stringtranslate.com

Искусственный синтез генов

Искусственный синтез генов , или просто синтез генов , относится к группе методов, которые используются в синтетической биологии для конструирования и сборки генов из нуклеотидов de novo . В отличие от синтеза ДНК в живых клетках, искусственный синтез генов не требует шаблонной ДНК, что позволяет синтезировать практически любую последовательность ДНК в лаборатории. Он состоит из двух основных этапов, первый из которых — твердофазный синтез ДНК , иногда известный как ДНК-печать . [1] Это производит олигонуклеотидные фрагменты, которые обычно составляют менее 200 пар оснований. Затем второй этап включает соединение этих олигонуклеотидных фрагментов с использованием различных методов сборки ДНК. Поскольку искусственный синтез генов не требует шаблонной ДНК, теоретически возможно создать полностью синтетическую молекулу ДНК без ограничений по последовательности нуклеотидов или размеру.

Синтез первого полного гена, дрожжевой тРНК , был продемонстрирован Хар Гобиндом Кораной и его коллегами в 1972 году. [2] Синтез первых генов, кодирующих пептиды и белки , был выполнен в лабораториях Герберта Бойера и Александра Маркхэма соответственно. [3] [4] Совсем недавно были разработаны методы синтеза искусственных генов, которые позволят собирать целые хромосомы и геномы. Первая синтетическая хромосома дрожжей была синтезирована в 2014 году, а также были синтезированы целые функциональные бактериальные хромосомы. [5] Кроме того, в будущем искусственный синтез генов может использовать новые пары азотистых оснований (неестественные пары оснований). [6] [7] [8]

Стандартные методы синтеза ДНК

Синтез олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды синтезируются химически с использованием строительных блоков, называемых нуклеозидными фосфорамидитами . Это могут быть нормальные или модифицированные нуклеозиды, которые имеют защитные группы для предотвращения неправильного взаимодействия их аминов, гидроксильных групп и фосфатных групп. За один раз добавляется один фосфорамидит, снимается защита с 5'-гидроксильной группы и добавляется новое основание и так далее. Цепь растет в направлении от 3' к 5', что является обратным по отношению к биосинтезу. В конце все защитные группы удаляются. Тем не менее, будучи химическим процессом, происходит несколько неправильных взаимодействий, приводящих к некоторым дефектным продуктам. Чем длиннее синтезируемая последовательность олигонуклеотида, тем больше в ней дефектов, поэтому этот процесс применим только для получения коротких последовательностей нуклеотидов . Текущий практический предел составляет около 200 п.н. ( пар оснований ) для олигонуклеотида достаточного качества, чтобы его можно было использовать непосредственно для биологического применения. ВЭЖХ можно использовать для выделения продуктов с правильной последовательностью. Между тем, большое количество олигонуклеотидов может быть синтезировано параллельно на генных чипах . Для оптимальной производительности в последующих процедурах генного синтеза их следует готовить индивидуально и в больших масштабах.

Соединение олигонуклеотидов на основе отжига

Обычно набор индивидуально разработанных олигонуклеотидов изготавливается на автоматизированных твердофазных синтезаторах, очищается и затем соединяется посредством специфического отжига и стандартных лигирующих или полимеразных реакций. Для повышения специфичности отжига олигонуклеотидов этап синтеза опирается на набор термостабильных ДНК- лигаз и полимеразных ферментов . На сегодняшний день описано несколько методов синтеза генов, таких как лигирование фосфорилированных перекрывающихся олигонуклеотидов, [2] [3] метод Fok I [4] и модифицированная форма лигазной цепной реакции для синтеза генов. Кроме того, описано несколько подходов к сборке ПЦР . [9] Обычно они используют олигонуклеотиды длиной 40-50 нуклеотидов, которые перекрывают друг друга. Эти олигонуклеотиды предназначены для покрытия большей части последовательности обеих цепей, а полноразмерная молекула генерируется постепенно с помощью ПЦР с перекрытием и удлинением (OE), [9] термодинамически сбалансированной ПЦР изнутри наружу (TBIO) [10] или комбинированных подходов. [11] Наиболее часто синтезируемые гены имеют размер от 600 до 1200 п.н., хотя гораздо более длинные гены были созданы путем соединения ранее собранных фрагментов размером менее 1000 п.н. В этом диапазоне размеров необходимо протестировать несколько клонов-кандидатов, подтверждающих последовательность клонированного синтетического гена с помощью методов автоматического секвенирования.

Ограничения

Более того, поскольку сборка полноразмерного генного продукта зависит от эффективного и специфического выравнивания длинных одноцепочечных олигонуклеотидов, критические параметры для успеха синтеза включают расширенные области последовательности, включающие вторичные структуры, вызванные инвертированными повторами, необычайно высоким или низким содержанием GC или повторяющимися структурами. Обычно эти сегменты конкретного гена могут быть синтезированы только путем разделения процедуры на несколько последовательных шагов и окончательной сборки более коротких подпоследовательностей, что, в свою очередь, приводит к значительному увеличению времени и трудозатрат, необходимых для его производства. Результат эксперимента по синтезу гена сильно зависит от качества используемых олигонуклеотидов. Для этих протоколов синтеза гена на основе отжига качество продукта напрямую и экспоненциально зависит от правильности используемых олигонуклеотидов. В качестве альтернативы, после выполнения синтеза гена с олигонуклеотидами более низкого качества необходимо приложить больше усилий для последующего обеспечения качества во время анализа клонов, что обычно выполняется с помощью трудоемких стандартных процедур клонирования и секвенирования. Другая проблема, связанная со всеми текущими методами синтеза генов, — это высокая частота ошибок последовательности из-за использования химически синтезированных олигонуклеотидов. Частота ошибок увеличивается с более длинными олигонуклеотидами, и, как следствие, процент правильного продукта резко уменьшается по мере использования большего количества олигонуклеотидов. Проблема мутации может быть решена с помощью более коротких олигонуклеотидов, используемых для сборки гена. Однако все методы сборки на основе отжига требуют смешивания праймеров в одной пробирке. В этом случае более короткие перекрытия не всегда позволяют точно и специфично отжигать комплементарные праймеры, что приводит к ингибированию образования полноразмерного продукта. Ручное проектирование олигонуклеотидов — это трудоемкая процедура, которая не гарантирует успешного синтеза нужного гена. Для оптимальной производительности почти всех методов на основе отжига предполагается, что температуры плавления перекрывающихся областей одинаковы для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ проектирования олигонуклеотидов. На данный момент представлено несколько решений для автоматизированного проектирования праймеров для синтеза генов. [12] [13] [14]

Процедуры исправления ошибок

Для преодоления проблем, связанных с качеством олигонуклеотидов, было разработано несколько сложных стратегий, использующих либо отдельно приготовленные олигонуклеотиды для ловли [15] , либо ферменты связывания несоответствий семейства mutS [16] , либо специфические эндонуклеазы из бактерий или фагов [17] . Тем не менее, все эти стратегии увеличивают время и затраты на синтез генов, основанный на отжиге химически синтезированных олигонуклеотидов.

