stringtranslate.com

Расширенный генетический код

Между новой парой тРНК/синтазы и существующими молекулами тРНК/синтазы не должно быть перекрестных помех, только с рибосомами.

Расширенный генетический код — это искусственно измененный генетический код , в котором один или несколько определенных кодонов были перераспределены для кодирования аминокислоты , которая не входит в число 22 обычных естественно кодируемых протеиногенных аминокислот . [1]

Основными предпосылками для расширения генетического кода являются:

Расширение генетического кода является областью исследований синтетической биологии , прикладной биологической дисциплины, целью которой является проектирование живых систем для полезных целей. Расширение генетического кода обогащает репертуар полезных инструментов, доступных науке.

В мае 2019 года исследователи в ходе эпохального проекта сообщили о создании новой синтетической (возможно, искусственной ) формы жизнеспособной жизни , варианта бактерии Escherichia coli , путем сокращения естественного числа 64 кодонов в бактериальном геноме до 61 кодона (устранив два из шести кодонов, кодирующих серин , и один из трех стоп-кодонов ) — из которых 59 использовались для кодирования 20 аминокислот . [2] [3]

Введение

Примечательно, что генетический код для всех организмов в основном одинаков, поэтому все живые существа используют один и тот же «генетический язык». [4] В целом, введение новых функциональных неприродных аминокислот в белки живых клеток нарушает универсальность генетического языка, что в идеале приводит к альтернативным формам жизни. [5] Белки производятся благодаря молекулам трансляционной системы, которые расшифровывают сообщения РНК в строку аминокислот. Трансляция генетической информации, содержащейся в информационной РНК (мРНК), в белок катализируется рибосомами . Транспортные РНК (тРНК) используются в качестве ключей для расшифровки мРНК в ее закодированный полипептид . тРНК распознает определенный трехнуклеотидный кодон в мРНК с дополнительной последовательностью, называемой антикодоном, на одной из ее петель. Каждый трехнуклеотидный кодон транслируется в одну из двадцати встречающихся в природе аминокислот. [6] Для любого кодона существует по крайней мере одна тРНК, а иногда несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту. Многие тРНК совместимы с несколькими кодонами. Фермент, называемый аминоацил-тРНК-синтетазой, ковалентно присоединяет аминокислоту к соответствующей тРНК. [7] Большинство клеток имеют разные синтетазы для каждой аминокислоты (20 или более синтетаз). С другой стороны, некоторые бактерии имеют менее 20 аминоацил-тРНК-синтетаз и вводят «недостающие» аминокислоты путем модификации структурно связанной аминокислоты ферментом аминотрансферазой . [ 8] Особенностью, используемой при расширении генетического кода, является тот факт, что аминоацил-тРНК-синтетаза часто распознает не антикодон, а другую часть тРНК, что означает, что если антикодон мутирует, кодирование этой аминокислоты изменится на новый кодон. В рибосоме информация в мРНК транслируется в конкретную аминокислоту, когда кодон мРНК совпадает с комплементарным антикодоном тРНК, и присоединенная аминокислота добавляется к растущей полипептидной цепи. Когда она высвобождается из рибосомы, полипептидная цепь сворачивается в функционирующий белок. [7]

Для того чтобы включить новую аминокислоту в генетический код, требуется несколько изменений. Во-первых, для успешной трансляции новой аминокислоты кодон, которому назначена новая аминокислота, не может уже кодировать одну из 20 природных аминокислот. Обычно используются бессмысленный кодон ( стоп-кодон ) или четырехосновный кодон. [6] Во-вторых, требуется новая пара тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы, они называются ортогональным набором. Ортогональный набор не должен пересекаться с эндогенными наборами тРНК и синтетазы, оставаясь функционально совместимым с рибосомой и другими компонентами аппарата трансляции. Активный сайт синтетазы модифицируется для принятия только новой аминокислоты. Чаще всего библиотека мутантных синтетаз проверяется на наличие той, которая заряжает тРНК желаемой аминокислотой. Синтетаза также модифицируется для распознавания только ортогональной тРНК. [6] Пара тРНК-синтетазы часто создается в других бактериях или эукариотических клетках. [9]

В этой области исследований 20 закодированных протеиногенных аминокислот называются стандартными аминокислотами или, альтернативно, природными или каноническими аминокислотами, в то время как добавленные аминокислоты называются нестандартными аминокислотами (NSAA) или неприродными аминокислотами (uAA; термин не используется в работах, посвященных природным непротеиногенным аминокислотам, таким как фосфосерин ), или неканоническими аминокислотами.

Нестандартные аминокислоты

Тирозин и некоторые синтетические варианты тирозина, используемые для маркировки белков. Различные варианты тирозина были синтезированы и могут быть включены в белки с использованием расширенного генетического кода. Все варианты, изображенные здесь, используются для химического или фотохимического связывания. Это означает, что включенный AA специфически реагирует либо с определенной химической группой (например, гидразиды, амины, азиды или тиолы), либо может быть активирован УФ-излучением для сшивания с другими AA.

Первым элементом системы является аминокислота, которая добавляется в генетический код определенного штамма организма.

Более 71 различных NSAA были добавлены к различным штаммам E. coli , дрожжей или клеток млекопитающих. [10] Из-за технических деталей (более простой химический синтез NSAA, меньше перекрестных помех и более легкая эволюция аминоацил-тРНК-синтазы) NSAA, как правило, больше стандартных аминокислот и чаще всего имеют фенилаланиновое ядро, но с большим разнообразием различных заместителей. Это обеспечивает большой репертуар новых функций, таких как маркировка (см. рисунок), в качестве флуоресцентного репортера ( например, дансилаланин) [11] или для производства трансляционных белков в E. coli с эукариотическими посттрансляционными модификациями ( например, фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин). [10] [12]

Основополагающая работа была представлена ​​Рольфом Фуртером, который в одиночку использовал пару дрожжевой тРНК Phe /PheRS для включения p-йодфенилаланина в E. coli . [13]

Неприродные аминокислоты, включенные в белки, включают аминокислоты, содержащие тяжелые атомы, для облегчения определенных рентгеновских кристаллографических исследований; аминокислоты с новыми стерическими/упаковочными и электронными свойствами; фотосшивающие аминокислоты, которые могут использоваться для исследования белок-белковых взаимодействий in vitro или in vivo; кето-, ацетилен-, азид- и боронатсодержащие аминокислоты, которые могут использоваться для селективного введения большого количества биофизических зондов, меток и новых химических функциональных групп в белки in vitro или in vivo ; окислительно-восстановительно-активные аминокислоты для исследования и модуляции переноса электронов; фотоизолированные и фотоизомеризуемые аминокислоты для фоторегуляции биологических процессов; металлсвязывающие аминокислоты для катализа и обнаружения ионов металлов; аминокислоты, которые содержат флуоресцентные или инфракрасные активные боковые цепи для исследования структуры и динамики белка; α-гидроксикислоты и D -аминокислоты в качестве зондов конформации остова и взаимодействий водородных связей; а также сульфатированные аминокислоты и миметики фосфорилированных аминокислот в качестве зондов посттрансляционных модификаций. [14] [15] [16]

Наличие нестандартной аминокислоты требует, чтобы организм либо импортировал ее из среды, либо биосинтезировал ее. В первом случае неприродная аминокислота сначала синтезируется химически в ее оптически чистой L -форме. [17] Затем она добавляется в среду роста клетки. [10] Обычно проверяется библиотека соединений для использования при включении новой аминокислоты, но это не всегда необходимо, например, различные транспортные системы могут обрабатывать неприродные аминокислоты с неполярными боковыми цепями. Во втором случае необходимо спроектировать биосинтетический путь, например, штамм E. coli , который биосинтезирует новую аминокислоту (п-аминофенилаланин) из основных источников углерода и включает ее в свой генетический код. [16] [18] [19] Другой пример: производство фосфосерина, естественного метаболита, и, следовательно, требуемое изменение его пути для увеличения его производства. [12]

Назначение кодона

Другим элементом системы является кодон, который следует присвоить новой аминокислоте. [ необходима цитата ]

Основная проблема для расширения генетического кода заключается в том, что нет свободных кодонов. Генетический код имеет неслучайную структуру, которая показывает явные признаки различных фаз изначальной эволюции, однако с тех пор он застыл на месте и сохраняется практически повсеместно. [20] Тем не менее, некоторые кодоны встречаются реже других. Фактически, в E. coli (и во всех организмах) использование кодонов не одинаково, но представлено несколько редких кодонов (см. таблицу), самым редким из которых является янтарный стоп-кодон (UAG).

