и количества преобразователей раствора. [72] В зависимости от сосуда вирусы могут быть выделены непосредственно из супернатанта или путем химического лизиса культивируемых клеток или микрофлюидизации. [74] В 2017 году The New York Times сообщила о наличии отставания в производстве инактивированных вирусов, что привело к задержке некоторых испытаний генной терапии на годы. [75]
В 1972 году биохимик Стэнфордского университета Пол Берг разработал первый вирусный вектор, включив ДНК фага лямбда в полиомавирус SV40 для заражения клеток почек, находящихся в культуре. [76] [77] [78] Последствия этого достижения обеспокоили таких ученых, как Роберт Поллак , который убедил Берга не трансдуцировать ДНК SV40 в E. coli с помощью бактериофагового вектора. Они опасались, что введение предположительно вызывающих рак генов SV40 приведет к созданию канцерогенных бактериальных штаммов. [79] [80] Эти и другие проблемы в развивающейся области рекомбинантной ДНК привели к конференции Асиломар 1975 года, на которой участники согласились на добровольный мораторий на клонирование ДНК . [81]
В 1977 году Национальные институты здравоохранения (NIH) выпустили официальные рекомендации, ограничивающие клонирование вирусной ДНК жесткими условиями BSL-4 , практически предотвращая такие исследования. Однако в 1979 году НИЗ ослабил эти правила, разрешив Бернарду Моссу разработать вирусный вектор, использующий коровью коровку . [81] В 1982 году Мосс сообщил о первом использовании вирусного вектора для временной экспрессии генов. [18] В следующем году Мосс использовал вектор коровьей оспы для экспрессии антигена гепатита В , создав первую вирусную векторную вакцину. [22]
В каждой области медицины есть свой определяющий момент, часто сопровождаемый человеческим лицом. От полиомиелита болел Джонас Солк . В результате экстракорпорального оплодотворения родилась Луиза Браун , первый в мире ребенок из пробирки. Операцию по трансплантации провел Барни Кларк , дантист из Сиэтла с искусственным сердцем. У СПИДа был Мэджик Джонсон . Теперь у генной терапии есть Джесси Гелсингер .
Хотя неудачная попытка генной терапии с использованием вируса папилломы Шопе дикого типа была предпринята еще в 1972 году, Мартин Клайн предпринял первую попытку генной терапии с использованием рекомбинантной ДНК в 1980 году. Она оказалась безуспешной. [83] [11] В 1990-е годы, по мере того как генетические заболевания были дополнительно охарактеризованы и технология вирусных векторов совершенствовалась, возник чрезмерный оптимизм в отношении возможностей этой технологии. Многие клинические испытания оказались неудачными. [84] Были некоторые успехи, такие как первая эффективная генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID); он использовал ретровирусный вектор. [11]
Однако во время клинических испытаний 1999 года в Пенсильванском университете Джесси Гелсингер умер от фатальной реакции на генную терапию на основе аденовирусных векторов. [82] [84] Это была первая смерть, связанная с какой-либо формой генной терапии. [85] В результате FDA приостановило все исследования генной терапии в Университете Пенсильвании и расследовало еще 60 исследований по всей территории США. [85] Анонимная редакционная статья в журнале Nature Medicine отметила, что это представляет собой «потерю невиновности» вирусных векторов. [84] Вскоре после этого репутация этой области была еще больше подорвана, когда у 5 детей, получавших генную терапию SCID, развилась лейкемия из-за проблемы с ретровирусным вектором. [84] [примечание 1]
Вирусные векторы пережили возрождение, когда их успешно использовали для доставки гемопоэтических генов ex vivo в клинических условиях. [86] В 2003 году Китай одобрил первую генную терапию для клинического использования: гендицин , аденовирусный вектор, кодирующий р53 . [87] [88] В 2012 году Европейский Союз впервые одобрил генную терапию — аденоассоциированный вирусный вектор. [89] Во время пандемии COVID-19 вирусные векторные вакцины использовались в беспрецедентных масштабах: их вводили миллиардам людей. [90] [22] По состоянию на 2022 год все одобренные методы генной терапии были основаны на вирусных векторах, и в стадии реализации было более 1000 клинических испытаний вирусных векторов, нацеленных на рак. [86]
В кино вирусные векторы часто изображаются как непреднамеренно вызывающие пандемию и цивилизационную катастрофу. [91] В фильме 2007 года «Я — легенда» изображен вирусный вектор, нацеленный на рак, который развязывает зомби-апокалипсис . [92] [93] Точно так же вирусная векторная терапия болезни Альцгеймера в «Восстании планеты обезьян» (2011) становится смертельным патогеном и вызывает восстание обезьян . Другие фильмы с участием вирусных векторов включают «Наследие Борна» (2012) и «Обитель зла: Последняя глава » (2016). [94]