Массовое параллельное секвенирование также использовалось в качестве инструмента для скрининга сложных библиотек олигонуклеотидов и обеспечения возможности извлечения точных молекул. В одном подходе олигонуклеотиды секвенируются на платформе пиросеквенирования 454, а роботизированная система получает изображения и выбирает отдельные бусины, соответствующие точной последовательности. [18] В другом подходе сложная библиотека олигонуклеотидов модифицируется уникальными фланкирующими тегами перед массовым параллельным секвенированием. Затем направленные на теги праймеры обеспечивают извлечение молекул с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР с набором номера. [19]

Все чаще гены упорядочиваются в наборы, включающие функционально связанные гены или множественные варианты последовательностей на одном гене. Практически все терапевтические белки в разработке, такие как моноклональные антитела, оптимизируются путем тестирования многих вариантов генов для улучшения функции или экспрессии.

Неестественные пары оснований

В то время как традиционный синтез нуклеиновых кислот использует только 4 пары оснований — аденин, тимин, гуанин и цитозин, синтез олигонуклеотидов в будущем может включать использование неестественных пар оснований, которые представляют собой искусственно созданные и синтезированные нуклеиновые основания, не встречающиеся в природе.

В 2012 году группа американских ученых во главе с Флойдом Ромесбергом, химическим биологом из Научно-исследовательского института Скриппса в Сан-Диего, Калифорния, опубликовала, что его команда разработала неестественную пару оснований (UBP). Два новых искусственных нуклеотида или неестественная пара оснований (UBP) были названы d5SICS и dNaM . Более технически, эти искусственные нуклеотиды , несущие гидрофобные азотистые основания , имеют два слитых ароматических кольца , которые образуют комплекс (d5SICS–dNaM) или пару оснований в ДНК. В 2014 году та же группа из Научно-исследовательского института Скриппса сообщила, что они синтезировали участок кольцевой ДНК, известный как плазмида, содержащий естественные пары оснований TA и CG вместе с наиболее эффективным UBP, разработанным лабораторией Ромесберга, и вставили его в клетки распространенной бактерии E. coli , которая успешно реплицировала неестественные пары оснований на протяжении нескольких поколений. Это первый известный пример живого организма, передающего расширенный генетический код последующим поколениям. Это было частично достигнуто путем добавления поддерживающего гена водоросли, который экспрессирует транспортер нуклеотидтрифосфата , который эффективно импортирует трифосфаты как d5SICSTP, так и dNaMTP в бактерии E. coli . Затем естественные пути бактериальной репликации используют их для точной репликации плазмиды, содержащей d5SICS–dNaM.

Успешное включение третьей пары оснований является значительным прорывом на пути к цели значительного расширения числа аминокислот , которые могут быть закодированы ДНК, с существующих 20 аминокислот до теоретически возможных 172, тем самым расширяя потенциал живых организмов для производства новых белков . [20] В будущем эти неестественные пары оснований можно будет синтезировать и включать в олигонуклеотиды с помощью методов ДНК-печати.

сборка ДНК

Таким образом, печать ДНК может использоваться для производства частей ДНК, которые определяются как последовательности ДНК, кодирующие определенную биологическую функцию (например, промоторы , последовательности регуляции транскрипции или открытые рамки считывания ). [21] Однако, поскольку синтез олигонуклеотидов обычно не может точно производить последовательности олигонуклеотидов длиной более нескольких сотен пар оснований, необходимо использовать методы сборки ДНК для сборки этих частей вместе для создания функциональных генов, многогенных цепей или даже целых синтетических хромосом или геномов. Некоторые методы сборки ДНК определяют только протоколы для соединения частей ДНК, в то время как другие методы также определяют правила для формата частей ДНК, которые совместимы с ними. Эти процессы можно масштабировать, чтобы обеспечить сборку целых хромосом или геномов. В последние годы наблюдается рост числа различных стандартов сборки ДНК, и по состоянию на 2015 год было разработано 14 различных стандартов сборки, каждый из которых имеет свои плюсы и минусы. [22] В целом, разработка стандартов сборки ДНК значительно облегчила рабочий процесс синтетической биологии, способствовала обмену материалами между исследовательскими группами, а также позволила создавать модульные и многоразовые части ДНК. [22]

Различные методы сборки ДНК можно разделить на три основные категории: сборка с помощью эндонуклеазы, сайт-специфическая рекомбинация и сборка на основе длинных перекрытий. [22] Каждая группа методов имеет свои отличительные характеристики, а также свои преимущества и ограничения.

Сборка, опосредованная эндонуклеазой

Эндонуклеазы — это ферменты, которые распознают и расщепляют сегменты нуклеиновых кислот, и их можно использовать для управления сборкой ДНК. Из различных типов рестриктаз наиболее доступны и используются рестриктазы типа II, поскольку их сайты расщепления расположены вблизи или в их сайтах распознавания. Следовательно, методы сборки с помощью эндонуклеазы используют это свойство для определения частей ДНК и протоколов сборки.

Биокирпичи

Сборка BBF RFC 10 двух совместимых частей BioBricks. Обработка фрагмента вверх по течению с помощью EcoRI и SpeI, а фрагмента вниз по течению с помощью EcoRI и XbaI позволяет производить сборку в желаемой последовательности. Поскольку SpeI и XbaI создают комплементарные выступы, они помогают связать два фрагмента ДНК вместе, создавая последовательность рубца. Все исходные сайты рестрикции сохраняются в конечной конструкции, которую затем можно использовать для дальнейших реакций BioBricks.

Стандарт сборки BioBricks был описан и представлен Томом Найтом в 2003 году и с тех пор постоянно обновляется. [23] В настоящее время наиболее часто используемым стандартом BioBricks является стандарт сборки 10, или BBF RFC 10. BioBricks определяет последовательности префиксов и суффиксов, необходимые для того, чтобы часть ДНК была совместима с методом сборки BioBricks, что позволяет объединять все части ДНК, имеющие формат BioBricks.

