Schizosaccharomyces pombe , также называемые « делящимися дрожжами », — это вид дрожжей , используемый в традиционном пивоварении и в качестве модельного организма в молекулярной и клеточной биологии . Это одноклеточный эукариот , клетки которого имеют форму палочек. Клетки обычно имеют диаметр от 3 до 4 микрометров и длину от 7 до 14 микрометров. Его геном , который составляет приблизительно 14,1 миллиона пар оснований, по оценкам, содержит 4970 генов , кодирующих белки, и по меньшей мере 450 некодирующих РНК . [2]
Эти клетки сохраняют свою форму, растя исключительно через клеточные кончики и делясь путем медиального деления, образуя две дочерние клетки одинакового размера, что делает их мощным инструментом в исследовании клеточного цикла .
Деление дрожжей было выделено в 1893 году Полом Линднером из восточноафриканского просяного пива . Название вида pombe на суахили означает пиво. Впервые оно было разработано в качестве экспериментальной модели в 1950-х годах: Урсом Леупольдом для изучения генетики, [3] [4] и Мердоком Митчисоном для изучения клеточного цикла. [5] [6] [7]
Пол Нерс , исследователь делящихся дрожжей, успешно объединил независимые школы генетики делящихся дрожжей и исследования клеточного цикла. Вместе с Ли Хартвеллом и Тимом Хантом Нерс получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2001 года за работу по регуляции клеточного цикла.
Последовательность генома S. pombe была опубликована в 2002 году консорциумом во главе с Институтом Сэнгера , став шестой моделью эукариотического организма, геном которого был полностью секвенирован . Исследователи S. pombe поддерживаются PomBase MOD ( база данных модельных организмов ). Это полностью раскрыло потенциал этого организма, идентифицировав множество генов, ортологичных человеческим генам - 70% на сегодняшний день, [8] [9] включая множество генов, вовлеченных в заболевания человека. [10] В 2006 году была опубликована субклеточная локализация почти всех белков в S. pombe с использованием зеленого флуоресцентного белка в качестве молекулярной метки. [11]
Schizosaccharomyces pombe также стал важным организмом в изучении клеточных реакций на повреждение ДНК и процесса репликации ДНК .
Было выделено около 160 природных штаммов S. pombe . Они были собраны из разных мест, включая Европу, Северную и Южную Америку и Азию. Большинство этих штаммов были собраны из культивируемых фруктов, таких как яблоки и виноград , или из различных алкогольных напитков , таких как бразильская кашаса . Известно также, что S. pombe присутствует в ферментированном чае, комбуче . [12] В настоящее время не ясно, является ли S. pombe основным ферментером или загрязнителем в таких напитках. Естественная экология дрожжей Schizosaccharomyces изучена недостаточно.
Schizosaccharomyces pombe был впервые обнаружен в 1893 году, когда группа, работающая в лаборатории Ассоциации пивоваров в Германии, изучала осадок, обнаруженный в просяном пиве, импортируемом из Восточной Африки, который придавал ему кислый вкус. Термин schizo, означающий «раскол» или «деление», ранее использовался для описания других Schizosaccharomycetes . Добавление слова pombe было связано с его изоляцией от восточноафриканского пива, поскольку pombe означает «пиво» на суахили. Стандартные штаммы S. pombe были выделены Урсом Леупольдом в 1946 и 1947 годах из культуры, которую он получил из коллекции дрожжей в Делфте , Нидерланды. Он был помещен туда А. Остервальдером под названием S. pombe var. liquefaciens после того, как он выделил его в 1924 году из французского вина (скорее всего, прогорклого) на Федеральной экспериментальной станции виноградарства и садоводства в Веденсвиле , Швейцария. Культура, используемая Урсом Леупольдом, содержала (помимо других) клетки с типами спаривания h90 (штамм 968), h- (штамм 972) и h+ (штамм 975). После этого были предприняты две крупные попытки изолировать S. pombe из фруктов, нектара или ферментаций: одна Флорензано и др. [13] в виноградниках западной Сицилии, а другая Гомесом и др. (2002) в четырех регионах юго-восточной Бразилии. [14]
Делящиеся дрожжи S. pombe относятся к отделу Ascomycota, который представляет собой самую большую и разнообразную группу грибов. Свободноживущие аскомицеты обычно встречаются в экссудатах деревьев, на корнях растений и в окружающей почве, на спелых и гниющих плодах, а также в ассоциации с насекомыми-переносчиками, которые переносят их между субстратами. Многие из этих ассоциаций являются симбиотическими или сапрофитными, хотя многочисленные аскомицеты (и их кузены базидиомицеты) представляют собой важные фитопатогены, которые поражают множество видов растений, включая коммерческие культуры. Среди родов аскомицетовых дрожжей делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces уникальны из-за отложения α-(1,3)-глюкана или псевдонигерана в клеточной стенке в дополнение к более известным β-глюканам и фактического отсутствия хитина. Виды этого рода также различаются по составу маннана, который показывает концевые сахара d-галактозы в боковых цепях их маннанов. S. pombe подвергается аэробной ферментации в присутствии избытка сахара. [15] S. pombe может расщеплять L-яблочную кислоту, одну из доминирующих органических кислот в вине, что делает их отличными от других штаммов Saccharomyces .
