Изотопная маркировка (или изотопная маркировка ) — это метод, используемый для отслеживания прохождения изотопа ( атома с обнаруживаемым изменением числа нейтронов ) через химическую реакцию , метаболический путь или биологическую клетку . [1] Реагент «маркируется» путем замены одного или нескольких определенных атомов их изотопами. Затем реагенту позволяют пройти реакцию. Положение изотопов в продуктах измеряется, чтобы определить, в какой последовательности изотопный атом следовал в реакции или метаболическом пути клетки. Нуклиды, используемые при изотопной маркировке, могут быть стабильными нуклидами или радионуклидами . В последнем случае маркировка называется радиомечением .
В изотопной маркировке существует несколько способов обнаружения наличия маркирующих изотопов: через их массу , колебательную моду или радиоактивный распад . Масс-спектрометрия обнаруживает разницу в массе изотопа, в то время как инфракрасная спектроскопия обнаруживает разницу в колебательных модах изотопа. Ядерный магнитный резонанс обнаруживает атомы с различными гиромагнитными отношениями. Радиоактивный распад можно обнаружить с помощью ионизационной камеры или авторадиографов гелей.
Примером использования изотопной маркировки является исследование фенола (C 6 H 5 OH) в воде путем замены обычного водорода ( протия ) на дейтерий ( маркировка дейтерием ). При добавлении фенола к дейтерированной воде (вода, содержащая D 2 O в дополнение к обычной H 2 O ) в гидроксильной группе фенола наблюдается замена водорода на дейтерий (что приводит к образованию C 6 H 5 OD), что указывает на то, что фенол легко вступает в реакции обмена водорода с водой. Затрагивается только гидроксильная группа, что указывает на то, что остальные 5 атомов водорода не участвуют в реакциях обмена. [ необходима цитата ]
Изотопный трассер ( также «изотопный маркер» или «изотопная метка») используется в химии и биохимии для понимания химических реакций и взаимодействий. В этой технике один или несколько атомов интересующей молекулы заменяются атомом того же химического элемента , но другого изотопа (например, радиоактивный изотоп, используемый в радиоактивном трассировании ). Поскольку меченый атом имеет то же число протонов, он будет вести себя почти так же, как и его немеченый аналог, и, за немногими исключениями, не будет мешать исследуемой реакции. Однако разница в числе нейтронов означает , что его можно обнаружить отдельно от других атомов того же элемента.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и масс-спектрометрия (МС) используются для исследования механизмов химических реакций. ЯМР и МС обнаруживают изотопные различия, что позволяет определить информацию о положении меченых атомов в структуре продуктов. Имея информацию о расположении изотопных атомов в продуктах, можно определить путь реакции, который исходные метаболиты используют для превращения в продукты. Радиоактивные изотопы можно проверить с помощью авторадиографов гелей в гель-электрофорезе . Излучение, испускаемое соединениями, содержащими радиоактивные изотопы, затемняет кусок фотопленки , регистрируя положение меченых соединений относительно друг друга в геле.
Изотопные трассеры обычно используются в форме изотопных соотношений. Изучая соотношение между двумя изотопами одного и того же элемента, мы избегаем эффектов, связанных с общим содержанием элемента, которые обычно перекрывают гораздо меньшие вариации изотопного содержания. Изотопные трассеры являются одними из самых важных инструментов в геологии, поскольку их можно использовать для понимания сложных процессов смешивания в земных системах. Дальнейшее обсуждение применения изотопных трассеров в геологии рассматривается в разделе изотопная геохимия .
Изотопные трассеры обычно подразделяются на две категории: стабильные изотопные трассеры и радиогенные изотопные трассеры. Стабильные изотопные трассеры включают только нерадиогенные изотопы и обычно зависят от массы. Теоретически любой элемент с двумя стабильными изотопами может быть использован в качестве изотопного трассера. Однако наиболее часто используемые стабильные изотопные трассеры включают относительно легкие изотопы, которые легко подвергаются фракционированию в природных системах. См. также изотопную сигнатуру . Радиогенный изотопный трассер [3] включает изотоп, полученный в результате радиоактивного распада , который обычно находится в соотношении с нерадиогенным изотопом (чье содержание в земле не меняется из-за радиоактивного распада).
