В биохимии гликозидгидролазы (также называемые гликозидазами или гликозилгидролазами ) представляют собой класс ферментов , которые катализируют гидролиз гликозидных связей в сложных сахарах . [ 1] [2] Они являются чрезвычайно распространенными ферментами, с ролями в природе , включая деградацию биомассы, такой как целлюлоза ( целлюлаза ), гемицеллюлоза и крахмал ( амилаза ), в стратегиях антибактериальной защиты (например, лизоцим ), в механизмах патогенеза (например, вирусные нейраминидазы ) и в нормальной клеточной функции (например, тримминг- маннозидазы, участвующие в биосинтезе N -связанного гликопротеина ). Вместе с гликозилтрансферазами гликозидазы образуют основной каталитический аппарат для синтеза и разрыва гликозидных связей. [3]
Гликозидгидролазы встречаются практически во всех сферах жизни. У прокариот они встречаются как внутриклеточные, так и внеклеточные ферменты, которые в значительной степени участвуют в получении питательных веществ. Одним из важных проявлений гликозидгидролаз у бактерий является фермент бета-галактозидаза (LacZ), который участвует в регуляции экспрессии lac- оперона в E. coli . У высших организмов гликозидгидролазы встречаются в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи , где они участвуют в обработке N-связанных гликопротеинов , а также в лизосомах в качестве ферментов, участвующих в деградации углеводных структур. Дефицит определенных лизосомальных гликозидгидролаз может привести к ряду лизосомальных нарушений накопления, которые приводят к проблемам развития или смерти. Гликозидгидролазы встречаются в кишечном тракте и слюне , где они расщепляют сложные углеводы, такие как лактоза , крахмал , сахароза и трегалоза . В кишечнике они обнаруживаются как ферменты, закрепленные на гликозилфосфатидиле на эндотелиальных клетках . Фермент лактаза необходим для расщепления молочного сахара лактозы и присутствует в больших количествах у младенцев, но в большинстве популяций снижается после отлучения от груди или в младенчестве, что потенциально приводит к непереносимости лактозы во взрослом возрасте. [4] [5] Фермент O-GlcNAcase участвует в удалении групп N-ацетилглюкозамина из остатков серина и треонина в цитоплазме и ядре клетки. Гликозидгидролазы участвуют в биосинтезе и расщеплении гликогена в организме.
Гликозидгидролазы классифицируются в EC 3.2.1 как ферменты, катализирующие гидролиз O- или S-гликозидов. Гликозидгидролазы также можно классифицировать в соответствии со стереохимическим результатом реакции гидролиза: таким образом, их можно классифицировать как удерживающие или инвертирующие ферменты. [6] Гликозидгидролазы также можно классифицировать как экзо- или эндо-действующие, в зависимости от того, действуют ли они на (обычно невосстанавливающем) конце или в середине, соответственно, олиго/полисахаридной цепи. Гликозидгидролазы также можно классифицировать по методам, основанным на последовательности или структуре. [7]
Классификации на основе последовательностей являются одними из самых мощных методов прогнозирования для предложения функции для недавно секвенированных ферментов, для которых функция не была биохимически продемонстрирована. Система классификации гликозилгидролаз, основанная на сходстве последовательностей, привела к определению более 100 различных семейств. [8] [9] [10] Эта классификация доступна на веб-сайте CAZy (CArbohydrate-Active Enzymes). [7] [11] База данных предоставляет серию регулярно обновляемых классификаций на основе последовательностей, которые позволяют надежно предсказывать механизм (сохранение/инвертирование), остатки активного центра и возможные субстраты. Онлайн-база данных поддерживается CAZypedia, онлайн-энциклопедией углевод-активных ферментов. [12] На основе трехмерного структурного сходства семейства на основе последовательностей были классифицированы в «кланы» родственной структуры. Недавний прогресс в анализе последовательностей гликозидаз и сравнении трехмерных структур позволил предложить расширенную иерархическую классификацию гликозидгидролаз. [13] [14]
Инвертирующие ферменты используют два ферментных остатка, обычно карбоксилатные остатки, которые действуют как кислота и основание соответственно, как показано ниже для β-глюкозидазы . Продукт реакции имеет аксиальное положение на C1, но могут возникнуть некоторые спонтанные изменения конформации.