Дрожжевые виды Schizosaccharomyces pombe и Saccharomyces cerevisiae оба широко изучены; эти два вида разошлись примерно за 300–600 миллионов лет до настоящего времени, [16] и являются важными инструментами в молекулярной и клеточной биологии. Некоторые технические дискриминанты между этими двумя видами:
Продукты генов S. pombe (белки и РНК) участвуют во многих клеточных процессах, общих для всех форм жизни. Делящиеся дрожжи GO slim предоставляют категориальный обзор высокого уровня биологической роли всех продуктов генов S. pombe. [8]
Делящиеся дрожжи — это одноклеточный грибок с простым, полностью охарактеризованным геномом и быстрой скоростью роста. Он давно используется в пивоварении, выпечке и молекулярной генетике. S. pombe — это стержневая клетка диаметром около 3 мкм, которая растет исключительно за счет удлинения на концах. После митоза деление происходит путем образования перегородки, или клеточной пластинки, которая расщепляет клетку посередине.
Центральными событиями клеточного размножения являются дупликация хромосом, которая происходит в фазе S (синтетической), за которой следует сегрегация хромосом и ядерное деление (митоз) и деление клеток (цитокинез), которые в совокупности называются фазой M (митотической). G1 — это промежуток между фазами M и S, а G2 — это промежуток между фазами S и M. У делящихся дрожжей фаза G2 особенно продолжительна, и цитокинез (разделение дочерних клеток) не происходит, пока не запустится новая фаза S (синтетическая).
Делящиеся дрожжи управляют митозом с помощью механизмов, которые похожи на механизмы многоклеточных животных. Обычно они размножаются в гаплоидном состоянии. При голодании клетки противоположных типов спаривания (P и M) сливаются, образуя диплоидную зиготу, которая немедленно вступает в мейоз, чтобы произвести четыре гаплоидных споры. Когда условия улучшаются, эти споры прорастают, производя размножающиеся гаплоидные клетки. [19]
Здесь показаны общие черты цитокинеза. Место деления клетки определяется до анафазы. Анафазное веретено (зеленое на рисунке) затем располагается так, чтобы разделенные хромосомы находились по разные стороны от заданной плоскости деления.
У делящихся дрожжей, где рост управляет прогрессом через G2/M, мутация wee1 вызывает вступление в митоз при аномально малом размере, что приводит к более короткому G2. G1 удлиняется, что предполагает, что прогресс через Start (начало клеточного цикла) реагирует на рост, когда контроль G2/M теряется. Кроме того, клетки в плохих питательных условиях растут медленно и, следовательно, им требуется больше времени, чтобы удвоиться в размере и разделить. Низкий уровень питательных веществ также сбрасывает порог роста, так что клетка проходит клеточный цикл в меньшем размере. При воздействии стрессовых условий [тепло (40 °C) или окислитель перекись водорода] клетки S. pombe подвергаются старению , что измеряется увеличением времени деления клеток и увеличением вероятности гибели клеток. [20] Наконец, клетки делящихся дрожжей-мутантов wee1 меньше клеток дикого типа, но им требуется столько же времени, чтобы пройти клеточный цикл. Это возможно, потому что маленькие дрожжевые клетки растут медленнее, то есть их добавленная общая масса за единицу времени меньше, чем у нормальных клеток.