Маркировка стабильными изотопами подразумевает использование нерадиоактивных изотопов , которые могут выступать в качестве трассеров, используемых для моделирования нескольких химических и биохимических систем. Выбранный изотоп может выступать в качестве метки для этого соединения, которое может быть идентифицировано с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (МС). Некоторые из наиболее распространенных стабильных изотопов - это 2 H, 13 C и 15 N, которые могут быть дополнительно получены в растворителях ЯМР , аминокислотах , нуклеиновых кислотах , липидах , общих метаболитах и средах для роста клеток . [5] Соединения, полученные с использованием стабильных изотопов, либо указываются процентом меченых изотопов (то есть 30% равномерно меченой 13 C глюкозы содержит смесь, которая на 30% мечена 13 изотопом углерода и на 70% естественно меченым углеродом), либо специально мечеными позициями углерода в соединении (то есть 1-13 C глюкоза, которая мечена в первой позиции углерода глюкозы).
Показана сеть реакций, заимствованных из пути гликолиза и пути пентозофосфата , в которой меченый изотоп углерода перестраивается в различные положения углерода по всей сети реакций. Сеть начинается с фруктозо-6-фосфата (F6P), который имеет 6 атомов углерода с меткой 13 C в положениях углерода 1 и 2. 1,2- 13 C F6P становится двумя глицеральдегид-3-фосфатами (G3P), одним 2,3- 13 C T3P и одним немеченым T3P. 2,3- 13 C T3P теперь может реагировать с седогептулозо-7-фосфатом (S7P) с образованием немеченого эритрозо-4-фосфата (E4P) и 5,6- 13 C F6P. Немеченый T3P будет реагировать с S7P для синтеза немеченых продуктов. [4] На рисунке показано использование маркировки стабильных изотопов для обнаружения перегруппировки атомов углерода посредством реакций с использованием позиционно-специфических меченых соединений.
Анализ метаболического потока (MFA) с использованием маркировки стабильными изотопами является важным инструментом для объяснения потока определенных элементов через метаболические пути и реакции внутри клетки . Изотопная метка подается в клетку, затем клетке позволяют расти, используя меченый корм. Для анализа стационарного метаболического потока клетка должна достичь устойчивого состояния (изотопы, входящие и выходящие из клетки, остаются постоянными со временем) или квазиустойчивого состояния (устойчивое состояние достигается в течение заданного периода времени). [6] Определяется изотопный профиль выходного метаболита . Выходной изотопный профиль дает ценную информацию, которую можно использовать для определения величины потока , скорости превращения реагентов в продукты в каждой реакции. [7]
Рисунок демонстрирует возможность использования различных меток для определения потока через определенную реакцию. Предположим, что исходный метаболит, трехуглеродное соединение, имеет возможность либо расщепляться на двухуглеродный метаболит и одноуглеродный метаболит в одной реакции, а затем рекомбинировать или оставаться трехуглеродным метаболитом. Если реакция обеспечивается двумя изотопами метаболита в равной пропорции, один полностью меченый (синие круги), обычно известный как равномерно меченый, и один полностью немеченый (белые круги). Путь вниз по левой стороне диаграммы не отображает никаких изменений в метаболитах, в то время как правая сторона показывает расщепление и рекомбинацию. Как показано, если метаболит выбирает только путь вниз по левой стороне, он остается в соотношении 50 на 50 равномерно меченого к немеченому метаболиту. Если метаболит выбирает только правую сторону, могут возникнуть новые модели маркировки, все в равной пропорции. Другие пропорции могут возникать в зависимости от того, какая часть исходного метаболита следует по левой стороне пути по сравнению с правой стороной пути. Здесь пропорции показаны для ситуации, в которой половина метаболитов занимает левую сторону, а половина — правую, но могут возникать и другие пропорции. [8] Эти образцы меченых атомов и немеченых атомов в одном соединении представляют собой изотопомеры . Измеряя распределение изотопомеров по-разному меченых метаболитов, можно определить поток через каждую реакцию. [9]
MFA объединяет данные, собранные с помощью изотопной маркировки, со стехиометрией каждой реакции, ограничениями и процедурой оптимизации, чтобы разрешить карту потоков. Необратимые реакции обеспечивают термодинамические ограничения, необходимые для нахождения потоков. Строится матрица , которая содержит стехиометрию реакций. Внутриклеточные потоки оцениваются с помощью итерационного метода , в котором моделируемые потоки включаются в стехиометрическую модель. Моделируемые потоки отображаются на карте потоков, которая показывает скорость преобразования реагентов в продукты для каждой реакции. [7] В большинстве карт потоков, чем толще стрелка, тем больше значение потока реакции. [10]
Можно использовать любую методику измерения разницы между изотопомерами . Два основных метода, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и масс-спектрометрия (МС), были разработаны для измерения массовых изотопомеров в маркировке стабильных изотопов.