Подавление янтарного кодона

Возможность переназначения кодонов была реализована Норманли и соавторами в 1990 году, когда жизнеспособный мутантный штамм E. coli прочитал стоп-кодон UAG («янтарный») . [22] Это стало возможным благодаря редкости этого кодона и тому факту, что фактор высвобождения 1 сам по себе заставляет янтарный кодон завершать трансляцию. Позже, в лаборатории Шульца , тРНКТир/тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) из Methanococcus jannaschii , архебактерии, [6] была использована для введения тирозина вместо STOP, значения янтарного кодона по умолчанию. [23] Это стало возможным из-за различий между эндогенными бактериальными синтезами и ортологичной архейной синтазой, которые не распознают друг друга. Впоследствии группа разработала ортологическую пару тРНК/синтаза для использования нестандартной аминокислоты O -метилтирозина. [6] За ним последовали более крупный нафтилаланин [24] и фотосшивающийся бензоилфенилаланин [25] , которые доказали потенциальную полезность системы.

Янтарный кодон — наименее используемый кодон в Escherichia coli , но его захват приводит к существенной потере приспособленности. Фактически, одно исследование обнаружило, что было по крайней мере 83 пептида, в значительной степени затронутых считыванием [26]. Кроме того, маркировка была неполной. Как следствие, было создано несколько штаммов для снижения стоимости приспособленности, включая удаление всех янтарных кодонов из генома. В большинстве штаммов E. coli K-12 (а именно Escherichia coli (молекулярная биология) для родословных штаммов) имеется 314 стоп-кодонов UAG. Следовательно, гигантский объем работы был направлен на их замену. Один подход, впервые предложенный группой профессора Джорджа Черча из Гарварда, был назван MAGE в CAGE: он основывался на мультиплексной трансформации и последующей рекомбинации штаммов для удаления всех кодонов UAG — последняя часть представляла собой точку остановки в первой статье [27] , но была преодолена. В результате был получен штамм E. coli C321.ΔA, в котором отсутствуют все кодоны UAG и RF1. [28] Это позволило провести эксперимент с этим штаммом, чтобы сделать его «зависимым» от аминокислоты бифенилаланина путем развития нескольких ключевых ферментов, которые структурно нуждаются в ней, тем самым подвергая его расширенный генетический код положительному отбору. [29]

Редкое переназначение смыслового кодона

В дополнение к янтарному кодону, редкие смысловые кодоны также рассматривались для использования. Кодон AGG кодирует аргинин, но штамм был успешно модифицирован, чтобы сделать его кодирующим для 6 -N -аллилоксикарбонил-лизина. [30] Другим кандидатом является кодон AUA, который необычен тем, что его соответствующая тРНК должна дифференцироваться от AUG, который кодирует метионин (изначально изолейцин, отсюда и его местоположение). Для того, чтобы сделать это, тРНК AUA имеет особое основание, лизидин. Удаление синтазы ( tilS ) стало возможным благодаря замене нативной тРНК на тРНК Mycoplasma mobile (без лизидина). Сниженная приспособленность является первым шагом к давлению на штамм, чтобы потерять все экземпляры AUA, что позволяет использовать его для расширения генетического кода. [31]

Штамм E. coli Syn61 представляет собой вариант, в котором все использования кодонов TCG (Ser), TCA (Ser), TAG (STOP) устранены с помощью синтетического генома (см. § Перекодированный синтетический геном ниже). Удалив ненужные гены тРНК и RF1, был получен штамм Syn61Δ3. Затем три освобожденных кодона становятся доступными для добавления трех специальных остатков, как показано в штамме «Syn61Δ3(ev4)». [32]

Четырехосновные (квадруплетные) кодоны

В то время как триплетные кодоны являются основой генетического кода в природе, запрограммированный сдвиг рамки +1 является естественным процессом, который позволяет использовать последовательность из четырех нуклеотидов (квадруплетный кодон) для кодирования аминокислоты. [33] Недавние разработки в области генной инженерии кода также показали, что квадруплетный кодон может быть использован для кодирования нестандартных аминокислот в экспериментальных условиях. [34] [35] [36] Это позволило одновременно использовать две неприродные аминокислоты, p -азидофенилаланин (pAzF) и N6-[(2-пропинилокси)карбонил]лизин (CAK), которые сшиваются друг с другом посредством циклоприсоединения Хьюсгена . [37] Квадруплетное декодирование в диких, неперекодированных штаммах очень неэффективно. [37] Это связано с тем, что взаимодействие между сконструированными тРНК с тройными комплексами или другими компонентами трансляции не такое благоприятное и сильное, как с эндогенными элементами трансляции клетки. [38] Эту проблему можно преодолеть путем специфической инженерии и эволюции тРНК, которая может декодировать квадруплетные кодоны в неперекодированных штаммах. [39] Таким образом можно получить до 4 различных квадруплетных ортогональных пар тРНК/тРНК-синтетазы. [40] Подход к декодированию квадруплетных кодонов также применялся для создания вакцины против ВИЧ-1. [41]

пара тРНК/синтетаза

Другим ключевым элементом является пара тРНК/синтетаза.

Ортологичный набор синтетазы и тРНК может быть мутирован и проверен посредством направленной эволюции для зарядки тРНК другой, даже новой, аминокислотой. Мутации в плазмиде, содержащей пару, могут быть введены с помощью подверженной ошибкам ПЦР или с помощью вырожденных праймеров для активного сайта синтетазы. Отбор включает несколько раундов двухэтапного процесса, где плазмида переносится в клетки, экспрессирующие хлорамфениколацетилтрансферазу с преждевременным янтарным кодоном. В присутствии токсичного хлорамфеникола и неприродной аминокислоты выжившие клетки переопределят янтарный кодон, используя ортогональную тРНК, аминоацилированную либо стандартными аминокислотами, либо неприродной. Чтобы удалить первую, плазмиду вставляют в клетки с геном барназы (токсичным) с преждевременным янтарным кодоном, но без неприродной аминокислоты, удаляя все ортогональные синтезы, которые не распознают специально неприродную аминокислоту. [6] Помимо перекодирования тРНК в другой кодон, они могут мутировать для распознавания четырехосновного кодона, что обеспечивает дополнительные свободные варианты кодирования. [42] В результате неприродная аминокислота приобретает разнообразные физико-химические и биологические свойства, что позволяет использовать ее в качестве инструмента для исследования структуры и функции белка или для создания нового или улучшенного белка для практических целей.

Разработано несколько методов отбора синтетазы, которая принимает только неприродную аминокислоту. Один из них заключается в использовании комбинации позитивного и негативного отбора.

Ортогональные множества в модельных организмах

Ортогональные пары синтетазы и тРНК, которые работают для одного организма, могут не работать для другого, поскольку синтетаза может неправильно аминоацилировать эндогенные тРНК или тРНК может быть неправильно аминоацилирована эндогенной синтетазой. В результате наборы, созданные на сегодняшний день, различаются между организмами.

В 2017 году было сообщено о мыши, созданной с расширенным генетическим кодом, которая может производить белки с неестественными аминокислотами. [56]

Ортогональные рибосомы

Подобно ортогональным тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазам (aaRS), ортогональные рибосомы были спроектированы для работы параллельно с естественными рибосомами. Ортогональные рибосомы в идеале используют другие транскрипты мРНК, чем их естественные аналоги, и в конечном итоге должны также опираться на отдельный пул тРНК. Это должно смягчить некоторую потерю приспособленности, которая в настоящее время все еще возникает из-за таких методов, как подавление кодонов Amber. Кроме того, ортогональные рибосомы могут быть мутированы и оптимизированы для определенных задач, таких как распознавание квадруплетных кодонов. Такая оптимизация невозможна или крайне невыгодна для естественных рибосом.

о-Рибосома

В 2005 году были опубликованы три набора рибосом, которые не распознавали естественную мРНК, а вместо этого транслировали отдельный пул ортогональной мРНК (о-мРНК). [57] Это было достигнуто путем изменения последовательности распознавания мРНК, последовательности Шайна-Дальгарно , и соответствующей последовательности распознавания в 16S рРНК рибосом, так называемой последовательности Анти-Шайн-Дальгарно. Таким образом, спаривание оснований, которое обычно теряется, если любая из последовательностей мутирует, остается доступным. Однако мутации в 16S рРНК не ограничивались очевидно спаривающимися основаниями нуклеотидов классической последовательности Анти-Шайн-Дальгарно.