Предполагается, что пространственный градиент координирует размер клетки и вступление в митоз у делящихся дрожжей. [21] [22] [23] Протеинкиназа Pom1 (зеленая) локализуется в кортикальном слое клетки, с самой высокой концентрацией на кончиках клеток. Регуляторы клеточного цикла Cdr2, Cdr1 и Wee1 присутствуют в кортикальных узлах в середине клетки (синие и красные точки). a, В небольших клетках градиент Pom1 достигает большинства кортикальных узлов (синие точки). Pom1 ингибирует Cdr2, не давая Cdr2 и Cdr1 ингибировать Wee1 и позволяя Wee1 фосфорилировать Cdk1, тем самым инактивируя активность циклин-зависимой киназы (CDK) и предотвращая вступление в митоз. b, В длинных клетках градиент Pom1 не достигает кортикальных узлов (красные точки), и поэтому Cdr2 и Cdr1 остаются активными в узлах. Cdr2 и Cdr1 ингибируют Wee1, предотвращая фосфорилирование Cdk1 и тем самым приводя к активации CDK и митотическому входу. (Эта упрощенная схема не включает несколько других регуляторов активности CDK.)
Делящиеся дрожжи переключают тип спаривания с помощью события рекомбинации, связанной с репликацией, которое происходит во время фазы S клеточного цикла. Делящиеся дрожжи используют внутреннюю асимметрию процесса репликации ДНК для переключения типа спаривания; это была первая система, в которой было показано, что направление репликации требуется для изменения типа клетки. Исследования системы переключения типа спаривания привели к открытию и характеристике сайта терминации репликации RTS1, сайта паузы репликации MPS1 и нового типа хромосомного отпечатка, маркирующего одну из сестринских хроматид в локусе типа спаривания mat1. Кроме того, работа над областью молчащего донора привела к большим успехам в понимании формирования и поддержания гетерохроматина. [24]
Schizosaccharomyces pombe — это факультативный половой микроорганизм, который может спариваться при ограниченном количестве питательных веществ. [25] Воздействие на S. pombe перекиси водорода, агента, вызывающего окислительный стресс , приводящий к окислительному повреждению ДНК , сильно индуцирует спаривание и образование мейотических спор. [26] Это открытие предполагает, что мейоз, и в частности мейотическая рекомбинация, могут быть адаптацией для восстановления повреждений ДНК. [26] Подтверждением этой точки зрения является открытие того, что единичные повреждения оснований типа dU:dG в ДНК S. pombe стимулируют мейотическую рекомбинацию. [27] Для этой рекомбинации требуется урацил-ДНК-гликозилаза , фермент, который удаляет урацил из остова ДНК и инициирует репарацию эксцизии оснований. На основании этого открытия было высказано предположение, что для инициирования рекомбинации в S. pombe достаточно репарации эксцизионной основы урацила, абазического сайта или одноцепочечного разрыва . [ 27] Другие эксперименты с S. pombe показали, что неправильная обработка промежуточных продуктов репликации ДНК, т. е. фрагментов Оказаки , вызывает повреждения ДНК, такие как одноцепочечные разрывы или пробелы, и что они стимулируют мейотическую рекомбинацию. [28]
Делящиеся дрожжи стали заметной модельной системой для изучения основных принципов клетки, которую можно использовать для понимания более сложных организмов, таких как млекопитающие и, в частности, люди. [29] [30] Этот одноклеточный эукариот непатогенен и легко выращивается и обрабатывается в лаборатории. [31] [32] Делящиеся дрожжи содержат одно из наименьших количеств генов известной последовательности генома для эукариот и имеют всего три хромосомы в своем геноме. [33] Многие из генов, ответственных за деление клеток и клеточную организацию в делящейся дрожжевой клетке, также обнаружены в геноме человека. [31] [32] [34] Регуляция клеточного цикла и деление имеют решающее значение для роста и развития любой клетки. Консервативные гены делящихся дрожжей были тщательно изучены и стали причиной многих недавних биомедицинских разработок. [35] [36] Делящиеся дрожжи также являются практичной модельной системой для наблюдения за делением клеток, поскольку делящиеся дрожжи представляют собой одноклеточные эукариоты цилиндрической формы, которые делятся и размножаются путем медиального деления. [31] Это можно легко увидеть с помощью микроскопа. Делящиеся дрожжи также имеют чрезвычайно короткое время генерации, от 2 до 4 часов, что также делает их простой модельной системой для наблюдения и выращивания в лаборатории [32] Простота геномной структуры делящихся дрожжей, но сходство с геномом млекопитающих, простота манипулирования и возможность использования для анализа лекарств — вот почему делящиеся дрожжи вносят большой вклад в исследования в области биомедицины и клеточной биологии, а также в качестве модельной системы для генетического анализа. [32] [25] [30] [37] [38]
Schizosaccharomyces pombe часто используется для изучения деления и роста клеток из-за консервативных геномных областей, также наблюдаемых у людей, включая: гетерохроматиновые белки, большие точки начала репликации, большие центромеры, консервативные клеточные контрольные точки, функцию теломер, сплайсинг генов и многие другие клеточные процессы. [33] [39] [40] Геном S. pombe был полностью секвенирован в 2002 году, это был шестой эукариотический геном, который был секвенирован в рамках проекта «Геном». По оценкам, было обнаружено 4979 генов в трех хромосомах, содержащих около 14 Мб ДНК. Эта ДНК содержится в 3 разных хромосомах в ядре с пробелами в центромерных (40 кб) и теломерных (260 кб) областях. [33] После первоначального секвенирования генома делящихся дрожжей были секвенированы другие ранее несеквенированные области генов. Структурный и функциональный анализ этих участков генов можно найти в крупных базах данных делящихся дрожжей, таких как PomBase .