Протонный ЯМР был первым методом, использованным для 13 экспериментов по маркировке C. Используя этот метод, каждое отдельное положение протонированного углерода внутри определенного пула метаболита можно наблюдать отдельно от других положений. [11] Это позволяет узнать процент изотопомеров, маркированных в этом конкретном положении. Ограничение протонного ЯМР заключается в том, что если в метаболите n атомов углерода, может быть не более n различных значений позиционного обогащения, что составляет лишь малую часть общей информации об изотопомере. Хотя использование маркировки протонного ЯМР является ограниченным, чистые эксперименты с протонным ЯМР гораздо легче оценивать, чем эксперименты с большим количеством информации об изотопомере.
В дополнение к ЯМР протона , использование методов ЯМР 13 C позволит получить более детальное представление о распределении изотопомеров. Меченый атом углерода будет производить различные сигналы сверхтонкого расщепления в зависимости от состояния маркировки его непосредственных соседей в молекуле. [11] Синглетный пик возникает, если соседние атомы углерода не маркированы. Дублетный пик возникает, если маркирован только один соседний атом углерода. Размер дублетного расщепления зависит от функциональной группы соседнего атома углерода. Если маркированы два соседних атома углерода, дублет дублетов может выродиться в триплет, если расщепления дублетов равны.
Недостатком использования методов ЯМР для анализа метаболических потоков является то, что он отличается от других приложений ЯМР, поскольку это довольно специализированная дисциплина. Спектрометр ЯМР может быть недоступен напрямую для всех исследовательских групп. Оптимизация параметров измерения ЯМР и надлежащий анализ пиковых структур требуют квалифицированного специалиста по ЯМР. Некоторые метаболиты также могут потребовать специализированных процедур измерения для получения дополнительных данных изотопомера. Кроме того, необходимы специально адаптированные программные инструменты для определения точного количества площадей пиков, а также для идентификации разложения запутанных синглетных, дублетных и триплетных пиков.
В отличие от ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрия (МС) является другим методом, который более применим и чувствителен к экспериментам по анализу метаболического потока. Инструменты МС доступны в различных вариантах. В отличие от двумерного ядерного магнитного резонанса ( 2D-ЯМР ), инструменты МС работают непосредственно с гидролизатом . [11]
В газовой хроматографии-масс-спектрометрии ( ГХ-МС ) МС соединяется с газовым хроматографом для разделения соединений гидролизата. Соединения, элюирующие из колонки ГХ, затем ионизируются и одновременно фрагментируются. Преимущество использования ГХ-МС заключается в том, что измеряются не только массовые изотопомеры молекулярного иона, но и массовый изотопомерный спектр нескольких фрагментов, что значительно увеличивает измеряемую информацию.
В жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии ( ЖХ-МС ) ГХ заменяется жидкостным хроматографом. [12] Главное отличие заключается в том, что химическая дериватизация не требуется. Однако применение ЖХ-МС к МФА встречается редко.
В каждом случае приборы МС делят конкретное распределение изотопомеров на его молекулярную массу. Все изотопомеры конкретного метаболита, которые содержат одинаковое количество меченых атомов углерода, собираются в одном пиковом сигнале. Поскольку каждый изотопомер вносит вклад ровно в один пик в спектре МС, процентное значение затем может быть рассчитано для каждого пика, что дает массовую фракцию изотопомера. [11] Для метаболита с n атомами углерода производятся n+1 измерений. После нормализации остается ровно n информативных массовых количеств изотопомера. [11]
Недостатком использования методов МС является то, что для газовой хроматографии образец должен быть подготовлен путем химической дериватизации, чтобы получить молекулы с зарядом. Существует множество соединений, используемых для дериватизации образцов. N,N-диметилформамид диметилацеталь (DMFDMA) [13] и N-(трет-бутилдиметилсилил)-N-метилтрифторацетамид (MTBSTFA) [14] являются двумя примерами соединений, которые использовались для дериватизации аминокислот.
Кроме того, сильные изотопные эффекты, наблюдаемые, влияют на время удерживания по-разному маркированных изотопомеров в колонке ГХ. Перегрузка колонки ГХ также должна быть предотвращена. [14]
Наконец, естественное изобилие других атомов, кроме углерода, также приводит к нарушению спектра массового изотопомера. Например, каждый атом кислорода в молекуле может также присутствовать как изотоп 17 O и как изотоп 18 O. Более существенное влияние естественного изотопного изотопного состава оказывает кремний с естественным изотопным составом 29 Si и 30 Si. Si используется в дериватизирующих агентах для методов МС. [11]
Радиоизотопная маркировка — это метод отслеживания прохождения образца вещества через систему. Вещество «маркируется» путем включения радионуклидов в его химический состав. Когда они распадаются , их присутствие можно определить путем обнаружения испускаемого ими излучения . Радиоизотопная маркировка — это особый случай изотопной маркировки.
Для этих целей особенно полезным типом радиоактивного распада является эмиссия позитрона . Когда позитрон сталкивается с электроном, он высвобождает два высокоэнергетических фотона, движущихся в диаметрально противоположных направлениях. Если позитрон образуется внутри твердого объекта, он, скорее всего, сделает это, не пройдя более миллиметра. [ необходима цитата ] Если оба этих фотона могут быть обнаружены, место события распада может быть определено очень точно.
Строго говоря, радиоизотопная маркировка включает только те случаи, когда радиоактивность искусственно вводится экспериментаторами, однако некоторые природные явления позволяют проводить подобный анализ. В частности, радиометрическое датирование использует тесно связанный принцип.
Использование стабильных изотопных трассеров для изучения минерального питания и метаболизма у людей впервые было описано в 1960-х годах. [15] Хотя радиоизотопы использовались в исследованиях питания человека в течение нескольких десятилетий до этого, стабильные изотопы представляли собой более безопасный вариант, особенно для субъектов, в отношении которых существует повышенная обеспокоенность по поводу воздействия радиации, например, беременных и кормящих женщин и детей. Другие преимущества, предлагаемые стабильными изотопами, включают возможность изучения элементов, не имеющих подходящих радиоизотопов, и изучения долгосрочного поведения трассеров. [16] [17] Таким образом, использование стабильных изотопов стало обычным явлением с ростом доступности изотопно-обогащенных материалов и неорганических масс-спектрометров. Использование стабильных изотопов вместо радиоизотопов имеет несколько недостатков: требуются большие количества трассера, которые могут нарушить естественный минерал; аналитическая подготовка образцов более сложна, а масс-спектрометрическое оборудование более затратно; присутствие трассера во всем организме или отдельных тканях не может быть измерено извне. [18] Тем не менее, преимущества взяли верх, сделав стабильные изотопы стандартом в исследованиях человека.
Большинство минералов, которые необходимы для здоровья человека и представляют особый интерес для исследователей питания, имеют стабильные изотопы, некоторые из которых хорошо подходят в качестве биологических трассеров из-за их низкой естественной распространенности. [16] [18] Железо , цинк , кальций , медь , магний , селен и молибден входят в число основных минералов, имеющих стабильные изотопы, к которым были применены методы изотопных трассеров. Железо, цинк и кальций, в частности, были широко изучены.
Аспекты минерального питания/метаболизма, которые изучаются, включают всасывание (из желудочно-кишечного тракта в организм), распределение, хранение, выведение и кинетику этих процессов. Изотопные трассеры вводятся субъектам перорально (с пищей или без нее, или с минеральной добавкой) и/или внутривенно. Затем изотопное обогащение измеряется в плазме крови, эритроцитах, моче и/или кале. [19] [20] Обогащение также измерялось в грудном молоке [21] и содержимом кишечника. Дизайн эксперимента с трассерами иногда отличается для разных минералов из-за различий в их метаболизме. Например, всасывание железа обычно определяется по включению трассера в эритроциты, тогда как всасывание цинка или кальция измеряется по появлению трассера в плазме, моче или кале. [22] [23] Введение нескольких изотопных трассеров в одном исследовании является обычным явлением, что позволяет использовать более надежные методы измерения и одновременно исследовать несколько аспектов метаболизма.
Измерение поглощения минералов из рациона, часто понимаемое как биодоступность , является наиболее распространенным применением методов изотопных трассеров в исследованиях питания. Среди целей таких исследований - изучение того, как поглощение зависит от типа пищи (например, растительная или животная, грудное молоко или молочная смесь), других компонентов рациона (например, фитат ), болезней и метаболических расстройств (например, экологическая кишечная дисфункция ), репродуктивного цикла, количества минералов в рационе, хронического дефицита минералов , возраста субъекта и гомеостатических механизмов. Когда результаты таких исследований доступны для минерала, они могут служить основой для оценки физиологических и диетических потребностей человека в минерале. [24] [25]
Когда трассер вводится с пищей с целью наблюдения за усвоением минералов и метаболизмом, он может быть в форме внутренней или внешней метки. [26] [27] Внутренняя метка — это изотоп, который был введен в пищу во время ее производства, тем самым обогащая естественное минеральное содержание пищи, тогда как внешняя маркировка относится к добавлению изотопа трассера в пищу во время исследования. Поскольку это очень трудоемкий и дорогостоящий подход, внутренняя маркировка обычно не используется. Исследования, сравнивающие измерения усвоения с использованием внутренней и внешней маркировки различных продуктов, в целом продемонстрировали хорошее соответствие между двумя методами маркировки, подтверждая гипотезу о том, что внешние и природные минералы обрабатываются одинаково в желудочно-кишечном тракте человека.
Обогащение количественно определяется путем измерения изотопных соотношений , отношения изотопного индикатора к эталонному изотопу, с помощью масс-спектрометрии. Различные исследователи приняли несколько определений и расчетов обогащения. [28] Расчеты обогащения становятся более сложными, когда одновременно используются несколько индикаторов. Поскольку обогащенные изотопные препараты никогда не являются изотопно чистыми, т. е. они содержат все изотопы элемента в неестественных количествах, расчеты обогащения нескольких изотопных индикаторов должны учитывать возмущение каждого изотопного соотношения из-за присутствия других индикаторов. [28]
В связи с распространенностью дефицита минералов и его критическим влиянием на здоровье и благополучие человека в странах с ограниченными ресурсами Международное агентство по атомной энергии недавно опубликовало подробные и всеобъемлющие описания методов стабильных изотопов, чтобы облегчить распространение этих знаний среди исследователей за пределами западных академических центров. [22] [29]
В протеомике , изучении полного набора белков, экспрессируемых геномом , выявление биомаркеров заболеваний может включать использование стабильной изотопной маркировки аминокислотами в клеточной культуре (SILAC), которая обеспечивает изотопно-меченые формы аминокислот, используемые для оценки уровней белка. [30] В рекомбинантных белках, манипулируемые белки производятся в больших количествах, и изотопная маркировка является инструментом для тестирования соответствующих белков. Метод раньше заключался в избирательном обогащении ядер 13 C или 15 N или истощении 1 H из них. Рекомбинант будет экспрессироваться в E.coli со средой, содержащей 15 N- хлорид аммония в качестве источника азота. [31] Полученные 15 N-меченые белки затем очищаются с помощью иммобилизованного сродства к металлу и оцениваются их процентное содержание. Для увеличения выхода меченых белков и снижения стоимости меченых изотопами сред альтернативная процедура в первую очередь увеличивает массу клеток с использованием немеченых сред перед введением их в минимальное количество меченых сред. [32] Другое применение изотопной маркировки — измерение синтеза ДНК, то есть пролиферации клеток in vitro . Использует маркировку H 3 -тимидином для сравнения паттерна синтеза (или последовательности) в клетках. [33]
Изотопные трассеры используются для изучения процессов в природных системах, особенно в наземной и водной средах. В почвоведении трассеры 15 N широко используются для изучения круговорота азота, тогда как 13 C и 14 C, стабильные и радиоактивные изотопы углерода соответственно, используются для изучения оборота органических соединений и фиксации CO 2 автотрофами . Например, Марш и др. (2005) использовали мочевину с двойной меткой ( 15 N- и 14 C), чтобы продемонстрировать использование соединения окислителями аммиака как источника энергии (окисление аммиака) и источника углерода (хемоавтотрофная фиксация углерода). [34] Дейтерированная вода также используется для отслеживания судьбы и возраста воды в дереве [35] или в экосистеме. [36]
Трассеры также широко используются в океанографии для изучения широкого спектра процессов. Используемые изотопы обычно встречаются в природе с хорошо известными источниками и скоростями образования и распада. Однако антропогенные изотопы также могут использоваться с большим успехом. Исследователи измеряют изотопные отношения в разных местах и в разное время, чтобы сделать вывод о физических процессах в океане.
Океан представляет собой обширную сеть переноса частиц. Изотопы тория могут помочь исследователям расшифровать вертикальное и горизонтальное движение материи. 234 Th имеет постоянную, четко определенную скорость производства в океане и период полураспада 24 дня. Было показано, что этот встречающийся в природе изотоп линейно изменяется с глубиной. Поэтому любые изменения в этой линейной схеме можно отнести к переносу 234 Th на частицах. Например, низкие изотопные отношения в поверхностной воде с очень высокими значениями на глубине в несколько метров будут указывать на вертикальный поток в нисходящем направлении. Кроме того, изотоп тория можно проследить на определенной глубине, чтобы расшифровать боковой перенос частиц. [37]
Циркуляция в локальных системах, таких как заливы, эстуарии и грунтовые воды, может быть исследована с помощью изотопов радия. 223 Ra имеет период полураспада 11 дней и может встречаться естественным образом в определенных местах в реках и источниках грунтовых вод. Изотопное соотношение радия затем будет уменьшаться по мере того, как вода из исходной реки попадает в залив или эстуарий. Измеряя количество 223 Ra в ряде различных мест, можно расшифровать схему циркуляции. [38] Этот же самый точный процесс можно также использовать для изучения движения и сброса грунтовых вод. [39]
Различные изотопы свинца могут быть использованы для изучения циркуляции в глобальном масштабе. Различные океаны (например, Атлантический, Тихий, Индийский и т. д.) имеют различные изотопные сигнатуры. Это является результатом различий в изотопных соотношениях осадков и пород в различных океанах. [40] Поскольку различные изотопы свинца имеют периоды полураспада 50–200 лет, недостаточно времени для гомогенизации изотопных соотношений по всему океану. Поэтому точный анализ изотопных соотношений Pb может быть использован для изучения циркуляции различных океанов. [41]
Изотопы с чрезвычайно длинными периодами полураспада и продукты их распада могут быть использованы для изучения многомиллионных процессов, таких как тектоника и экстремальные изменения климата. Например, при датировании рубидием-стронцием , изотопное отношение стронция ( 87 Sr/ 86 Sr) может быть проанализировано в ледяных кернах для изучения изменений в течение жизни Земли. Различия в этом отношении в ледяном керне будут указывать на значительные изменения в геохимии Земли. [41]
Вышеупомянутые процессы можно измерить с помощью природных изотопов. Тем не менее, антропогенные изотопы также чрезвычайно полезны для океанографических измерений. Испытания ядерного оружия высвободили множество необычных изотопов в мировом океане. 3 H, 129 I и 137 Cs можно обнаружить растворенными в морской воде, в то время как 241 Am и 238 Pu прикреплены к частицам. Изотопы, растворенные в воде, особенно полезны при изучении глобальной циркуляции. Например, различия в латеральных изотопных соотношениях в океане могут указывать на сильные водные фронты или круговороты. [42] И наоборот, изотопы, прикрепленные к частицам, можно использовать для изучения массопереноса в пределах водных столбов. Например, высокие уровни Am или Pu могут указывать на нисходящий поток при наблюдении на большой глубине или на восходящий поток при наблюдении на поверхности. [43]
{{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link) CS1 maint: numeric names: authors list (link){{cite book}}: CS1 maint: others (link)