Префикс содержит сайты рестрикции для EcoRI, NotI и XBaI, в то время как суффикс содержит сайты рестрикции SpeI, NotI и PstI. За пределами областей префикса и суффикса часть ДНК не должна содержать этих сайтов рестрикции. Чтобы соединить две части BioBrick вместе, одна из плазмид расщепляется EcoRI и SpeI, в то время как вторая плазмида расщепляется EcoRI и XbaI. Два выступа EcoRI являются комплементарными и, таким образом, будут отжигаться вместе, в то время как SpeI и XbaI также образуют комплементарные выступы, которые также могут быть лигированы вместе. Поскольку полученная плазмида содержит исходные последовательности префикса и суффикса, ее можно использовать для соединения с большим количеством частей BioBricks. [24] Из-за этого свойства стандарт сборки BioBricks считается идемпотентным по своей природе. Однако между двумя слитыми BioBricks также будет образована последовательность «шрама» (либо TACTAG, либо TACTAGAG). Это предотвращает использование BioBricks для создания белков слияния, поскольку последовательность шрама 6bp кодирует тирозин и стоп-кодон, вызывая прекращение трансляции после экспрессии первого домена, в то время как последовательность шрама 8bp вызывает сдвиг рамки , предотвращая непрерывное считывание кодонов. Чтобы предложить альтернативные последовательности шрама, которые, например, дают шрам 6bp, или последовательности шрама, которые не содержат стоп-кодонов, были разработаны другие стандарты сборки, такие как BB-2 Assembly, BglBricks Assembly, Silver Assembly и Freiburg Assembly. [25] [26] [27] [28]

Хотя самый простой способ сборки деталей BioBrick описан выше, существуют также несколько других часто используемых методов сборки, которые предлагают несколько преимуществ по сравнению со стандартной сборкой. Сборка с 3 антибиотиками (3A) позволяет выбрать правильную сборку с помощью выбора антибиотика, в то время как усиленная сборка вставки стремится преодолеть низкую эффективность трансформации, наблюдаемую в сборке 3A. [29] [30]

Стандарт сборки BioBrick также послужил источником вдохновения для использования других типов эндонуклеаз для сборки ДНК. Например, как стандарт iBrick, так и стандарты сборки векторов HomeRun используют хоуминг-эндонуклеазы вместо рестриктаз типа II. [31] [32]

Сборка эндонуклеазы рестрикции типа IIs

Некоторые методы сборки также используют эндонуклеазы рестрикции типа IIs. Они отличаются от других эндонуклеаз типа II тем, что они разрезают несколько пар оснований от сайта распознавания. В результате последовательность выступа может быть изменена так, чтобы она содержала желаемую последовательность. Это дает методам сборки типа IIs два преимущества — это позволяет производить сборку «без рубцов» и сборку из нескольких частей в одном сосуде. Методы сборки, которые используют эндонуклеазы типа IIs, включают Golden Gate и связанные с ним варианты.

Клонирование Golden Gate
Последовательность частей ДНК для сборки Golden Gate может быть направлена ​​путем определения уникальных комплементарных выступов для каждой части. Таким образом, для сборки гена 1 в порядке фрагментов A, B и C, выступ 3' для фрагмента A комплементарен выступу 5' для фрагмента B, и аналогично для фрагмента B и фрагмента C. Для целевой плазмиды селективный маркер фланкирован внешними разрезающими сайтами рестрикции BsaI. Это вырезает селективный маркер, позволяя вставить конечную конструкцию. Лигаза T4 используется для лигирования фрагментов вместе и с целевой плазмидой.

Протокол сборки Golden Gate был определен Энглером и др. в 2008 году для определения метода сборки ДНК, который даст конечную конструкцию без последовательности рубцов, а также без исходных сайтов рестрикции. Это позволяет экспрессировать белок, не содержащий нежелательных последовательностей белка, которые могут негативно повлиять на сворачивание или экспрессию белка. Используя фермент рестрикции BsaI, который производит выступ из 4 пар оснований, для сборки можно использовать до 240 уникальных, непалиндромных последовательностей. [33]

Проектирование и сборка плазмиды

При клонировании Golden Gate каждый фрагмент ДНК, который должен быть собран, помещается в плазмиду, фланкированную обращенными внутрь сайтами рестрикции BsaI, содержащими запрограммированные последовательности выступов. Для каждого фрагмента ДНК последовательность 3'-выступа комплементарен 5'-выступу следующего нижестоящего фрагмента ДНК. Для первого фрагмента 5'-выступ комплементарен 5'-выступу целевой плазмиды, в то время как 3'-выступ конечного фрагмента комплементарен 3'-выступу целевой плазмиды. Такая конструкция позволяет собирать все фрагменты ДНК в реакции в одном сосуде (где все реагенты смешиваются вместе), при этом все фрагменты располагаются в правильной последовательности. Успешно собранные конструкции отбираются путем обнаружения потери функции кассеты скрининга, которая изначально была в целевой плазмиде. [33]

MoClo и Золотая коса

Оригинальная сборка Golden Gate допускает создание только одной конструкции в векторе назначения. Чтобы использовать эту конструкцию в последующей реакции в качестве вектора входа, были разработаны стандарты MoClo и Golden Braid. [34]

Стандарт MoClo предполагает определение нескольких уровней сборки ДНК:

Каждый уровень сборки чередует использование сайтов рестрикции BsaI и BpiI для минимизации количества запрещенных сайтов, а последовательная сборка для каждого уровня достигается путем следования дизайну плазмиды Golden Gate. В целом, стандарт MoClo позволяет собирать конструкцию, содержащую несколько единиц транскрипции, все собранные из разных частей ДНК, с помощью серии реакций Golden Gate в одном сосуде. Однако один из недостатков стандарта MoClo заключается в том, что он требует использования «фиктивных частей» без биологической функции, если для окончательной конструкции требуется менее четырех составных частей. [35] Стандарт Golden Braid, с другой стороны, ввел попарный стандарт сборки Golden Gate.

Стандарт Golden Braid использует ту же многоуровневую сборку, что и MoClo, но каждый уровень включает сборку только двух фрагментов ДНК, т. е. попарный подход. Таким образом, на каждом уровне пары генов клонируются в целевой фрагмент в желаемой последовательности, и они впоследствии собираются по два за раз в последовательных уровнях. Как и MoClo, стандарт Golden Braid чередует ферменты рестрикции BsaI и BpiI между каждым уровнем.

Разработка методов сборки Golden Gate и их вариантов позволила исследователям разработать наборы инструментов для ускорения рабочего процесса синтетической биологии. Например, EcoFlex был разработан как набор инструментов для E. Coli , который использует стандарт MoClo для своих частей ДНК, в то время как аналогичный набор инструментов был также разработан для инженерии микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii . [36] [37]

Сайт-специфическая рекомбинация

Краткое изложение основных технологий клонирования шлюзов.

Сайт-специфическая рекомбинация использует фаговые интегразы вместо ферментов рестрикции, устраняя необходимость иметь сайты рестрикции во фрагментах ДНК. Вместо этого интегразы используют уникальные сайты прикрепления (att) и катализируют перестройку ДНК между целевым фрагментом и вектором назначения. Система клонирования Invitrogen Gateway была изобретена в конце 1990-х годов и использует две запатентованные смеси ферментов, клоназу BP и клоназу LR. Смесь клоназы BP катализирует рекомбинацию между сайтами attB и attP, генерируя гибридные сайты attL и attR, в то время как смесь клоназы LR катализирует рекомбинацию сайтов attL и attR, давая сайты attB и attP. Поскольку каждая смесь ферментов распознает только определенные сайты att, рекомбинация является высокоспецифичной, и фрагменты могут быть собраны в желаемой последовательности. [38]

Векторный дизайн и сборка

Поскольку клонирование Gateway является запатентованной технологией, все реакции Gateway должны проводиться с помощью набора Gateway, предоставленного производителем. Реакцию можно обобщить в два этапа. Первый этап включает сборку входных клонов, содержащих интересующий фрагмент ДНК, в то время как второй этап включает вставку этого интересующего фрагмента в целевой клон.

  1. Входные клоны должны быть сделаны с использованием предоставленных векторов "Donor", содержащих кассету Gateway, фланкированную сайтами attP. Кассета Gateway содержит бактериальный ген самоубийства (например, ccdB ), который позволит выживать и выбирать успешно рекомбинированные входные клоны. Пара сайтов attB добавляется для фланкирования интересующего фрагмента ДНК, и это позволит рекомбинировать с сайтами attP при добавлении смеси клоназы BP. Клоны входа производятся, и интересующий фрагмент фланкируется сайтами attL.
  2. Вектор назначения также поставляется с кассетой Gateway, но вместо этого окружен парой сайтов attR. Смешивание этой плазмиды назначения с клонами входа и смесью клоназы LR позволит рекомбинации произойти между сайтами attR и attL. Получается клон назначения, в который успешно вставлен интересующий фрагмент. Летальный ген вставляется в исходный вектор, и бактерии, трансформированные этой плазмидой, погибают. Таким образом, можно легко выбрать нужный вектор.

Самые ранние итерации метода клонирования Gateway позволяли использовать только один клон входа для каждого произведенного клона назначения. Однако дальнейшие исследования показали, что можно сгенерировать еще четыре ортогональных последовательности att, что позволяет собирать до четырех различных фрагментов ДНК, и этот процесс теперь известен как технология Multisite Gateway. [39]

Помимо клонирования Gateway, были разработаны некоммерческие методы с использованием других интеграз. Например, метод Serine Integrase Recombinational Assembly (SIRA) использует интегразу ϕC31, в то время как метод Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly (SSRTA) использует интегразу Streptomyces phage φBT1. [40] [41] Другие методы, такие как HomeRun Vector Assembly System (HVAS), основаны на системе клонирования Gateway и дополнительно включают хоуминговые эндонуклеазы для разработки протокола, который потенциально может поддерживать промышленный синтез синтетических конструкций ДНК. [31]

Методы сборки на основе длинных перекрытий требуют наличия длинных областей перекрытия на участках ДНК, которые должны быть собраны. Это позволяет строить комплементарные свесы, которые могут отжигаться посредством комплементарного спаривания оснований. Существует множество методов, например, сборка Гибсона, CPEC, MODAL, которые используют эту концепцию для сборки ДНК.

Сборка с длинным перекрытием

В последние годы было разработано множество методов сборки на основе длинных перекрытий. Один из наиболее часто используемых методов, метод сборки Гибсона, был разработан в 2009 году и обеспечивает метод сборки ДНК в одном сосуде, который не требует использования ферментов рестрикции или интеграз. [42] Другие похожие методы сборки на основе перекрытий включают кольцевое клонирование полимеразы (CPEC), клонирование, независимое от последовательности и лигазы (SLIC) и извлечение бесшовного лигирования клонирования (SLiCE). [43] [44] [45] Несмотря на наличие множества методов сборки на основе перекрытий, метод сборки Гибсона по-прежнему остается самым популярным. [46] Помимо методов, перечисленных выше, другие исследователи основывались на концепциях, используемых в сборке Гибсона и других методах сборки, для разработки новых стратегий сборки, таких как стратегия модульной сборки с направленным перекрытием и линкерами (MODAL) или метод стандарта сборки Biopart для идемпотентного клонирования (BASIC). [47] [48]

сборка Гибсона

Метод сборки Гибсона — это относительно простой метод сборки ДНК, требующий всего нескольких дополнительных реагентов: 5' T5 экзонуклеаза , Phusion ДНК полимераза и Taq ДНК лигаза . Фрагменты ДНК, которые должны быть собраны, синтезируются так, чтобы иметь перекрывающиеся 5' и 3' концы в том порядке, в котором они должны быть собраны. Эти реагенты смешиваются с фрагментами ДНК, которые должны быть собраны, при температуре 50 °C, и происходят следующие реакции:

  1. Экзонуклеаза Т5 отщепляет ДНК от 5'-конца каждого фрагмента, обнажая 3'-выступы на каждом фрагменте ДНК.
  2. Комплементарные выступы на соседних фрагментах ДНК отжигаются посредством комплементарного спаривания оснований.
  3. ДНК-полимераза Phusion заполняет любые пробелы, в которых фрагменты отжигаются.
  4. ДНК-лигаза Taq восстанавливает разрывы на обеих цепях ДНК.

Поскольку экзонуклеаза T5 термолабильна, она инактивируется при 50 °C после начального этапа жевания. Таким образом, продукт стабилен, а фрагменты собираются в желаемом порядке. Этот однореакторный протокол может точно собрать до 5 различных фрагментов, в то время как у нескольких коммерческих поставщиков есть наборы для точной сборки до 15 различных фрагментов в двухэтапной реакции. [49] Однако, хотя протокол сборки Гибсона является быстрым и использует относительно мало реагентов, он требует индивидуального синтеза ДНК, поскольку каждый фрагмент должен быть разработан так, чтобы содержать перекрывающиеся последовательности с соседними фрагментами и амплифицирован с помощью ПЦР. Эта зависимость от ПЦР может также повлиять на точность реакции, когда используются длинные фрагменты, фрагменты с высоким содержанием GC или повторяющиеся последовательности. [48]

Стандарт MODAL обеспечивает общий формат, позволяющий сделать любую часть ДНК совместимой со сборкой Гибсона или другими методами перекрывающейся сборки. Интересующий фрагмент ДНК проходит два раунда ПЦР, сначала для присоединения префикса адаптера и суффиксов, а затем для присоединения предопределенных последовательностей линкера. Как только части находятся в требуемом формате, можно выполнять методы сборки, такие как сборка Гибсона. Порядок частей задается линкерами, то есть одна и та же последовательность линкера присоединяется к 3'-концу восходящей части и к 5'-концу нисходящей части.

Стратегия MODAL определяет перекрывающиеся последовательности, известные как «линкеры», для уменьшения объема настройки, которую необходимо выполнить с каждым фрагментом ДНК. Линкеры были разработаны с использованием программного обеспечения R2oDNA Designer, а области перекрытия были разработаны длиной 45 п.н. для совместимости со сборкой Гибсона и другими методами перекрывающейся сборки. Чтобы прикрепить эти линкеры к частям, которые должны быть собраны, ПЦР проводится с использованием праймеров, специфичных для частей, содержащих префиксные и суффиксные последовательности адаптеров длиной 15 п.н. Затем линкеры присоединяются к последовательностям адаптеров с помощью второй реакции ПЦР. Для позиционирования фрагментов ДНК тот же линкер будет присоединен к суффиксу желаемого вышестоящего фрагмента и префиксу желаемых нижестоящих фрагментов. После присоединения линкеров можно использовать сборку Гибсона, CPEC или другие методы перекрывающейся сборки для сборки фрагментов ДНК в желаемом порядке.

БАЗОВЫЙ

Стратегия сборки BASIC была разработана в 2015 году и направлена ​​на устранение ограничений предыдущих методов сборки, включив в себя шесть ключевых концепций из них: стандартные повторно используемые детали; одноуровневый формат (все детали имеют одинаковый формат и собираются с использованием одного и того же процесса); идемпотентное клонирование; параллельная (многокомпонентная) сборка ДНК; независимость от размера; автоматизируемость. [48]

Части ДНК и конструкция линкера

Части ДНК проектируются и клонируются в плазмиды хранения, причем часть фланкируется последовательностью интегрированного префикса ( i P) и интегрированного суффикса ( i S). Последовательности i P и i S содержат обращенные внутрь сайты рестрикции BsaI, которые содержат выступы, комплементарные линкерам BASIC. [48] Как и в MODAL, 7 стандартных линкеров, используемых в BASIC, были разработаны с помощью программного обеспечения R2oDNA Designer и проверены, чтобы гарантировать, что они не содержат последовательностей с гомологией с геномами шасси, и что они не содержат нежелательных последовательностей, таких как последовательности вторичной структуры, сайты рестрикции или сайты связывания рибосом. Каждая последовательность линкера разделена на две половины, каждая с выступом в 4 п.н., комплементарным сайту рестрикции BsaI, двухцепочечной последовательностью в 12 п.н. и общей последовательностью перекрытия в 21 п.н. с другой половиной. Половина, которая будет связываться с восходящей частью ДНК, известна как часть суффиксного линкера (например, L1S), а половина, которая связывается с нисходящей частью, известна как часть префиксного линкера (например, L1P). Эти линкеры формируют основу сборки частей ДНК вместе.

Помимо указания порядка сборки, стандартные линкеры BASIC также могут быть модифицированы для выполнения других функций. Для обеспечения идемпотентной сборки линкеры также были разработаны с дополнительными метилированными последовательностями i P и i S, вставленными для защиты их от распознавания BsaI. Это метилирование теряется после трансформации и репликации плазмиды in vivo, и плазмиды могут быть извлечены, очищены и использованы для дальнейших реакций.

Поскольку последовательность линкера относительно длинная (45 п.н. для стандартного линкера), есть возможность включить функциональные последовательности ДНК, чтобы уменьшить количество частей ДНК, необходимых во время сборки. Стандарт сборки BASIC предоставляет несколько линкеров, встроенных в RBS различной прочности. Аналогично, чтобы облегчить построение белков слияния, содержащих несколько доменов белка, также было разработано несколько линкеров слияния, чтобы обеспечить полное считывание конструкции ДНК. Эти линкеры слияния кодируют полипептид из 15 аминокислот глицина и серина, который является идеальным линкерным пептидом для белков слияния с несколькими доменами.

Сборка

Сборка готовой конструкции состоит из трех основных этапов.

  1. Сначала из плазмиды хранения вырезаются части ДНК, в результате чего получается фрагмент ДНК с выступающими концами BsaI на 3'- и 5'-концах.
  2. Затем каждая часть линкера присоединяется к соответствующей части ДНК путем инкубации с ДНК-лигазой T4. Каждая часть ДНК будет иметь суффикс и префикс линкерной части из двух разных линкеров для указания порядка сборки. Например, первая часть в последовательности будет иметь L1P и L2S, а вторая часть будет иметь L2P и L3S. Линкерные части можно менять, чтобы изменить последовательность сборки.
  3. Наконец, части с присоединенными линкерами собираются в плазмиду путем инкубации при 50 °C. 21-пн выступы линкеров P и S отжигаются, и конечная конструкция может быть трансформирована в бактериальные клетки для клонирования. Одноцепочечные разрывы восстанавливаются in vivo после трансформации, создавая стабильную конечную конструкцию, клонированную в плазмиды.

Приложения

Поскольку методы печати ДНК и сборки ДНК позволили коммерческому синтезу генов стать прогрессивно и экспоненциально дешевле за последние годы, [50] искусственный синтез генов представляет собой мощный и гибкий инженерный инструмент для создания и проектирования новых последовательностей ДНК и функций белков. Помимо синтетической биологии, различные области исследований, такие как области, связанные с гетерологичной экспрессией генов , разработкой вакцин , генной терапией и молекулярной инженерией, получили бы большую выгоду от наличия быстрых и дешевых методов синтеза ДНК для кодирования белков и пептидов. [51] Методы, используемые для печати и сборки ДНК, даже позволили использовать ДНК в качестве носителя информации .

Синтез бактериальных геномов

Синтия иMycoplasma лаборатория

28 июня 2007 года группа ученых из Института Дж. Крейга Вентера опубликовала статью в журнале Science Express , в которой говорилось, что им удалось успешно пересадить природную ДНК бактерии Mycoplasma mycoides в клетку Mycoplasma capricolum , создав бактерию, которая вела себя как M. mycoides . [52]

6 октября 2007 года Крейг Вентер объявил в интервью британской газете The Guardian , что та же команда искусственно синтезировала модифицированную версию единственной хромосомы Mycoplasma genitalium . Хромосома была модифицирована для устранения всех генов, которые, как показали испытания на живых бактериях, были ненужными. Следующим запланированным шагом в этом проекте минимального генома является трансплантация синтезированного минимального генома в бактериальную клетку с удаленной старой ДНК; полученная бактерия будет называться Mycoplasma laboratorium . На следующий день канадская группа по биоэтике ETC Group опубликовала заявление через своего представителя Пэта Муни , в котором говорилось, что «творение» Вентера было «шасси, на котором можно построить почти все». Синтезированный геном еще не был трансплантирован в рабочую клетку. [53]

21 мая 2010 года журнал Science сообщил, что группа Вентера успешно синтезировала геном бактерии Mycoplasma mycoides из компьютерной записи и пересадила синтезированный геном в существующую клетку бактерии Mycoplasma capricolum , из которой была удалена ДНК. «Синтетическая» бактерия оказалась жизнеспособной, то есть способной реплицироваться миллиарды раз. Первоначально команда планировала использовать бактерию M. genitalium , с которой они работали ранее, но переключилась на M. mycoides , поскольку последняя бактерия растет гораздо быстрее, что привело к более быстрым экспериментам. [54] Вентер описывает ее как «первый вид..., чьим родителем был компьютер». [55] Трансформированную бактерию ETC окрестила « Synthia ». Представитель Вентера отказался подтвердить какой-либо прорыв на момент написания этой статьи.

Синтетические дрожжи 2.0

В рамках проекта Synthetic Yeast 2.0 различные исследовательские группы по всему миру приняли участие в проекте по синтезу синтетических геномов дрожжей и посредством этого процесса оптимизации генома модельного организма Saccharomyces cerevisiae . [56] Проект Yeast 2.0 применял различные методы сборки ДНК, которые обсуждались выше, и в марте 2014 года Джеф Бёке из Медицинского центра Лангоне при Нью-Йоркском университете сообщил, что его команда синтезировала хромосому III S. cerevisiae . [57] [58] Процедура включала замену генов в исходной хромосоме синтетическими версиями, а затем готовую синтетическую хромосому интегрировали в дрожжевую клетку. Для этого потребовалось разработать и создать 273 871 пару оснований ДНК — меньше, чем 316 667 пар в исходной хромосоме. В марте 2017 года синтез 6 из 16 хромосом был завершен, а синтез остальных все еще продолжался. [59]

Смотрите также

Примечания

  1. ^ Stein R (7 мая 2015 г.). «Печать ДНК — большое благо для исследований, но некоторые вызывают опасения». All Things Considered . National Public Radio.
  2. ^ ab Khorana HG, Agarwal KL, Büchi H, Caruthers MH, Gupta NK, Kleppe K, et al. (декабрь 1972 г.). «Исследования полинуклеотидов. 103. Полный синтез структурного гена для рибонуклеиновой кислоты, переносящей аланин, из дрожжей». Журнал молекулярной биологии . 72 (2): 209–17. doi :10.1016/0022-2836(72)90146-5. PMID  4571075.
  3. ^ ab Итакура К., Хиросе Т., Креа Р., Риггс А.Д., Хейнекер Х.Л., Боливар Ф., Бойер Х.В. (декабрь 1977 г.). «Экспрессия в Escherichia coli химически синтезированного гена гормона соматостатина». Наука . 198 (4321): 1056–63. Бибкод : 1977Sci...198.1056I. дои : 10.1126/science.412251. ПМИД  412251.
  4. ^ ab Edge MD, Green AR, Heathcliffe GR, Meacock PA, Schuch W, Scanlon DB и др. (август 1981 г.). «Полный синтез гена человеческого лейкоцитарного интерферона». Nature . 292 (5825): 756–62. Bibcode :1981Natur.292..756E. doi :10.1038/292756a0. PMID  6167861. S2CID  4330168.
  5. ^ Шукман Д. (2014-03-27). «Прогресс в области синтетической ДНК приветствуется». BBC News . Получено 11 апреля 2020 г.
  6. ^ Кимото М., Ямашигэ Р., Мацунага К., Ёкояма С., Хирао И. (май 2013 г.). «Создание высокоаффинных ДНК-аптамеров с использованием расширенного генетического алфавита». Nature Biotechnology . 31 (5): 453–7. doi :10.1038/nbt.2556. PMID  23563318. S2CID  23329867.
  7. ^ Малышев ДА, Дхами К, Куах ХТ, Лавергн Т, Ордоуханян П, Торкамани А, Ромесберг ФЭ (июль 2012 г.). «Эффективная и независимая от последовательности репликация ДНК, содержащей третью пару оснований, устанавливает функциональный шестибуквенный генетический алфавит». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (30): 12005–10. Bibcode : 2012PNAS..10912005M. doi : 10.1073/pnas.1205176109 . PMC 3409741. PMID  22773812 . 
  8. ^ Малышев ДА, Дхами К, Лавернь Т, Чен Т, Дай Н, Фостер Дж. М. и др. (Май 2014). «Полусинтетический организм с расширенным генетическим алфавитом». Nature . 509 (7500): 385–8. Bibcode :2014Natur.509..385M. doi :10.1038/nature13314. PMC 4058825 . PMID  24805238. 
  9. ^ ab Fuhrmann M, Oertel W, Hegemann P (август 1999). «Синтетический ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), является универсальным репортером в Chlamydomonas reinhardtii». The Plant Journal . 19 (3): 353–61. doi : 10.1046/j.1365-313X.1999.00526.x . PMID  10476082.
  10. ^ Mandecki W, Bolling TJ (август 1988). "Метод синтеза генов FokI". Gene . 68 (1): 101–7. doi :10.1016/0378-1119(88)90603-8. PMID  3265397.
  11. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (октябрь 1995 г.). «Одношаговая сборка гена и целой плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Gene . 164 (1): 49–53. doi :10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
  12. ^ Gao X, Yo P, Keith A, Ragan TJ, Harris TK (ноябрь 2003 г.). «Термодинамически сбалансированный синтез генов на основе ПЦР изнутри наружу (TBIO): новый метод проектирования праймеров для высокоточной сборки более длинных последовательностей генов». Nucleic Acids Research . 31 (22): 143e–143. doi :10.1093/nar/gng143. PMC 275580. PMID  14602936 . 
  13. ^ Young L, Dong Q (апрель 2004 г.). "Двухшаговый метод полного синтеза генов". Nucleic Acids Research . 32 (7): e59. doi :10.1093/nar/gnh058. PMC 407838. PMID  15087491 . 
  14. ^ Hillson NJ, Rosengarten RD, Keasling JD (январь 2012 г.). "j5 DNA assembly design automation software". ACS Synthetic Biology . 1 (1): 14–21. doi :10.1021/sb2000116. PMID  23651006.
  15. ^ Hoover DM, Lubkowski J (май 2002 г.). «DNAWorks: автоматизированный метод проектирования олигонуклеотидов для синтеза генов на основе ПЦР». Nucleic Acids Research . 30 (10): 43e–43. doi :10.1093/nar/30.10.e43. PMC 115297. PMID  12000848 . 
  16. ^ Виллалобос А., Несс Дж. Э., Густафссон К., Миншалл Дж., Говиндараджан С. (июнь 2006 г.). «Gene Designer: инструмент синтетической биологии для построения искусственных сегментов ДНК». BMC Bioinformatics . 7 : 285. doi : 10.1186/1471-2105-7-285 . PMC 1523223. PMID  16756672 . 
  17. ^ Tian J, Gong H, Sheng N, Zhou X, Gulari E, Gao X, Church G (декабрь 2004 г.). «Точный мультиплексный синтез генов с помощью программируемых ДНК-микрочипов» (PDF) . Nature . 432 (7020): 1050–4. Bibcode : 2004Natur.432.1050T. doi : 10.1038/nature03151. hdl : 2027.42/62677 . PMID  15616567. S2CID  4373350.
  18. ^ Matzas M, Stähler PF, Kefer N, Siebelt N, Boisguérin V, Leonard JT и др. (декабрь 2010 г.). «Высокоточный синтез генов путем извлечения ДНК с проверенной последовательностью, идентифицированной с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования». Nature Biotechnology . 28 (12): 1291–4. doi :10.1038/nbt.1710. PMC 3579223 . PMID  21113166. 
  19. ^ Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (сентябрь 2012 г.). «Точный синтез генов с направленным на теги извлечением молекул ДНК с проверенной последовательностью». Nature Methods . 9 (9): 913–5. doi :10.1038/nmeth.2137. PMC 3433648 . PMID  22886093. 
  20. ^ Weidman C (2017-12-06). "Расширение генетического алфавита". Блог . Гарвардский университет . Получено 2020-04-17 .
  21. ^ "Справка:Синтетическая биология - parts.igem.org". parts.igem.org . Получено 2020-04-11 .
  22. ^ abc Casini A, Storch M, Baldwin GS, Ellis T (сентябрь 2015 г.). «Кирпичи и чертежи: методы и стандарты сборки ДНК». Nature Reviews. Молекулярная клеточная биология . 16 (9): 568–76. doi : 10.1038/nrm4014. hdl : 10044/1/31281 . PMID  26081612. S2CID  3502437.
  23. ^ Knight T (2003). «Идемпотентный векторный дизайн для стандартной сборки биокирпичей». Рабочая группа синтетической биологии Массачусетского технологического института . hdl :1721.1/21168.
  24. ^ Røkke G, Korvald E, Pahr J, Oyås O, Lale R (2014). "Стандарты и методы сборки BioBrick и сопутствующие программные средства". В Valla S, Lale R (ред.). Методы клонирования и сборки ДНК . Методы в молекулярной биологии. Т. 1116. Клифтон, Нью-Джерси, стр. 1–24. doi :10.1007/978-1-62703-764-8_1. ISBN 978-1-62703-763-1. PMID  24395353.{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
  25. ^ Knight T (19.11.2008). «Проект стандарта для биологических деталей Biobrick BB-2». BBF RFC . 12. hdl :1721.1/45139.
  26. ^ Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, Wu GC, Goler JA, Arkin AP, Keasling JD (январь 2010 г.). "BglBricks: гибкий стандарт для биологической сборки деталей". Журнал биологической инженерии . 4 (1): 1. doi : 10.1186/1754-1611-4-1 . PMC 2822740. PMID  20205762 . 
  27. ^ Филлипс И., Сильвер П. (2006-04-20). «Новая стратегия сборки биокирпичей, разработанная для легкой белковой инженерии». hdl :1721.1/32535.
  28. ^ Грюнберг Р., Арндт К., Мюллер К. (18 апреля 2009 г.). «Стандарт сборки биокирпича слитого белка (Фрайбург)». ББФ РФЦ . 25 . hdl : 1721.1/45140.
  29. ^ Shetty R, Lizarazo M, Rettberg R, Knight TF (2011). «Сборка стандартных биологических деталей BioBrick с использованием трехкомпонентной сборки антибиотиков». Синтетическая биология, часть B — Автоматизированное проектирование и сборка ДНК . Методы в энзимологии. Том 498. С. 311–26. doi : 10.1016/B978-0-12-385120-8.00013-9. hdl : 1721.1/65066 . ISBN 9780123851208. PMID  21601683.
  30. ^ Speer MA, Richard TL (декабрь 2011 г.). «Усиленная сборка вставок: оптимизированный подход к стандартной сборке генетических цепей BioBrickTM». Журнал биологической инженерии . 5 (1): 17. doi : 10.1186/1754-1611-5-17 . PMC 3287150. PMID  22176971 . 
  31. ^ ab Li MV, Shukla D, Rhodes BH, Lall A, Shu J, Moriarity BS, Largaespada DA (2014-06-24). "HomeRun Vector Assembly System: гибкая и стандартизированная система клонирования для сборки многомодульных конструкций ДНК". PLOS ONE . ​​9 (6): e100948. Bibcode :2014PLoSO...9j0948L. doi : 10.1371/journal.pone.0100948 . PMC 4069157 . PMID  24959875. 
  32. ^ Liu JK, Chen WH, Ren SX, Zhao GP, Wang J (2014-10-20). "iBrick: новый стандарт для итеративной сборки биологических частей с самонаводящимися эндонуклеазами". PLOS ONE . ​​9 (10): e110852. Bibcode :2014PLoSO...9k0852L. doi : 10.1371/journal.pone.0110852 . PMC 4203835 . PMID  25329380. 
  33. ^ ab Engler C, Kandzia R, Marillonnet S (2008-11-05). "Одностадийный, одношаговый, точный метод клонирования с высокой пропускной способностью". PLOS ONE . ​​3 (11): e3647. Bibcode :2008PLoSO...3.3647E. doi : 10.1371/journal.pone.0003647 . PMC 2574415 . PMID  18985154. 
  34. ^ Вебер Э., Энглер К., Грюцнер Р., Вернер С., Мариллонне С. (февраль 2011 г.). «Модульная система клонирования для стандартизированной сборки мультигенных конструкций». PLOS ONE . 6 (2): e16765. Bibcode : 2011PLoSO...616765W. doi : 10.1371/journal.pone.0016765 . PMC 3041749. PMID  21364738 . 
  35. ^ Klein CA, Emde L, Kuijpers A, Sobetzko P (2019-10-17). "MoCloFlex: модульная, но гибкая система клонирования". Frontiers in Bioengineering and Biotechnology . 7 : 271. doi : 10.3389/fbioe.2019.00271 . PMC 6843054. PMID  31750294 . 
  36. ^ Moore SJ, Lai HE, Kelwick RJ, Chee SM, Bell DJ, Polizzi KM, Freemont PS (октябрь 2016 г.). «EcoFlex: многофункциональный набор MoClo для синтетической биологии E. coli». ACS Synthetic Biology . 5 (10): 1059–1069. doi : 10.1021/acssynbio.6b00031 . hdl : 10044/1/31290 . PMID  27096716.
  37. ^ Crozet P, Navarro FJ, Willmund F, Mehrshahi P, Bakowski K, Lauersen KJ и др. (сентябрь 2018 г.). «Рождение фотосинтетического шасси: набор инструментов MoClo, обеспечивающий синтетическую биологию на основе микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii». ACS Synthetic Biology . 7 (9): 2074–2086. doi :10.1021/acssynbio.8b00251. PMID  30165733. S2CID  52131500.
  38. ^ Reece-Hoyes JS, Walhout AJ (январь 2018 г.). «Gateway Recombinational Cloning». Cold Spring Harbor Protocols . 2018 (1): pdb.top094912. doi :10.1101/pdb.top094912. PMC 5935001. PMID  29295908 . 
  39. ^ Sasaki Y, Sone T, Yoshida S, Yahata K, Hotta J, Chesnut JD и др. (февраль 2004 г.). «Доказательства высокой специфичности и эффективности множественных сигналов рекомбинации при смешанном клонировании ДНК системой Multisite Gateway». Журнал биотехнологии . 107 (3): 233–43. doi :10.1016/j.jbiotec.2003.10.001. PMID  14736459.
  40. ^ Колломс SD, Меррик CA, Олорунниджи FJ, Старк WM, Смит MC, Осборн A, и др. (февраль 2014 г.). «Быстрая сборка и модификация метаболического пути с использованием сайт-специфической рекомбинации сериновой интегразы». Nucleic Acids Research . 42 (4): e23. doi :10.1093/nar/gkt1101. PMC 3936721. PMID  24225316 . 
  41. ^ Zhang L, Zhao G, Ding X (2011-11-03). "Тандемная сборка кластера генов биосинтеза эпотилона с помощью сайт-специфической рекомбинации in vitro". Scientific Reports . 1 (1): 141. Bibcode :2011NatSR...1E.141Z. doi :10.1038/srep00141. PMC 3216622 . PMID  22355658. 
  42. ^ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO (май 2009). «Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен килобаз». Nature Methods . 6 (5): 343–5. doi :10.1038/nmeth.1318. PMID  19363495. S2CID  1351008.
  43. ^ Quan J, Tian J (июль 2009 г.). "Клонирование кольцевого полимеразного расширения сложных библиотек генов и путей". PLOS ONE . 4 (7): e6441. Bibcode : 2009PLoSO...4.6441Q. doi : 10.1371/journal.pone.0006441 . PMC 2713398. PMID  19649325 . 
  44. ^ Li MZ, Elledge SJ (март 2007 г.). «Использование гомологичной рекомбинации in vitro для генерации рекомбинантной ДНК с помощью SLIC». Nature Methods . 4 (3): 251–6. doi :10.1038/nmeth1010. PMID  17293868. S2CID  30893882.
  45. ^ Zhang Y, Werling U, Edelmann W (апрель 2012 г.). "SLiCE: новый метод клонирования ДНК на основе экстракта бактериальных клеток". Nucleic Acids Research . 40 (8): e55. doi :10.1093/nar/gkr1288. PMC 3333860. PMID  22241772 . 
  46. ^ «Как Gibson Assembly® меняет синтетическую биологию». New England Biolabs . Получено 14.04.2020 .
  47. ^ Casini A, MacDonald JT, De Jonghe J, Christodoulou G, Freemont PS, Baldwin GS, Ellis T (январь 2014 г.). «Конструирование ДНК в одном сосуде для синтетической биологии: стратегия модульной перекрывающейся направленной сборки с линкерами (MODAL)». Nucleic Acids Research . 42 (1): e7. doi :10.1093/nar/gkt915. PMC 3874208. PMID  24153110 . 
  48. ^ abcd Storch M, Casini A, Mackrow B, Fleming T, Trewhitt H, Ellis T, Baldwin GS (июль 2015 г.). «BASIC: Новый стандарт сборки биочастей для идемпотентного клонирования обеспечивает точную одноуровневую сборку ДНК для синтетической биологии». ACS Synthetic Biology . 4 (7): 781–7. doi : 10.1021/sb500356d . hdl : 10044/1/29939 . PMID  25746445.
  49. ^ "Протокол сборки Гибсона". Addgene . Получено 2020-04-14 .
  50. ^ El Karoui M, Hoyos-Flight M, Fletcher L (2019). «Будущие тенденции в синтетической биологии-Отчет». Frontiers in Bioengineering and Biotechnology . 7 : 175. doi : 10.3389/fbioe.2019.00175 . PMC 6692427. PMID  31448268 . 
  51. ^ Kosuri S, Church GM (май 2014). «Крупномасштабный синтез ДНК de novo: технологии и приложения» (PDF) . Nature Methods . 11 (5): 499–507. doi :10.1038/nmeth.2918. PMC 7098426 . PMID  24781323. 
  52. ^ Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, Pieper R, Parmar PP, Hutchison CA и др. (август 2007 г.). «Трансплантация генома у бактерий: изменение одного вида на другой». Science . 317 (5838): 632–8. Bibcode :2007Sci...317..632L. CiteSeerX 10.1.1.395.4374 . doi :10.1126/science.1144622. PMID  17600181. S2CID  83956478. 
  53. ^ Pilkington E (2009-10-06). «Я создаю искусственную жизнь, заявляет американский пионер генной инженерии». The Guardian . Лондон. Архивировано из оригинала 28 мая 2010 года . Получено 2010-05-22 .
  54. ^ Pennisi, E. (2010-05-21). "Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium" (PDF) . Science . 328 (5981): 958–9. doi : 10.1126/science.328.5981.958 . PMID  20488994. Архивировано (PDF) из оригинала 25 мая 2010 . Получено 2010-05-21 .
  55. ^ "Как ученые создали "искусственную жизнь"". BBC News . 2010-05-20. Архивировано из оригинала 1 июня 2013 года . Получено 2010-05-21 .
  56. ^ "Дрожжи 2.0". Nature Communications Collection . Springer Nature Limited. 22 мая 2018 г. Получено 17 апреля 2020 г.
  57. ^ Шукман Д. (27 марта 2014 г.). «Ученые приветствуют прогресс в области синтетических хромосом». BBC News . Получено 28.03.2014 .
  58. ^ Анналуру Н., Мюллер Х., Митчелл Л.А., Рамалингам С., Стракваданио Г., Ричардсон С.М. и др. (апрель 2014 г.). «Полный синтез функционального дизайнера эукариотической хромосомы». Наука . 344 (6179): 55–8. Бибкод : 2014Sci...344...55A. дои : 10.1126/science.1249252. ПМК 4033833 . ПМИД  24674868. 
  59. ^ Специальный выпуск SYNTHETIC YEAST GENOME Science 10 марта 2017 г. Том 355, выпуск 6329