Рибо-X

В 2007 году группа Джейсона В. Чина представила ортогональную рибосому, оптимизированную для подавления янтарного кодона. [58] 16S рРНК была мутирована таким образом, что она связывала фактор высвобождения RF1 слабее, чем естественная рибосома. Эта рибосома не устранила проблему пониженной приспособленности клеток, вызванную подавленными стоп-кодонами в природных белках. Однако благодаря улучшенной специфичности она значительно повысила выход правильно синтезированного целевого белка (с ~20% до >60% процентов для одного подавленного янтарного кодона и с <1% до >20% для двух янтарных кодонов).

Рибо-Q

В 2010 году группа Джейсона В. Чина представила еще более оптимизированную версию ортогональной рибосомы. Ribo-Q — это 16S рРНК, оптимизированная для распознавания тРНК, которые имеют квадруплетные антикодоны для распознавания квадруплетных кодонов вместо естественных триплетных кодонов. [37] При таком подходе количество возможных кодонов увеличивается с 64 до 256. Даже с учетом различных стоп-кодонов, более 200 различных аминокислот потенциально могут быть закодированы таким образом.

Сшивание рибосом

Все ортогональные рибосомы, описанные выше, фокусируются на оптимизации 16S рРНК. До сих пор эта оптимизированная 16S рРНК объединялась с естественными большими субъединицами для формирования ортогональных рибосом. Если 23S рРНК, основной РНК-компонент большой рибосомной субъединицы, также должна быть оптимизирована, необходимо было убедиться, что не будет перекрестных помех при сборке ортогональных и естественных рибосом (см. рисунок X B). Чтобы гарантировать, что оптимизированная 23S рРНК будет формироваться в рибосомы только с оптимизированной 16S рРНК, две рРНК были объединены в один транскрипт. [59] Вставляя последовательность для 23S рРНК в петлевую область последовательности 16S рРНК, обе субъединицы по-прежнему принимают функционирующие складки. Поскольку две рРНК связаны и, таким образом, находятся в постоянной близости, они предпочтительно связывают друг друга, а не другие свободно плавающие рибосомные субъединицы. [ необходима цитата ]

Сконструированный пептидилтрансферазный центр

В 2014 году было показано, что путем изменения центра пептидилтрансферазы 23S рРНК можно создать рибосомы, которые используют ортогональные пулы тРНК. [60] 3'-конец тРНК повсеместно сохраняется как CCA. Два цитидиновых основания спариваются с двумя гуанинами 23S рРНК, чтобы связать тРНК с рибосомой. Это взаимодействие необходимо для трансляционной точности. Однако, путем комутации связывающих нуклеотидов таким образом, чтобы они все еще могли спариваться с основаниями, трансляционная точность может быть сохранена. 3'-конец тРНК мутирует с CCA на CGA, в то время как два цитидиновых нуклеотида в A- и P-сайтах рибосом мутируют в гуанидин. Это приводит к рибосомам, которые не принимают встречающиеся в природе тРНК в качестве субстратов, и к тРНК, которые не могут быть использованы в качестве субстрата естественными рибосомами.
Чтобы эффективно использовать такие тРНК, их необходимо аминоацилировать специфическими ортогональными aaRS. Большинство встречающихся в природе aaRS распознают 3'-конец соответствующей им тРНК. [61] [62] aaRS для этих 3'-мутированных тРНК пока недоступны. До сих пор было показано, что эта система работает только в условиях трансляции in vitro , где аминоацилирование ортогональной тРНК достигалось с использованием так называемых «флексизимов».Флексизимы — это рибозимы с активностью тРНК-аминоацилирования. [63]

Приложения

С расширенным генетическим кодом неприродная аминокислота может быть генетически направлена ​​в любой выбранный сайт в интересующем белке. Высокая эффективность и точность этого процесса позволяет лучше контролировать размещение модификации по сравнению с модификацией белка после трансляции, которая, в общем, будет нацелена на все аминокислоты одного типа, такие как тиоловая группа цистеина и аминогруппа лизина. [64] Кроме того, расширенный генетический код позволяет проводить модификации in vivo . Возможность сайт-специфического направления синтезированных в лаборатории химических фрагментов в белки позволяет проводить многие типы исследований, которые в противном случае были бы чрезвычайно трудными, такие как:

Будущее

Расширение генетического кода все еще находится в зачаточном состоянии. Текущая методология использует только одну нестандартную аминокислоту в то время, когда в идеале можно было бы использовать несколько. Фактически, группа Джейсона Чина недавно побила рекорд по генетически перекодированному штамму E. coli , который может одновременно включать до 4 неестественных аминокислот. [73] Более того, были разработки в области программного обеспечения, которое позволяет комбинировать ортогональные рибосомы и неестественные пары тРНК/РС для улучшения выхода белка и точности. [73]

Перекодированный синтетический геном

Одним из способов кодирования множества неестественных аминокислот является синтез переписанного генома. [74] В 2010 году за 40 миллионов долларов был создан организм Mycoplasma laboratorium , который контролировался синтетическим, но не перекодированным геномом. [75] Первый генетически перекодированный организм был создан в результате сотрудничества лабораторий Джорджа Чёрча и Фаррена Айзекса, когда дикий тип E. coli MG1655 был перекодирован таким образом, что все 321 известный стоп-кодон UAG были заменены синонимичными кодонами UAA, а фактор высвобождения 1 был отключен, чтобы устранить взаимодействие с экзогенным стоп-кодоном и улучшить синтез неестественного белка. [28] В 2019 году была создана Escherichia coli Syn61 с 4-мегабазовым перекодированным геномом, состоящим всего из 61 кодона вместо естественных 64. [3] [2] Помимо исключения использования редких кодонов, необходимо повысить специфичность системы, поскольку многие тРНК распознают несколько кодонов [74]

Расширенный генетический алфавит

Другой подход заключается в увеличении числа азотистых оснований для повышения кодирующей способности.

Неестественная пара оснований (UBP) — это спроектированная субъединица (или нуклеиновая основа ) ДНК , которая создается в лаборатории и не встречается в природе. Демонстрация UBP была достигнута in vitro группой Ичиро Хирао в институте RIKEN в Японии. В 2002 году они разработали неестественную пару оснований между 2-амино-8-(2-тиенил)пурином (s) и пиридин-2-оном (y), которая функционирует in vitro в транскрипции и трансляции для сайт-специфического включения нестандартных аминокислот в белки. [76] В 2006 году они создали 7-(2-тиенил)имидазо[4,5-b]пиридин (Ds) и пиррол-2-карбальдегид (Pa) в качестве третьей пары оснований для репликации и транскрипции. [77] Впоследствии Ds и 4-[3-(6-аминогексанамидо)-1-пропинил]-2-нитропиррол (Px) были обнаружены как пара с высокой точностью в ПЦР-амплификации. [78] [79] В 2013 году они применили пару Ds-Px для генерации ДНК-аптамеров путем отбора in vitro (SELEX) и продемонстрировали, что расширение генетического алфавита значительно увеличивает сродство ДНК-аптамеров к целевым белкам. [80]

В 2012 году группа американских ученых во главе с Флойдом Ромесбергом, химиком-биологом из Научно-исследовательского института Скриппса в Сан-Диего, Калифорния, опубликовала информацию о том, что его команда разработала неестественную пару оснований (UBP). [81] Два новых искусственных нуклеотида или неестественная пара оснований (UBP) были названы « d5SICS » и « dNaM ». Более технически, эти искусственные нуклеотиды , несущие гидрофобные азотистые основания , имеют два слитых ароматических кольца , которые образуют комплекс (d5SICS–dNaM) или пару оснований в ДНК. [82] [83] В 2014 году та же группа из Научно-исследовательского института Скриппса сообщила, что они синтезировали участок кольцевой ДНК, известный как плазмида, содержащий естественные пары оснований TA и CG вместе с наиболее эффективным UBP, разработанным лабораторией Ромесберга, и вставили его в клетки обычной бактерии E. coli , которая успешно реплицировала неестественные пары оснований на протяжении нескольких поколений. [84] Это первый известный пример того, как живой организм передает расширенный генетический код последующим поколениям. [82] [85] Это было частично достигнуто путем добавления поддерживающего гена водоросли, который экспрессирует транспортер нуклеотидтрифосфата , который эффективно импортирует трифосфаты как d5SICSTP, так и dNaMTP в бактерии E. coli . [82] Затем естественные пути бактериальной репликации используют их для точной репликации плазмиды, содержащей d5SICS–dNaM.