Было обнаружено, что сорок три процента генов в проекте «Геном» содержат интроны в 4739 генах. У делящихся дрожжей не так много дублированных генов по сравнению с почкующимися дрожжами, их содержится всего 5%, что делает делящиеся дрожжи прекрасной моделью генома для наблюдения и дает исследователям возможность создавать более функциональные подходы к исследованиям. Наличие большого количества интронов у S. pombe дает возможности для увеличения диапазона типов белков, производимых с помощью альтернативного сплайсинга, и генов, которые кодируют сопоставимые гены у человека. [33] Было секвенировано 81% из трех центромер делящихся дрожжей. Было обнаружено, что длина трех центромер составляет 34, 65 и 110 кб. Это в 300–100 раз больше, чем у центромер почкующихся дрожжей. Чрезвычайно высокий уровень консерватизма (97%) также наблюдается в области 1780 п.н. в областях DGS центромеры. Это удлинение центромер и его консервативные последовательности делают делящиеся дрожжи практической модельной системой для наблюдения за делением клеток и у людей из-за их сходства. [33] [41] [42]
PomBase [8] [43] сообщает, что более 69% генов, кодирующих белки, имеют человеческие ортологи, и более 500 из них связаны с человеческими заболеваниями. Это делает S. pombe прекрасной системой для изучения человеческих генов и путей заболеваний, особенно клеточного цикла и систем контрольных точек ДНК. [42] [44] [45] [46]
Геном S. pombe содержит мейотические драйверы и супрессоры драйва, называемые генами wtf. [47]
Биоразнообразие и эволюционное исследование делящихся дрожжей было проведено на 161 штамме Schizosaccharomyces pombe, собранных из 20 стран. [48] Моделирование скорости эволюции показало, что все штаммы произошли от общего предка, который жил примерно 2300 лет назад. Исследование также выявило набор из 57 штаммов делящихся дрожжей, каждый из которых отличался на ≥1900 SNP, [48] и все обнаруженные 57 штаммов делящихся дрожжей были прототрофными (способными расти на той же минимальной среде, что и эталонный штамм). [48] Ряд исследований генома S.pombe подтверждают идею о том, что генетическое разнообразие штаммов делящихся дрожжей немного меньше, чем у почкующихся дрожжей. [48] Действительно, только ограниченные вариации S.pombe встречаются при пролиферации в различных средах. Кроме того, количество фенотипических вариаций, выделяющихся у делящихся дрожжей, меньше, чем у S. cerevisiae. [49] Поскольку большинство штаммов делящихся дрожжей были выделены из сваренных напитков, для этого распространения нет никакого экологического или исторического контекста.
Репликация ДНК в дрожжах все больше изучается многими исследователями. Дальнейшее понимание репликации ДНК, экспрессии генов и консервативных механизмов в дрожжах может предоставить исследователям информацию о том, как эти системы работают в клетках млекопитающих в целом и в клетках человека в частности. [40] [50] [51] [52] Другие стадии, такие как клеточный рост и старение, также наблюдаются в дрожжах, чтобы понять эти механизмы в более сложных системах. [34] [53] [54] [55]
Клетки S. pombe в стационарной фазе подвергаются хронологическому старению из-за продукции активных форм кислорода , которые вызывают повреждения ДНК . Большинство таких повреждений обычно можно исправить с помощью репарации удаления оснований ДНК и репарации удаления нуклеотидов . [56] Дефекты в этих процессах восстановления приводят к снижению выживаемости.