Сохраняющие гликозидазы работают по двухступенчатому механизму, каждый из которых приводит к инверсии для чистого сохранения стереохимии. Опять же, задействованы два остатка, которые обычно являются ферментативно-переносимыми карбоксилатами . Один действует как нуклеофил , а другой как кислота/основание. На первом этапе нуклеофил атакует аномерный центр, что приводит к образованию гликозильного ферментного промежуточного продукта, с кислотной помощью, предоставляемой кислым карбоксилатом. На втором этапе теперь депротонированный кислый карбоксилат действует как основание и помогает нуклеофильной воде гидролизовать гликозильный ферментный промежуточный продукт, давая гидролизованный продукт. Механизм проиллюстрирован ниже для лизоцима куриного яичного белка . [15]
Альтернативный механизм гидролиза с сохранением стереохимии может иметь место, который протекает через нуклеофильный остаток, связанный с субстратом, а не присоединенный к ферменту. Такие механизмы являются общими для некоторых N-ацетилгексозаминидаз, которые имеют ацетамидную группу, способную участвовать в соседней группе для образования промежуточного оксазолинового или оксазолинийового иона. Этот механизм протекает в два этапа через отдельные инверсии, что приводит к чистому сохранению конфигурации.
Вариант механизма участия соседней группы был описан для эндо-α-маннаназ, который включает участие 2-гидроксильной группы для образования промежуточного эпоксида. Гидролиз эпоксида приводит к чистому сохранению конфигурации. [16]
Гликозидгидролазы обычно называют по названию субстрата, на который они действуют. Так, глюкозидазы катализируют гидролиз глюкозидов, а ксиланазы катализируют расщепление гомополимера ксилана на основе ксилозы. Другие примеры включают лактазу , амилазу , хитиназу , сахаразу , мальтазу , нейраминидазу , инвертазу , гиалуронидазу и лизоцим .
Прогнозируется, что гликозидгидролазы будут играть все большую роль в качестве катализаторов в биоочистке в биоэкономике будущего. [17] Эти ферменты имеют множество применений, включая деградацию растительных материалов (например, целлюлазы для деградации целлюлозы до глюкозы, которая может использоваться для производства этанола ), в пищевой промышленности ( инвертаза для производства инвертного сахара, амилаза для производства мальтодекстринов) и в целлюлозно-бумажной промышленности ( ксиланазы для удаления гемицеллюлозы из бумажной массы). Целлюлазы добавляются в моющие средства для стирки хлопчатобумажных тканей и способствуют сохранению цвета путем удаления микроволокон, которые поднимаются с поверхности нитей во время ношения.
В органической химии гликозидгидролазы могут использоваться в качестве синтетических катализаторов для образования гликозидных связей либо посредством обратного гидролиза (кинетический подход), при котором положение равновесия меняется на противоположное; либо посредством трансгликозилирования (кинетический подход), при котором сохраняющиеся гликозидгидролазы могут катализировать перенос гликозильной группы от активированного гликозида к акцепторному спирту с образованием нового гликозида.
Были разработаны мутантные гликозидгидролазы, называемые гликосинтазами , которые могут достигать синтеза гликозидов с высоким выходом из активированных гликозильных доноров, таких как гликозилфториды. Гликозинтазы обычно образуются из удерживающих гликозидгидролаз путем направленного мутагенеза ферментативного нуклеофила в какую-либо другую менее нуклеофильную группу, такую как аланин или глицин. Другая группа мутантных гликозидгидролаз, называемых тиогликолигазами, может быть образована путем направленного мутагенеза кислотно-основного остатка удерживающей гликозидгидролазы. Тиогликолигазы катализируют конденсацию активированных гликозидов и различных тиолсодержащих акцепторов.
Различные гликозидгидролазы показали эффективность в разрушении матричных полисахаридов во внеклеточном полимерном веществе (EPS) микробных биопленок . [18] С медицинской точки зрения биопленки предоставляют инфекционным микроорганизмам ряд преимуществ по сравнению с их планктонными, свободно плавающими аналогами, включая значительно повышенную толерантность к антимикробным агентам и иммунной системе хозяина. Таким образом, разрушение биопленки может повысить эффективность антибиотиков и усилить иммунную функцию хозяина и способность к заживлению. Например, было показано, что комбинация альфа-амилазы и целлюлазы разрушает полимикробные бактериальные биопленки как из in vitro , так и из in vivo источников, и повышает эффективность антибиотиков против них. [19]
Известно много соединений, которые могут действовать, ингибируя действие гликозидгидролазы. В природе были обнаружены азотсодержащие, «сахарообразные» гетероциклы , включая дезоксинойиримицин , свайнсонин , австралин и кастаноспермин . Из этих природных шаблонов было разработано много других ингибиторов, включая изофагомин и дезоксигалактонойиримицин , а также различные ненасыщенные соединения, такие как PUGNAc. Ингибиторы, которые находятся в клинической практике, включают антидиабетические препараты акарбоза и миглитол , а также противовирусные препараты осельтамивир и занамивир . Было обнаружено, что некоторые белки действуют как ингибиторы гликозидгидролазы.