Успешное включение третьей пары оснований в живой микроорганизм является значительным прорывом на пути к цели значительного увеличения числа аминокислот , которые могут быть закодированы ДНК, тем самым расширяя потенциал живых организмов для производства новых белков . [84] Искусственные цепочки ДНК пока ничего не кодируют, но ученые предполагают, что они могут быть разработаны для производства новых белков, которые могли бы иметь промышленное или фармацевтическое применение. [86]

В мае 2014 года исследователи объявили, что им удалось успешно внедрить два новых искусственных нуклеотида в бактериальную ДНК и, включив отдельные искусственные нуклеотиды в питательную среду, удалось вызвать амплификацию плазмид, содержащих искусственные нуклеотиды, в 2 x 10 7 раз (24 удвоения); они не создали мРНК или белки, способные использовать искусственные нуклеотиды. [82] [87] [88] [89]

Связанные методы

Метод селективного включения под давлением (SPI) для производства аллопротеинов

Было проведено много исследований, в которых производился белок с нестандартными аминокислотами, но они не изменяли генетический код. Эти белки, называемые аллопротеинами , производятся путем инкубации клеток с неестественной аминокислотой в отсутствие аналогичной кодируемой аминокислоты, чтобы первая была включена в белок вместо последней, например, L -2-аминогексановая кислота (Ahx) для метионина (Met). [90]

Эти исследования основаны на естественной беспорядочной активности аминоацил -тРНК-синтетазы , которая добавляет к своей целевой тРНК неприродную аминокислоту (т. е. аналог), похожую на естественный субстрат, например, метионил-тРНК-синтаза ошибочно принимает изолейцин за метионин. [91] В кристаллографии белков, например, добавление селенометионина к среде культуры штамма, ауксотрофного по метионину, приводит к белкам, содержащим селенометионин, а не метионин ( а именно, многоволновая аномальная дисперсия по причине). [92] Другим примером является то, что фотолейцин и фотометионин добавляются вместо лейцина и метионина для перекрестной маркировки белка. [93] Аналогичным образом, некоторые грибы, устойчивые к теллуру, могут включать теллуроцистеин и теллурометионин в свой белок вместо цистеина и метионина. [94] Цель расширения генетического кода более радикальна, поскольку она не заменяет аминокислоту, а добавляет одну или несколько к коду. С другой стороны, замены по всему протеому наиболее эффективно выполняются глобальными заменами аминокислот. Например, глобальные замены по всему протеому природных аминокислот фторированными аналогами были предприняты в E. coli [95] и B. subtilis . [96] Полная замена триптофана тиенопиррол-аланином в ответ на 20899 кодонов UGG в E. coli была сообщена в 2015 году Будисой и Сёллем . [97] Более того, многие биологические явления, такие как сворачивание и стабильность белка, основаны на синергических эффектах во многих положениях в последовательности белка. [98]

В этом контексте метод SPI генерирует рекомбинантные варианты белков или аллопротеины напрямую путем замены природных аминокислот на неприродные аналоги. [99] Ауксотрофный по аминокислотам хозяин экспрессии дополняется аналогом аминокислоты во время экспрессии целевого белка. [100] Этот подход позволяет избежать ловушек методов, основанных на подавлении [101] , и он превосходит их с точки зрения эффективности, воспроизводимости и чрезвычайно простой экспериментальной установки. [102] Многочисленные исследования продемонстрировали, как глобальная замена канонических аминокислот различными изостерическими аналогами вызывала минимальные структурные возмущения, но существенные изменения в термодинамике, [103] сворачивании, [104] агрегации [105] спектральных свойствах [106] [107] и ферментативной активности. [108]

в пробиркесинтез

Описанное выше расширение генетического кода происходит in vivo . Альтернативой является изменение кодирования in vitro экспериментов по трансляции. Это требует истощения всех тРНК и выборочного повторного введения определенных аминоацилированных тРНК, некоторые химически аминоацилированы. [109]

Химический синтез

Существует несколько методов химического производства пептидов , обычно это химия твердофазной защиты. Это означает, что любая (защищенная) аминокислота может быть добавлена ​​в зарождающуюся последовательность. [ необходима цитата ]

В ноябре 2017 года группа из Научно-исследовательского института Скриппса сообщила о создании полусинтетического генома бактерий E. coli с использованием шести различных нуклеотидов (по сравнению с четырьмя, встречающимися в природе). Две дополнительные «буквы» образуют третью, неестественную пару оснований. Полученные организмы смогли процветать и синтезировать белки с использованием «неестественных аминокислот». [110] [111] Использованная неестественная пара оснований — dNaM –dTPT3. [111] Эта неестественная пара оснований была продемонстрирована ранее, [112] [113], но это первый отчет о транскрипции и трансляции белков с использованием неестественной пары оснований.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Xie J, Schultz PG (декабрь 2005 г.). «Добавление аминокислот в генетический репертуар». Current Opinion in Chemical Biology . 9 (6): 548–54. doi :10.1016/j.cbpa.2005.10.011. PMID  16260173.
  2. ^ ab Zimmer C (15 мая 2019 г.). «Ученые создали бактерии с синтетическим геномом. Это искусственная жизнь? — Важным событием для синтетической биологии стало то, что колонии E. coli процветают с ДНК, созданной с нуля людьми, а не природой». The New York Times . Получено 16 мая 2019 г.
  3. ^ ab Fredens J, Wang K, de la Torre D, Funke LF, Robertson WE, Christova Y и др. (май 2019 г.). «Полный синтез Escherichia coli с перекодированным геномом». Nature . 569 (7757): 514–518. Bibcode :2019Natur.569..514F. doi :10.1038/s41586-019-1192-5. PMC 7039709 . PMID  31092918. 
  4. ^ Кубышкин В., Асеведо-Роча К.Г., Будиса Н. (февраль 2018 г.). «Об универсальных кодирующих событиях в биогенезе белков». Bio Systems . 164 : 16–25. Bibcode : 2018BiSys.164...16K. doi : 10.1016/j.biosystems.2017.10.004 . PMID  29030023.
  5. ^ Кубышкин В., Будиса Н. (август 2017 г.). «Синтетическое отчуждение микробных организмов с использованием генной инженерии кода: почему и как?». Biotechnology Journal . 12 (8): 1600097. doi :10.1002/biot.201600097. PMID  28671771.
  6. ^ abcdef Wang L, Brock A, Herberich B, Schultz PG (апрель 2001 г.). «Расширение генетического кода Escherichia coli». Science . 292 (5516): 498–500. Bibcode :2001Sci...292..498W. doi :10.1126/science.1060077. PMID  11313494. S2CID  6702011.
  7. ^ ab Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2008). Молекулярная биология клетки (5-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4105-5.
  8. ^ Woese CR, Olsen GJ, Ibba M, Söll D (март 2000 г.). «Аминоацил-тРНК-синтетазы, генетический код и эволюционный процесс». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 64 (1): 202–36. doi :10.1128/mmbr.64.1.202-236.2000. PMC 98992. PMID  10704480. 
  9. ^ ab Sakamoto K, Hayashi A, Sakamoto A, Kiga D, Nakayama H, Soma A и др. (ноябрь 2002 г.). «Сайт-специфическое включение неприродной аминокислоты в белки в клетках млекопитающих». Nucleic Acids Research . 30 (21): 4692–9. doi :10.1093/nar/gkf589. PMC 135798. PMID  12409460 . 
  10. ^ abc Liu CC, Schultz PG (2010). «Добавление новых химических веществ в генетический код». Annual Review of Biochemistry . 79 : 413–44. doi : 10.1146/annurev.biochem.052308.105824. PMID  20307192.
  11. ^ Summerer D, Chen S, Wu N, Deiters A, Chin JW, Schultz PG (июнь 2006 г.). «Генетически кодируемая флуоресцентная аминокислота». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 103 (26): 9785–9. Bibcode : 2006PNAS..103.9785S. doi : 10.1073/pnas.0603965103 . PMC 1502531. PMID  16785423 . 
  12. ^ ab Steinfeld JB, Aerni HR, Rogulina S, Liu Y, Rinehart J (май 2014 г.). «Расширенные клеточные пулы аминокислот, содержащие фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин». ACS Chemical Biology . 9 (5): 1104–12. doi :10.1021/cb5000532. PMC 4027946 . PMID  24646179. 
  13. ^ Furter R (февраль 1998). «Расширение генетического кода: сайт-направленное включение p-фторфенилаланина в Escherichia coli». Protein Science . 7 (2): 419–26. doi :10.1002/pro.5560070223. PMC 2143905 . PMID  9521119. 
  14. ^ Ван Л., Се Дж., Шульц П. Г. (2006). «Расширение генетического кода». Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure . 35 : 225–49. doi :10.1146/annurev.biophys.35.101105.121507. PMID  16689635.
  15. ^ Young TS, Schultz PG (апрель 2010 г.). «За пределами канонических 20 аминокислот: расширение генетического лексикона». Журнал биологической химии . 285 (15): 11039–44. doi : 10.1074/jbc.R109.091306 . PMC 2856976. PMID  20147747 . 
  16. ^ ab "Лаборатория Питера Г. Шульца". Schultz.scripps.edu. Архивировано из оригинала 2018-07-12 . Получено 2015-05-05 .
  17. ^ Cardillo G, Gentilucci L, Tolomelli A (март 2006 г.). «Необычные аминокислоты: синтез и введение в встречающиеся в природе пептиды и биологически активные аналоги». Mini Reviews in Medicinal Chemistry . 6 (3): 293–304. doi :10.2174/138955706776073394. PMID  16515468.
  18. ^ Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG (январь 2003 г.). «Генерация бактерии с генетическим кодом из 21 аминокислоты». Журнал Американского химического общества . 125 (4): 935–9. doi :10.1021/ja0284153. PMID  12537491.
  19. ^ "контекст :: 21-аминокислотные бактерии: расширение генетического кода". Straddle3.net . Получено 2015-05-05 .
  20. ^ Кунин EV, Новожилов AS (февраль 2009). «Происхождение и эволюция генетического кода: универсальная загадка». IUBMB Life . 61 (2): 99–111. arXiv : 0807.4749 . doi :10.1002/iub.146. PMC 3293468 . PMID  19117371. 
  21. ^ Maloy SR, Valley Joseph Stewart VJ, Taylor RK (1996). Генетический анализ патогенных бактерий: лабораторное руководство . Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 978-0-87969-453-1.
  22. ^ Normanly J, Kleina LG, Masson JM, Abelson J, Miller JH (июнь 1990 г.). «Конструирование генов тРНК-супрессоров янтаря Escherichia coli. III. Определение специфичности тРНК». Журнал молекулярной биологии . 213 (4): 719–26. doi :10.1016/S0022-2836(05)80258-X. PMID  2141650.
  23. ^ Wang L, Magliery TJ, Liu DR, Schultz PG (2000). "Новая функциональная пара супрессоров тРНК/аминоацил-тРНК-синтетазы для включения неприродных аминокислот в белки in vivo" (PDF) . J. Am. Chem. Soc . 122 (20): 5010–5011. doi :10.1021/ja000595y. Архивировано из оригинала (PDF) 27-09-2011 . Получено 02-12-2010 .
  24. ^ Wang L, Brock A, Schultz PG (март 2002 г.). «Добавление L-3-(2-нафтил)аланина в генетический код E. coli». Журнал Американского химического общества . 124 (9): 1836–7. doi :10.1021/ja012307j. PMID  11866580.
  25. ^ Chin JW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG (август 2002 г.). «Добавление фотосшивающей аминокислоты к генетическому коду Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 99 (17): 11020–4. Bibcode : 2002PNAS...9911020C. doi : 10.1073/pnas.172226299 . PMC 123203. PMID  12154230 . 
  26. ^ Aerni HR, Shifman MA, Rogulina S, O'Donoghue P, Rinehart J (январь 2015 г.). «Раскрытие аминокислотного состава белков в расширенном генетическом коде». Nucleic Acids Research . 43 (2): e8. doi :10.1093/nar/gku1087. PMC 4333366. PMID  25378305 . 
  27. ^ Isaacs FJ, Carr PA, Wang HH, Lajoie MJ, Sterling B, Kraal L и др. (июль 2011 г.). «Точные манипуляции с хромосомами in vivo позволяют производить замену кодонов по всему геному». Science . 333 (6040): 348–53. Bibcode :2011Sci...333..348I. doi :10.1126/science.1205822. PMC 5472332 . PMID  21764749. 
  28. ^ ab Lajoie MJ, Rovner AJ, Goodman DB, Aerni HR, Haimovich AD, Kuznetsov G, et al. (октябрь 2013 г.). «Геномно перекодированные организмы расширяют биологические функции». Science . 342 (6156): 357–60. Bibcode :2013Sci...342..357L. doi :10.1126/science.1241459. PMC 4924538 . PMID  24136966. 