Цитокинез является одним из компонентов деления клеток, который часто наблюдается у делящихся дрожжей. Хорошо сохранившиеся компоненты цитокинеза наблюдаются у делящихся дрожжей и позволяют нам рассматривать различные геномные сценарии и выявлять мутации. [45] [57] [58] Цитокинез является постоянным этапом и очень важен для благополучия клетки. [59] Образование сократительного кольца, в частности, тщательно изучается исследователями, использующими S. pombe в качестве модельной системы. Сократительное кольцо высококонсервативно как у делящихся дрожжей, так и у цитокинеза человека. [45] Мутации в цитокинезе могут приводить ко многим нарушениям работы клетки, включая гибель клетки и развитие раковых клеток. [45] Это сложный процесс деления клеток человека, но в S. pombe более простые эксперименты могут дать результаты, которые затем можно применять для исследований в модельных системах более высокого порядка, таких как люди.
Одной из мер предосторожности, которую клетка принимает для обеспечения точного деления клеток, является контрольная точка клеточного цикла. [60] [61] Эти контрольные точки гарантируют устранение любых мутагенов. [62] Это часто делается с помощью релейных сигналов, которые стимулируют убиквитинирование мишеней и задерживают цитокинез. [33] Без таких митотических контрольных точек мутагены создаются и реплицируются, что приводит к множеству клеточных проблем, включая гибель клеток или онкогенез, наблюдаемый в раковых клетках. Пол Нерс, Лиланд Хартвелл и Тим Хант были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2001 году. Они открыли ключевые консервативные контрольные точки, которые имеют решающее значение для правильного деления клетки. Эти результаты были связаны с раком и больными клетками и являются значимым открытием для биомедицины. [63]
Исследователи, использующие делящиеся дрожжи в качестве модельной системы, также изучают динамику и реакции органелл, а также возможные корреляции между дрожжевыми клетками и клетками млекопитающих. [64] [65] Заболевания митохондрий и различные системы органелл, такие как аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум, можно глубже понять, наблюдая за динамикой хромосом делящихся дрожжей, а также уровнями экспрессии белков и их регуляцией. [46] [51] [66] [67] [68] [69]
RecA и RecA-подобные белки необходимы для рекомбинационного восстановления двухцепочечных разрывов ДНК. [70] Пять RecA-подобных белков были описаны у S. pombe , которые связаны с мейотической рекомбинацией , и все пять гомологов RecA, по-видимому, необходимы для нормальных уровней мейотической рекомбинации. [70]
Однако существуют ограничения при использовании делящихся дрожжей в качестве модельной системы: их множественная лекарственная устойчивость. «Реакция MDR включает в себя сверхэкспрессию двух типов насосов оттока лекарств, семейства АТФ-связывающих кассет (ABC)... и главного суперсемейства посредников». [35] Пол Нерс и некоторые из его коллег недавно создали штаммы S. pombe, чувствительные к химическим ингибиторам и общим зондам, чтобы посмотреть, можно ли использовать делящиеся дрожжи в качестве модельной системы для исследования химических препаратов. [35]
Например, доксорубицин, очень распространенный химиотерапевтический антибиотик, имеет много неблагоприятных побочных эффектов. Исследователи ищут способы дальнейшего понимания того, как работает доксорубицин, наблюдая за генами, связанными с резистентностью, используя делящиеся дрожжи в качестве модельной системы. Были обнаружены связи между неблагоприятными побочными эффектами доксорубицина и метаболизмом хромосом и мембранным транспортом. Метаболические модели для нацеливания лекарств в настоящее время используются в биотехнологии, и в будущем ожидаются дальнейшие достижения с использованием модельной системы делящихся дрожжей. [36]
Делящиеся дрожжи легкодоступны, их легко выращивать и манипулировать для создания мутантов, и их можно поддерживать как в гаплоидном, так и в диплоидном состоянии. S. pombe обычно является гаплоидной клеткой, но при попадании в стрессовые условия, обычно дефицит азота, две клетки будут конъюгировать, образуя диплоид, который позже образует четыре споры в тетрадной сумке. [32] Этот процесс легко увидеть и наблюдать под любым микроскопом, и он позволяет нам рассмотреть мейоз в более простой модельной системе, чтобы увидеть, как работает это явление.
Таким образом, к этой модельной системе можно применить практически любой генетический эксперимент или метод, например: тетрадное рассечение, анализ мутагенов, трансформации и методы микроскопии, такие как FRAP и FRET. Новые модели, такие как Tug-Of-War (gTOW), также используются для анализа устойчивости дрожжей и наблюдения за экспрессией генов. Создание генов knock-in и knock-out довольно просто, а с секвенированием генома делящихся дрожжей эта задача очень доступна и хорошо известна. [71] [72]
{{cite journal}}
: Цитировать журнал требует |journal=
( помощь ){{cite book}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )