Культура клеток или культура тканей — это процесс, с помощью которого клетки выращиваются в контролируемых условиях, как правило, за пределами их естественной среды. После того как интересующие клетки были выделены из живой ткани , их впоследствии можно хранить в тщательно контролируемых условиях. Их необходимо хранить при температуре тела (37°C) в инкубаторе. [1] Эти условия различаются для каждого типа клеток, но обычно состоят из подходящего сосуда с субстратом или богатой средой , которая поставляет необходимые питательные вещества ( аминокислоты , углеводы , витамины , минералы ), факторы роста , гормоны и газы ( CO 2 , O 2 ), а также регулирует физико-химическую среду ( рН буфера , осмотическое давление , температуру ). Большинству клеток требуется поверхность или искусственный субстрат для формирования прикрепившейся культуры в виде монослоя (толщиной в одну клетку), тогда как другие можно выращивать в свободном плавании в среде в виде суспензионной культуры . [2] Обычно этому способствуют использование жидкой, полутвердой или твердой питательной среды , такой как бульон или агар . Культура тканей обычно относится к культуре клеток и тканей животных, при этом для растений используется более конкретный термин « культура тканей растений ». Продолжительность жизни большинства клеток детерминирована генетически, но некоторые клетки, культивируемые клетки, были «трансформированы» в бессмертные клетки, которые будут воспроизводиться бесконечно, если будут обеспечены оптимальные условия.
На практике термин «культура клеток» теперь относится к культивированию клеток, полученных из многоклеточных эукариот , особенно клеток животных , в отличие от других типов культур, которые также выращивают клетки, таких как культура растительных тканей , культура грибов и микробиологическая культура ( микробов ) . Историческое развитие и методы культивирования клеток тесно связаны с культурой тканей и культурой органов . Вирусная культура также связана с клетками, являющимися хозяевами вирусов.
Лабораторный метод поддержания линий живых клеток (популяция клеток, произошедших от одной клетки и содержащих один и тот же генетический состав) , отделенных от исходного источника ткани, стал более надежным в середине 20 века. [3] [4]
Английский физиолог XIX века Сидней Рингер разработал солевые растворы , содержащие хлориды натрия, калия, кальция и магния, пригодные для поддержания биения изолированного сердца животного вне тела. [5] В 1885 году Вильгельм Ру удалил часть мозговой пластинки куриного эмбриона и подержал ее в теплом солевом растворе в течение нескольких дней, установив основной принцип культуры тканей. В 1907 году зоолог Росс Грэнвилл Харрисон продемонстрировал рост эмбриональных клеток лягушки, которые дали начало нервным клеткам в среде свернувшейся лимфы . В 1913 г. Э. Стейнхардт, К. Израэль и Р. А. Ламберт вырастили вирус коровьей оспы во фрагментах ткани роговицы морской свинки . [6] В 1996 году впервые была использована регенеративная ткань для замены небольшой длины уретры, что привело к пониманию того, что техника получения образцов ткани, выращивания ее вне тела без каркаса и повторного применения может использовать только на небольших расстояниях менее 1 см. [7] [8] [9] Росс Грэнвилл Харрисон , работавший в Медицинской школе Джонса Хопкинса , а затем в Йельском университете , опубликовал результаты своих экспериментов с 1907 по 1910 год, установив методологию культуры тканей . [10]
Готлиб Хаберландт первым указал на возможности культуры изолированных тканей, культуры тканей растений . [11] Он предположил, что с помощью этого метода можно определить потенциальные возможности отдельных клеток посредством культуры тканей, а также взаимное влияние тканей друг на друга. Со времени первоначальных утверждений Хаберландта были реализованы методы культивирования тканей и клеток, что привело к значительным открытиям в биологии и медицине. Свою первоначальную идею тотипотенциальности он представил в 1902 году, заявив, что «теоретически все растительные клетки способны дать начало полноценному растению». [12] [13] [14] Термин «культура ткани» был придуман американским патологом Монтроузом Томасом Берроузом . [15]
Методы культивирования клеток значительно продвинулись в 1940-х и 1950-х годах для поддержки исследований в области вирусологии . Выращивание вирусов в культурах клеток позволило получить очищенные вирусы для изготовления вакцин . Инъекционная вакцина против полиомиелита , разработанная Джонасом Солком, была одним из первых продуктов, массово производимых с использованием методов культивирования клеток. Эта вакцина стала возможной благодаря исследованиям клеточных культур Джона Франклина Эндерса , Томаса Хакла Веллера и Фредерика Чепмена Роббинса , которые были удостоены Нобелевской премии за открытие метода выращивания вируса в культурах клеток почек обезьян. Культура клеток способствовала разработке вакцин от многих заболеваний. [1]
В современном использовании термин «культура ткани» обычно относится к росту клеток из ткани многоклеточного организма in vitro . Эти клетки могут представлять собой клетки, выделенные из организма-донора ( первичные клетки ) или иммортализованную клеточную линию . Клетки погружают в культуральную среду, которая содержит необходимые питательные вещества и источники энергии, необходимые для выживания клеток. [16] Таким образом, в более широком смысле «культура ткани» часто используется как синоним «культуры клеток». С другой стороны, строгое значение термина «культура ткани» относится к культивированию кусочков ткани, т.е. к культуре эксплантатов .
Культура тканей — важный инструмент для изучения биологии клеток многоклеточных организмов. Он обеспечивает модель ткани in vitro в четко определенной среде, которой можно легко манипулировать и анализировать. В культуре тканей животных клетки можно выращивать в виде двумерных монослоев (традиционная культура) или внутри волокнистых каркасов или гелей для получения более натуралистичных трехмерных тканеподобных структур (3D-культура). Эрик Саймон в отчете о гранте NIH SBIR 1988 года показал, что электропрядение можно использовать для производства полимерных волокнистых каркасов нано- и субмикронного размера, специально предназначенных для использования в качестве клеточных и тканевых субстратов in vitro . Это раннее использование электропряденых волокнистых решеток для клеточной культуры и тканевой инженерии показало, что различные типы клеток будут прикрепляться к поликарбонатным волокнам и размножаться на них. Было отмечено, что в отличие от уплощенной морфологии, обычно наблюдаемой в 2D-культуре, клетки, выращенные на волокнах электропрядения, демонстрировали более округлую трехмерную морфологию, обычно наблюдаемую в тканях in vivo . [17]
Культура тканей растений, в частности, связана с выращиванием целых растений из небольших кусочков растительной ткани, культивируемых в среде. [18]
Клетки можно выделить из тканей для культуры ex vivo несколькими способами. Клетки легко очищаются от крови; однако только белые клетки способны расти в культуре. Клетки можно выделить из твердых тканей путем переваривания внеклеточного матрикса с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин или проназа , перед перемешиванием ткани для высвобождения клеток в суспензию. [19] [20] Альтернативно, кусочки ткани можно поместить в питательную среду , а вырастающие клетки можно будет использовать для культивирования. Этот метод известен как культура эксплантатов .
Клетки, которые культивируются непосредственно у субъекта, известны как первичные клетки. За исключением некоторых, полученных из опухолей, большинство первичных клеточных культур имеют ограниченную продолжительность жизни.
Установленная или иммортализованная клеточная линия приобрела способность бесконечно размножаться либо посредством случайной мутации, либо преднамеренной модификации, такой как искусственная экспрессия гена теломеразы . Многочисленные клеточные линии хорошо известны как представители определенных типов клеток .
Большинство изолированных первичных клеток подвергаются процессу старения и перестают делиться после определенного количества удвоений популяции, в целом сохраняя свою жизнеспособность (описанную как предел Хейфлика ).
Помимо температуры и газовой смеси, наиболее часто меняющимся фактором в культуральных системах является среда для роста клеток . Рецепты питательных сред могут различаться по pH , концентрации глюкозы, факторам роста и наличию других питательных веществ. Факторы роста, используемые в качестве дополнения к среде, часто получают из сыворотки крови животных, например, фетальной бычьей сыворотки (FBS), бычьей телячьей сыворотки, лошадиной сыворотки и свиной сыворотки. Одним из осложнений, связанных с этими ингредиентами, полученными из крови, является возможность загрязнения культуры вирусами или прионами , особенно в медицинских биотехнологических приложениях. Текущая практика заключается в том, чтобы свести к минимуму или исключить использование этих ингредиентов, где это возможно, и использовать лизат тромбоцитов человека (hPL). [21] Это избавляет от необходимости беспокоиться о межвидовом загрязнении при использовании FBS с клетками человека. hPL стал безопасной и надежной альтернативой прямой замене FBS или другой сыворотки животных. Кроме того, для устранения любых следов сыворотки (человеческой или животной) можно использовать среды с определенным химическим составом , но это не всегда может быть достигнуто с использованием разных типов клеток. Альтернативные стратегии включают получение крови животных из стран с минимальным риском ГЭКРС / ТГЭ , таких как США, Австралия и Новая Зеландия, [22] и использование очищенных питательных концентратов, полученных из сыворотки, вместо цельной сыворотки животных для клеточных культур. [23]
Плотность посева (количество клеток на объем культуральной среды) играет решающую роль для некоторых типов клеток. Например, более низкая плотность посева заставляет гранулезные клетки проявлять выработку эстрогена, тогда как более высокая плотность посева заставляет их выглядеть как клетки текалютеина , продуцирующие прогестерон . [24]
Клетки можно выращивать либо в суспензии , либо в прикрепившихся культурах . [25] Некоторые клетки естественным образом живут в суспензии, не прикрепляясь к поверхности, например клетки, существующие в кровотоке. Существуют также клеточные линии, которые были модифицированы для выживания в суспензионных культурах, поэтому их можно выращивать до более высокой плотности, чем позволяют условия адгезии. Адгезивным клеткам требуется поверхность, такая как пластик или микроноситель для тканевой культуры , которая может быть покрыта компонентами внеклеточного матрикса (такими как коллаген и ламинин) для увеличения адгезионных свойств и предоставления других сигналов, необходимых для роста и дифференцировки. Большинство клеток, происходящих из твердых тканей, являются адгезивными. Другим типом адгезивной культуры является органотипическая культура , которая предполагает выращивание клеток в трехмерной (3-D) среде, в отличие от двумерных культуральных чашек. Эта система 3D-культуры биохимически и физиологически более похожа на ткань in vivo , но ее технически сложно поддерживать из-за многих факторов (например, диффузии). [26]
Существуют различные виды сред для культивирования клеток, которые обычно используются в науках о жизни, включая следующие:
Перекрестное загрязнение клеточных линий может стать проблемой для ученых, работающих с культивируемыми клетками. [27] Исследования показывают, что в 15–20% случаев клетки, использованные в экспериментах, были ошибочно идентифицированы или загрязнены другой клеточной линией. [28] [29] [30] Проблемы с перекрестным загрязнением клеточных линий были обнаружены даже в линиях из панели NCI-60 , которые регулярно используются для исследований по скринингу лекарств. [31] [32] Основные репозитории клеточных линий, в том числе Американская коллекция типовых культур (ATCC), Европейская коллекция клеточных культур (ECACC) и Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), получили материалы о клеточных линиях от исследователей. которые были ими ошибочно идентифицированы. [31] [33] Такое заражение создает проблему для качества исследований, проводимых с использованием линий клеточных культур, и основные репозитории в настоящее время проверяют подлинность всех представленных линий клеток. [34] ATCC использует дактилоскопию ДНК с короткими тандемными повторами (STR) для аутентификации своих клеточных линий. [35]
Чтобы решить эту проблему перекрестного загрязнения клеточных линий, исследователям рекомендуется аутентифицировать свои клеточные линии на ранних стадиях, чтобы установить идентичность клеточной линии. Аутентификацию следует повторять перед замораживанием запасов клеточных линий, каждые два месяца во время активного культивирования и перед любой публикацией данных исследований, полученных с использованием клеточных линий. Для идентификации клеточных линий используются многие методы, включая изоферментный анализ, типирование антигена лимфоцитов человека (HLA), хромосомный анализ, кариотипирование, морфологический и STR-анализ . [35]
Одним из значительных перекрестных загрязнителей клеточных линий является иммортализованная клеточная линия HeLa . Заражение Хелой было впервые отмечено в начале 1960-х годов в нечеловеческой культуре США. Внутривидовое заражение было обнаружено в девятнадцати клеточных линиях в семидесятые годы. В 1974 году было обнаружено, что пять клеточных линий человека из Советского Союза относятся к Hela. Последующее исследование, анализирующее 50 с лишним клеточных линий, показало, что половина из них имела маркеры Hela, но примесная Hela гибридизировалась с исходными клеточными линиями. Сообщалось о заражении клетками Hela из капель воздуха . Хела даже была неосознанно введена людям Джонасом Солком во время испытаний вакцины в 1978 году. [36]
Поскольку клетки обычно продолжают делиться в культуре, они обычно растут, заполняя доступную площадь или объем. Это может вызвать несколько проблем:
Выбор культуральной среды может повлиять на физиологическую значимость результатов экспериментов с культурами клеток из-за различий в составе и концентрациях питательных веществ. [38] Недавно было показано систематическое смещение в сгенерированных наборах данных для скринингов подавления генов CRISPR и RNAi , [39] и для метаболического профилирования линий раковых клеток . [38] Использование питательной среды , которая лучше отражает физиологические уровни питательных веществ, может повысить физиологическую значимость исследований in vitro , и недавно были разработаны такие типы сред, как Plasmax [40] и Human Plasma Like Medium (HPLM) [41] .
Среди распространенных манипуляций, проводимых с культуральными клетками, - смена среды, пассирование клеток и трансфекция клеток. Обычно они выполняются с использованием методов культуры тканей, основанных на асептике . Асептическая техника направлена на предотвращение загрязнения бактериями, дрожжами или другими клеточными линиями. Манипуляции обычно проводятся в боксе биологической безопасности или в боксе с ламинарным потоком , чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов. В питательную среду также можно добавлять антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин ) и противогрибковые средства (например, амфотерицин B и раствор антибиотика-антимикотика ).