  29. ^ Mandell DJ, Lajoie MJ, Mee MT, Takeuchi R, Kuznetsov G, Norville JE и др. (февраль 2015 г.). «Биоконтейнмент генетически модифицированных организмов с помощью синтетического белкового дизайна». Nature . 518 (7537): 55–60. Bibcode :2015Natur.518...55M. doi :10.1038/nature14121. PMC 4422498 . PMID  25607366. 
  30. ^ Zeng Y, Wang W, Liu WR (август 2014 г.). «К переназначению редкого кодона AGG в Escherichia coli». ChemBioChem . 15 (12): 1750–4. doi :10.1002/cbic.201400075. PMC 4167342 . PMID  25044341. 
  31. ^ Bohlke N, Budisa N (февраль 2014 г.). «Освобождение смыслового кодона для включения неканонических аминокислот в масштабах протеома: редкий изолейциновый кодон AUA как цель для расширения генетического кода». FEMS Microbiology Letters . 351 (2): 133–44. doi :10.1111/1574-6968.12371. PMC 4237120. PMID  24433543 . 
  32. ^ Робертсон, Уэсли Э.; Функе, Луиза Ф. Х.; де ла Торре, Дэниел; Фреденс, Юлиус; Эллиотт, Томас С.; Спинк, Мартин; Христова, Йонка; Черветтини, Даниэле; Бёге, Франц Л.; Лю, Ким К.; Бузе, Сальвадор; Маслен, Сара; Салмонд, Джордж П. К.; Чин, Джейсон В. (4 июня 2021 г.). «Переназначение смыслового кодона обеспечивает устойчивость к вирусам и синтез кодируемого полимера». Science . 372 (6546): 1057–1062. Bibcode :2021Sci...372.1057R. doi :10.1126/science.abg3029. PMC 7611380 . PMID  34083482. 
  33. ^ Аткинс, Дж. Ф.; Бьорк, Г. Р. «Захватывающая история о сдвиге рамки считывания рибосом: экстрагенные супрессоры мутаций сдвига рамки считывания освещают перестройку P-сайта». Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2009, 73, 178-210.
  34. ^ Андерсон, Дж. К.; Ву, Н.; Санторо, С. В.; Лакшман, В.; Кинг, Д. С.; Шульц, П. Г. «Расширенный генетический код с функциональным квадруплетным кодоном». Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 7566-7571.
  35. ^ Нойманн, Х.; Ванг, К.; Дэвис, Л.; Гарсия-Алай, М.; Чин, Дж. В. «Кодирование нескольких неприродных аминокислот посредством эволюции квадруплет-декодирующей рибосомы». Nature 2010, 464, 441-444.
  36. ^ Niu, W.; Schultz, PG; Guo, J. «Расширенный генетический код в клетках млекопитающих с функциональным квадруплетным кодоном». ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1640-1645.
  37. ^ abc Neumann H, Wang K, Davis L, Garcia-Alai M, Chin JW (март 2010 г.). «Кодирование нескольких неприродных аминокислот посредством эволюции рибосомы, декодирующей квадруплет». Nature . 464 (7287): 441–4. Bibcode :2010Natur.464..441N. doi :10.1038/nature08817. PMID  20154731. S2CID  4390989.
  38. ^ Hong S, Sunita S, Maehigashi T, Hoffer ED, Dunkle JA, Dunham CM (октябрь 2018 г.). «Механизм тРНК-опосредованного +1 рибосомального сдвига рамки считывания». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 115 (44): 11226–11231. Bibcode : 2018PNAS..11511226H. doi : 10.1073/pnas.1809319115 . PMC 6217423. PMID  30262649 . 
  39. ^ Niu, W., Schultz, PG, и Guo, J. (2013) Расширенный генетический код в клетках млекопитающих с функциональным квадруплетным кодоном. ACS Chem Biol 8, 1640-1645.
  40. ^ DeBenedictis EA, Carver GD, Chung CZ, Söll D, Badran AH (сентябрь 2021 г.). «Мультиплексное подавление четырех квадруплетных кодонов посредством направленной эволюции тРНК». Nature Communications . 12 (1): 5706. Bibcode :2021NatCo..12.5706D. doi :10.1038/s41467-021-25948-y. PMC 8481270 . PMID  34588441. 
  41. ^ Chen, Y., Wan, Y., Wang, N., Yuan, Z., Niu, W., Li, Q. и Guo, J. (2018) Управление репликацией геномно перекодированного ВИЧ-1 с помощью функционального квадруплетного кодона в клетках млекопитающих. ACS Synth. Biol. 7, 1612-1617.
  42. ^ Watanabe T, Muranaka N, Hohsaka T (март 2008 г.). «Четырехосновной кодон-опосредованный насыщающий мутагенез в бесклеточной системе трансляции». Журнал бионауки и биоинженерии . 105 (3): 211–5. doi :10.1263/jbb.105.211. PMID  18397770.
  43. ^ Anderson JC, Wu N, Santoro SW, Lakshman V, King DS, Schultz PG (май 2004 г.). «Расширенный генетический код с функциональным квадруплетным кодоном». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (20): 7566–71. Bibcode : 2004PNAS..101.7566A. doi : 10.1073/pnas.0401517101 . PMC 419646. PMID  15138302 . 
  44. ^ Санторо С.В., Андерсон Дж.К., Лакшман В., Шульц П.Г. (декабрь 2003 г.). «Происходящая из архебактерий пара глутамил-тРНК-синтетаз и тРНК для мутагенеза неприродных аминокислот белков в Escherichia coli». Исследования нуклеиновых кислот . 31 (23): 6700–9. дои : 10.1093/nar/gkg903. ПМК 290271 . ПМИД  14627803. 
  45. ^ Андерсон Дж. К., Шульц ПГ (август 2003 г.). «Адаптация ортогональной пары архейных лейцил-тРНК и синтетазы для подавления четырех оснований, янтаря и опала». Биохимия . 42 (32): 9598–608. doi :10.1021/bi034550w. PMID  12911301.
  46. ^ Hancock SM, Uprety R, Deiters A, Chin JW (октябрь 2010 г.). «Расширение генетического кода дрожжей для включения разнообразных неприродных аминокислот с помощью пары пирролизил-тРНК-синтетаза/тРНК». Журнал Американского химического общества . 132 (42): 14819–24. doi :10.1021/ja104609m. PMC 2956376. PMID  20925334 . 
  47. ^ Minaba M, Kato Y (март 2014). «Высокопроизводительная система экспрессии с нулевой утечкой и трансляционным переключением с использованием сайт-специфического включения неестественных аминокислот». Applied and Environmental Microbiology . 80 (5): 1718–25. Bibcode : 2014ApEnM..80.1718M . doi : 10.1128/AEM.03417-13. PMC 3957627. PMID  24375139. 
  48. ^ Chin JW, Cropp TA, Anderson JC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz PG (август 2003 г.). «Расширенный эукариотический генетический код». Science . 301 (5635): 964–7. Bibcode :2003Sci...301..964C. doi :10.1126/science.1084772. PMID  12920298. S2CID  2376187.
  49. ^ аб Ву Н, Дейтерс А, Кропп Т.А., Кинг Д., Шульц П.Г. (ноябрь 2004 г.). «Генетически кодируемая аминокислота с фотоклеткой». Журнал Американского химического общества . 126 (44): 14306–7. дои : 10.1021/ja040175z. ПМИД  15521721.
  50. ^ ab Kowal AK, Kohrer C, RajBhandary UL (февраль 2001 г.). «Двадцать первые пары аминоацил-тРНК-синтетаза-супрессор тРНК для возможного использования в сайт-специфическом включении аналогов аминокислот в белки эукариот и эубактерий». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 98 (5): 2268–73. Bibcode : 2001PNAS...98.2268K. doi : 10.1073/pnas.031488298 . PMC 30127. PMID  11226228 . 
  51. ^ Lemke EA, Summerer D, Geierstanger BH, Brittain SM, Schultz PG (декабрь 2007 г.). «Контроль фосфорилирования белка с помощью генетически кодируемой фотокаркасированной аминокислоты». Nature Chemical Biology . 3 (12): 769–72. doi :10.1038/nchembio.2007.44. PMID  17965709.
  52. ^ Palei S, Buchmuller B, Wolffgramm J, Muñoz-Lopez Á, Jung S, Czodrowski P, Summerer D (апрель 2020 г.). «Светоактивируемые TET-диоксигеназы выявляют динамику окисления 5-метилцитозина и реорганизацию транскриптома». Журнал Американского химического общества . 142 (16): 7289–7294. doi : 10.1021/jacs.0c01193. PMID  32286069. S2CID  215757172.
  53. ^ Kang JY, Kawaguchi D, Coin I, Xiang Z, O'Leary DD, Slesinger PA, Wang L (октябрь 2013 г.). «In vivo выражение активируемого светом калиевого канала с использованием неприродных аминокислот». Neuron . 80 (2): 358–70. doi :10.1016/j.neuron.2013.08.016. PMC 3815458 . PMID  24139041. 
  54. ^ Вольфграмм Дж., Бухмюллер Б., Палей С., Муньос-Лопес А., Канне Дж., Яннинг П. и др. (июнь 2021 г.). «Световая активация ДНК-метилтрансфераз». Ангеванде Хеми . 60 (24): 13507–13512. дои : 10.1002/anie.202103945 . ПМЦ 8251764 . ПМИД  33826797. 
  55. ^ Zhang Z, Alfonta L, Tian F, Bursulaya B, Uryu S, King DS, Schultz PG (июнь 2004 г.). «Избирательное включение 5-гидрокситриптофана в белки в клетках млекопитающих». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (24): 8882–7. Bibcode : 2004PNAS..101.8882Z. doi : 10.1073/pnas.0307029101 . PMC 428441. PMID  15187228 . 
  56. ^ Han S, Yang A, Lee S, Lee HW, Park CB, Park HS (февраль 2017 г.). «Расширение генетического кода Mus musculus». Nature Communications . 8 : 14568. Bibcode : 2017NatCo...814568H. doi : 10.1038/ncomms14568. PMC 5321798. PMID  28220771 . 
  57. ^ Rackham O, Chin JW (август 2005 г.). «Сеть ортогональных пар рибосома x мРНК». Nature Chemical Biology . 1 (3): 159–66. doi :10.1038/nchembio719. PMID  16408021. S2CID  37181098.
  58. ^ Ван К, Нойманн Х, Пик-Чью С.Й., Чин Дж.В. (июль 2007 г.). «Эволюционировавшие ортогональные рибосомы повышают эффективность синтетического расширения генетического кода» (PDF) . Nature Biotechnology . 25 (7): 770–7. doi :10.1038/nbt1314. PMID  17592474. S2CID  19683574.
  59. ^ Fried SD, Schmied WH, Uttamapinant C, Chin JW (октябрь 2015 г.). «Сшивание субъединиц рибосомы для ортогональной трансляции в E. coli». Angewandte Chemie . 54 (43): 12791–4. doi :10.1002/anie.201506311. PMC 4678508 . PMID  26465656. 
  60. ^ Terasaka N, Hayashi G, Katoh T, Suga H (июль 2014 г.). «Ортогональная пара рибосома-тРНК посредством проектирования центра пептидилтрансферазы». Nature Chemical Biology . 10 (7): 555–7. doi :10.1038/nchembio.1549. PMID  24907900.
  61. ^ Каварелли Дж., Морас Д. (январь 1993 г.). «Распознавание тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами». Журнал ФАСЭБ . 7 (1): 79–86. дои : 10.1096/fasebj.7.1.8422978 . PMID  8422978. S2CID  46222849.
  62. ^ Schimmel PR, Söll D (1979). «Аминоацил-тРНК-синтетазы: общие характеристики и распознавание транспортных РНК». Annual Review of Biochemistry . 48 : 601–48. doi :10.1146/annurev.bi.48.070179.003125. PMID  382994.
  63. ^ Ohuchi M, Murakami H, Suga H (октябрь 2007 г.). «Система флексизимов: высокогибкий инструмент аминоацилирования тРНК для аппарата трансляции». Current Opinion in Chemical Biology . 11 (5): 537–42. doi :10.1016/j.cbpa.2007.08.011. PMID  17884697.
  64. ^ Wang Q, Parrish AR, Wang L (март 2009). «Расширение генетического кода для биологических исследований». Химия и биология . 16 (3): 323–36. doi :10.1016/j.chembiol.2009.03.001. PMC 2696486. PMID  19318213 . 
  65. ^ Park HS, Hohn MJ, Umehara T, Guo LT, Osborne EM, Benner J, et al. (Август 2011). «Расширение генетического кода Escherichia coli с помощью фосфосерина». Science . 333 (6046): 1151–4. Bibcode :2011Sci...333.1151P. doi :10.1126/science.1207203. PMC 5547737 . PMID  21868676. 
  66. ^ Oza JP, Aerni HR, Pirman NL, Barber KW, Ter Haar CM, Rogulina S, et al. (сентябрь 2015 г.). «Надежное производство рекомбинантных фосфопротеинов с использованием бесклеточного синтеза белков». Nature Communications . 6 : 8168. Bibcode :2015NatCo...6.8168O. doi :10.1038/ncomms9168. PMC 4566161 . PMID  26350765. 
  67. ^ Pirman NL, Barber KW, Aerni HR, Ma NJ, Haimovich AD, Rogulina S, et al. (сентябрь 2015 г.). «Гибкий кодон в геномно перекодированной Escherichia coli допускает программируемое фосфорилирование белка». Nature Communications . 6 : 8130. Bibcode :2015NatCo...6.8130P. doi :10.1038/ncomms9130. PMC 4566969 . PMID  26350500. 
  68. ^ Rogerson DT, Sachdeva A, Wang K, Haq T, Kazlauskaite A, Hancock SM и др. (Июль 2015 г.). «Эффективное генетическое кодирование фосфосерина и его негидролизуемого аналога». Nature Chemical Biology . 11 (7): 496–503. doi :10.1038/nchembio.1823. PMC 4830402 . PMID  26030730. 
  69. ^ Gauba V, Grünewald J, Gorney V, Deaton LM, Kang M, Bursulaya B и др. (август 2011 г.). «Потеря толерантности к белкам с модифицированными аминокислотами, зависящей от CD4 T». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (31): 12821–6. Bibcode : 2011PNAS..10812821G. doi : 10.1073/pnas.1110042108 . PMC 3150954. PMID  21768354 . 
  70. ^ Liu CC, Mack AV, Brustad EM, Mills JH, Groff D, Smider VV, Schultz PG (июль 2009 г.). «Эволюция белков с генетически кодируемыми «химическими боеголовками»». Журнал Американского химического общества . 131 (28): 9616–7. doi :10.1021/ja902985e. PMC 2745334. PMID  19555063 . 
  71. ^ Hammerling MJ, Ellefson JW, Boutz DR, Marcotte EM, Ellington AD, Barrick JE (март 2014 г.). «Бактериофаги используют расширенный генетический код на эволюционных путях к более высокой приспособленности». Nature Chemical Biology . 10 (3): 178–80. doi :10.1038/nchembio.1450. PMC 3932624 . PMID  24487692. 
  72. ^ Киппер К., Лундиус Э.Г., Чурич В., Никич И., Висслер М., Лемке Э.А., Эльф Дж. (февраль 2017 г.). «Применение неканонических аминокислот для мечения белков в геномно перекодированной Escherichia coli». ACS Синтетическая биология . 6 (2): 233–255. doi : 10.1021/acsynbio.6b00138. ПМИД  27775882.
  73. ^ ab Dunkelmann DL, Oehm SB, Beattie AT, Chin JW (август 2021 г.). «68-кодоновый генетический код для включения четырех различных неканонических аминокислот, включенный с помощью автоматизированного ортогонального дизайна мРНК». Nature Chemistry . 13 (11): 1110–1117. Bibcode :2021NatCh..13.1110D. doi :10.1038/s41557-021-00764-5. PMC 7612796 . PMID  34426682. S2CID  237271721. 
  74. ^ ab Krishnakumar R, Ling J (январь 2014 г.). «Экспериментальные проблемы переназначения смысловых кодонов: инновационный подход к расширению генетического кода». FEBS Letters . 588 (3): 383–8. Bibcode : 2014FEBSL.588..383K. doi : 10.1016/j.febslet.2013.11.039 . PMID  24333334. S2CID  10152595.
  75. ^ Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA и др. (Июль 2010 г.). «Создание бактериальной клетки, контролируемой химически синтезированным геномом». Science . 329 (5987): 52–6. Bibcode :2010Sci...329...52G. doi : 10.1126/science.1190719 . PMID  20488990.
  76. ^ Хирао И, Оцуки Т, Фудзивара Т, Мицуи Т, Иокогава Т, Окуни Т и др. (февраль 2002 г.). «Неестественная пара оснований для включения аналогов аминокислот в белки». Nature Biotechnology . 20 (2): 177–82. doi :10.1038/nbt0202-177. PMID  11821864. S2CID  22055476.
  77. ^ Хирао И, Кимото М, Мицуи Т, Фудзивара Т, Каваи Р, Сато А и др. (сентябрь 2006 г.). «Неестественная гидрофобная система пар оснований: сайт-специфическое включение аналогов нуклеотидов в ДНК и РНК». Nature Methods . 3 (9): 729–35. doi :10.1038/nmeth915. PMID  16929319. S2CID  6494156.
  78. ^ Кимото М., Каваи Р., Мицуи Т., Ёкояма С., Хирао И. (февраль 2009 г.). «Неестественная система пар оснований для эффективной ПЦР-амплификации и функционализации молекул ДНК». Nucleic Acids Research . 37 (2): e14. doi :10.1093/nar/gkn956. PMC 2632903. PMID  19073696 . 
  79. ^ Yamashige R, Kimoto M, Takezawa Y, Sato A, Mitsui T, Yokoyama S, Hirao I (март 2012 г.). «Высокоспецифичные неестественные системы пар оснований в качестве третьей пары оснований для амплификации ПЦР». Nucleic Acids Research . 40 (6): 2793–806. doi :10.1093/nar/gkr1068. PMC 3315302. PMID  22121213 . 
  80. ^ Кимото М., Ямашигэ Р., Мацунага К., Ёкояма С., Хирао И. (май 2013 г.). «Создание высокоаффинных ДНК-аптамеров с использованием расширенного генетического алфавита». Nature Biotechnology . 31 (5): 453–7. doi :10.1038/nbt.2556. PMID  23563318. S2CID  23329867.
  81. ^ Малышев ДА, Дхами К, Куах ХТ, Лавергн Т, Ордоуханян П, Торкамани А, Ромесберг ФЭ (июль 2012 г.). «Эффективная и независимая от последовательности репликация ДНК, содержащей третью пару оснований, устанавливает функциональный шестибуквенный генетический алфавит». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (30): 12005–10. Bibcode : 2012PNAS..10912005M. doi : 10.1073/pnas.1205176109 . PMC 3409741. PMID  22773812 . 
  82. ^ abcd Малышев DA, ​​Дхами K, Лавернь T, Чен T, Дай N, Фостер JM и др. (май 2014 г.). «Полусинтетический организм с расширенным генетическим алфавитом». Nature . 509 (7500): 385–8. Bibcode :2014Natur.509..385M. doi :10.1038/nature13314. PMC 4058825 . PMID  24805238. 
  83. ^ Callaway E (7 мая 2014 г.). «Ученые создали первый живой организм с «искусственной» ДНК». Nature News . Huffington Post . Получено 8 мая 2014 г.
  84. ^ ab Fikes BJ (8 мая 2014 г.). «Жизнь, созданная с помощью расширенного генетического кода». San Diego Union Tribune . Архивировано из оригинала 9 мая 2014 г. Получено 8 мая 2014 г.
  85. ↑ Образец I (7 мая 2014 г.). «Первые формы жизни, передающие искусственную ДНК, разработанную американскими учеными». The Guardian . Получено 8 мая 2014 г.
  86. ^ Pollack A (7 мая 2014 г.). «Ученые добавляют буквы в алфавит ДНК, усиливая надежду и страх». The New York Times . Получено 8 мая 2014 г.
  87. ^ Pollack A (7 мая 2014 г.). «Исследователи сообщают о прорыве в создании искусственного генетического кода». The New York Times . Получено 7 мая 2014 г.
  88. ^ Callaway E (7 мая 2014 г.). «Первая жизнь с „чужой“ ДНК». Nature . doi :10.1038/nature.2014.15179. S2CID  86967999 . Получено 7 мая 2014 г. .
  89. ^ Amos J (8 мая 2014 г.). «Полусинтетический жук расширяет „алфавит жизни“». BBC News . Получено 2014-05-09 .
  90. ^ Koide H, Yokoyama S, Kawai G, Ha JM, Oka T, Kawai S и др. (сентябрь 1988 г.). «Биосинтез белка, содержащего небелковую аминокислоту, Escherichia coli: L-2-аминогексановая кислота в положении 21 в человеческом эпидермальном факторе роста». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (17 ) : 6237–41. Bibcode : 1988PNAS...85.6237K. doi : 10.1073/pnas.85.17.6237 . PMC 281944. PMID  3045813. 
  91. ^ Ferla MP, Patrick WM (август 2014 г.). «Бактериальный биосинтез метионина». Микробиология . 160 (ч. 8): 1571–1584. doi : 10.1099/mic.0.077826-0 . PMID  24939187.
  92. ^ Doublié S (2007). "Производство селенометиониловых белков в прокариотических и эукариотических системах экспрессии" . Протоколы макромолекулярной кристаллографии. Методы в молекулярной биологии. Т. 363. С. 91–108. doi :10.1007/978-1-59745-209-0_5. ISBN 978-1-58829-292-6. PMID  17272838.
  93. ^ Suchanek M, Radzikowska A, Thiele C (апрель 2005 г.). «Фотолейцин и фотометионин позволяют идентифицировать белок-белковые взаимодействия в живых клетках». Nature Methods . 2 (4): 261–7. doi : 10.1038/NMETH752 . PMID  15782218.
  94. ^ Рамадан SE, Разак AA, Рагаб AM, эль-Мелейги M (июнь 1989). «Включение теллура в аминокислоты и белки грибов, устойчивых к теллуру». Biological Trace Element Research . 20 (3): 225–32. doi :10.1007/BF02917437. PMID  2484755. S2CID  9439946.
  95. ^ Bacher JM, Ellington AD (сентябрь 2001 г.). «Выбор и характеристика вариантов Escherichia coli, способных к росту на токсичном аналоге триптофана». Журнал бактериологии . 183 (18): 5414–25. doi :10.1128/jb.183.18.5414-5425.2001. PMC 95426. PMID  11514527 . 
  96. ^ Wong JT (октябрь 1983 г.). «Мутация членства в генетическом коде: потеря приспособленности триптофаном». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 80 (20): 6303–6. Bibcode : 1983PNAS...80.6303W. doi : 10.1073/pnas.80.20.6303 . PMC 394285. PMID  6413975 . 
  97. ^ Hoesl MG, Oehm S, Durkin P, Darmon E, Peil L, Aerni HR и др. (август 2015 г.). «Химическая эволюция бактериального протеома». Angewandte Chemie . 54 (34): 10030–4. doi :10.1002/anie.201502868. PMC 4782924 . PMID  26136259. NIHMSID: NIHMS711205
  98. ^ Moroder L, Budisa N (апрель 2010 г.). «Синтетическая биология сворачивания белков». ChemPhysChem . 11 (6): 1181–7. doi :10.1002/cphc.201000035. PMID  20391526.
  99. ^ Budisa N (декабрь 2004 г.). «Пролегомены к будущим экспериментальным усилиям по генной инженерии кода путем расширения его аминокислотного репертуара». Angewandte Chemie . 43 (47): 6426–63. doi :10.1002/anie.200300646. PMID  15578784.
  100. ^ Link AJ, Mock ML, Tirrell DA (декабрь 2003 г.). «Неканонические аминокислоты в белковой инженерии». Current Opinion in Biotechnology . 14 (6): 603–9. doi :10.1016/j.copbio.2003.10.011. PMID  14662389.
  101. ^ Nehring S, Budisa N, Wiltschi B (2012). "Анализ производительности ортогональных пар, разработанных для расширенного эукариотического генетического кода". PLOS ONE . 7 (4): e31992. Bibcode : 2012PLoSO...731992N. doi : 10.1371 /journal.pone.0031992 . PMC 3320878. PMID  22493661. 
  102. ^ Agostini F, Völler JS, Koksch B, Acevedo-Rocha CG, Kubyshkin V, Budisa N (август 2017 г.). «Биокатализ с неприродными аминокислотами: энзимология встречается с ксенобиологией». Angewandte Chemie . 56 (33): 9680–9703. doi :10.1002/anie.201610129. PMID  28085996.
  103. ^ Rubini M, Lepthien S, Golbik R, Budisa N (июль 2006 г.). «Барстар, содержащий аминотриптофан: компромисс между структурой и функцией в проектировании и инженерии белков с расширенным генетическим кодом». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Белки и протеомика . 1764 (7): 1147–58. doi :10.1016/j.bbapap.2006.04.012. PMID  16782415.
  104. ^ Steiner T, Hess P, Bae JH, Wiltschi B, Moroder L, Budisa N (февраль 2008 г.). "Синтетическая биология белков: настройка сворачивания и стабильности GFP с помощью фторпролина". PLOS ONE . ​​3 (2): e1680. Bibcode :2008PLoSO...3.1680S. doi : 10.1371/journal.pone.0001680 . PMC 2243022 . PMID  18301757. 
  105. ^ Wolschner C, Giese A, Kretzschmar HA, Huber R, Moroder L, Budisa N (май 2009). «Разработка вариантов анти- и проагрегации для оценки эффектов окисления метионина в человеческом прионном белке». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 106 (19): 7756–61. Bibcode : 2009PNAS..106.7756W. doi : 10.1073/pnas.0902688106 . PMC 2674404. PMID  19416900 . 
  106. ^ Lepthien S, Hoesl MG, Merkel L, Budisa N (октябрь 2008 г.). «Азатриптофаны наделяют белки внутренней синей флуоресценцией». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 105 (42): 16095–100. Bibcode : 2008PNAS..10516095L. doi : 10.1073/pnas.0802804105 . PMC 2571030. PMID  18854410 . 
  107. ^ Bae JH, Rubini M, Jung G, Wiegand G, Seifert MH, Azim MK и др. (май 2003 г.). «Расширение генетического кода позволяет разработать новый «золотой» класс зеленых флуоресцентных белков». Журнал молекулярной биологии . 328 (5): 1071–81. doi :10.1016/s0022-2836(03)00364-4. PMID  12729742. Архивировано из оригинала 2017-08-11 . Получено 2017-08-11 .
  108. ^ Hoesl MG, Acevedo-Rocha CG, Nehring S, Royter M, Wolschner C, Wiltschi B, Budisa N, Antranikian G (2011). «Конгенеры липазы, разработанные с помощью генной инженерии». ChemCatChem . 3 (1): 213–221. doi :10.1002/cctc.201000253. ISSN  1867-3880. S2CID  86352672.
  109. ^ Hong SH, Kwon YC, Jewett MC (2014). «Нестандартное включение аминокислот в белки с использованием бесклеточного синтеза белков Escherichia coli». Frontiers in Chemistry . 2 : 34. Bibcode : 2014FrCh ....2...34H. doi : 10.3389/fchem.2014.00034 . PMC 4050362. PMID  24959531. 
  110. ^ «Неестественный» микроб может производить белки. BBC News . 29 ноября 2017 г.
  111. ^ аб Чжан Ю., Птацин Дж.Л., Фишер ЕС, Эрни Х.Р., Каффаро CE, Сан-Хосе К. и др. (ноябрь 2017 г.). «Полусинтетический организм, который хранит и извлекает увеличенную генетическую информацию». Природа . 551 (7682): 644–647. Бибкод : 2017Natur.551..644Z. дои : 10.1038/nature24659. ПМК 5796663 . ПМИД  29189780. 
  112. ^ Howgego J (февраль 2014). «О странных нуклеотидах». Chemistry World .
  113. ^ Li L, Degardin M, Lavergne T, Malyshev DA, Dhami K, Ordoukhanian P, Romesberg FE (январь 2014). «Естественноподобная репликация неестественной пары оснований для расширения генетического алфавита и применения в биотехнологии». Журнал Американского химического общества . 136 (3): 826–9. doi :10.1021/ja408814g. PMC 3979842. PMID  24152106 .