Когда клетки подвергаются метаболическим процессам, вырабатывается кислота и уровень pH снижается. Часто в среду добавляют индикатор pH для измерения истощения питательных веществ.
В случае приверженных культур среду можно удалить непосредственно аспирацией, а затем заменить. Замена среды в неприкрепившихся культурах включает центрифугирование культуры и ресуспендирование клеток в свежей среде.
Пассирование (также известное как субкультивирование или расщепление клеток) включает перенос небольшого количества клеток в новый сосуд. Клетки можно культивировать в течение более длительного времени, если их регулярно расщеплять, поскольку это позволяет избежать старения, связанного с длительной высокой плотностью клеток. Суспензионные культуры легко пассируются небольшим количеством культуры, содержащей несколько клеток, разведенных в большем объеме свежей среды. Для адгезивных культур сначала необходимо отделить клетки; обычно это делается со смесью трипсин - ЭДТА ; однако теперь для этой цели доступны другие смеси ферментов. Затем небольшое количество отдельных клеток можно использовать для посева новой культуры. Некоторые клеточные культуры, такие как клетки RAW, механически соскребают с поверхности сосуда резиновыми скребками.
Другой распространенный метод манипулирования клетками включает введение чужеродной ДНК путем трансфекции . Это часто выполняется, чтобы заставить клетки экспрессировать интересующий ген . Совсем недавно трансфекция конструкций РНКи была реализована как удобный механизм подавления экспрессии определенного гена/белка. ДНК также можно вставлять в клетки с помощью вирусов методами, называемыми трансдукцией , инфицированием или трансформацией . Вирусы как паразитические агенты хорошо подходят для внедрения ДНК в клетки, поскольку это часть их нормального процесса размножения.
Клеточные линии, происходящие от человека, вызывают некоторые споры в биоэтике , поскольку они могут пережить свой родительский организм и позже использоваться для открытия прибыльных методов лечения. В своем новаторском решении в этой области Верховный суд Калифорнии постановил в деле Мур против Регентов Калифорнийского университета , что пациенты-люди не имеют прав собственности на клеточные линии, полученные из органов, удаленных с их согласия. [42]
Можно слить нормальные клетки с иммортализованной клеточной линией . Этот метод используется для получения моноклональных антител . Вкратце, лимфоциты, выделенные из селезенки (или, возможно, крови) иммунизированного животного, объединяют с иммортализованной клеточной линией миеломы (линия В-клеток) с получением гибридомы, которая обладает антителоспецифичностью первичного лимфоцита и бессмертием миеломы. Селективную питательную среду (HA или HAT) используют для отбора неслитых клеток миеломы; первичные лимфоктии быстро погибают в культуре, и выживают только слитые клетки. Их проверяют на выработку необходимых антител, обычно в пулах вначале, а затем после однократного клонирования.
Штамм клеток получают либо из первичной культуры, либо из клеточной линии путем отбора или клонирования клеток, обладающих специфическими свойствами или характеристиками, которые необходимо определить. Клеточные штаммы — это клетки, адаптированные к культуре, но, в отличие от клеточных линий, имеющие ограниченный потенциал деления. Неиммортализованные клетки перестают делиться после 40–60 удвоений популяции [43] и после этого теряют способность к пролиферации (генетически детерминированное событие, известное как старение). [44]
Массовое культивирование линий животных клеток имеет основополагающее значение для производства вирусных вакцин и других продуктов биотехнологии. Культура стволовых клеток человека используется для увеличения количества клеток и дифференциации клеток в различные типы соматических клеток для трансплантации. [45] Культура стволовых клеток также используется для сбора молекул и экзосом, которые выделяют стволовые клетки, в целях терапевтических разработок. [46]
Биологические продукты, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в культурах клеток животных, включают ферменты , синтетические гормоны , иммунобиологические препараты ( моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины ) и противораковые средства . Хотя многие более простые белки можно получить с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные гликозилированные ( модифицированные углеводами) белки в настоящее время необходимо производить в клетках животных. Важным примером такого сложного белка является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих высока, поэтому ведутся исследования по получению таких сложных белков в клетках насекомых или высших растений, использованию одиночных эмбриональных клеток и соматических эмбрионов в качестве источника для прямого переноса генов посредством бомбардировки частицами, экспрессии транзитных генов и наблюдение конфокальной микроскопии является одним из его применений. Предлагается также подтвердить одноклеточное происхождение соматических эмбрионов и асимметрию первого клеточного деления, запускающего этот процесс.
Культура клеток также является ключевым методом клеточного сельского хозяйства , целью которого является создание как новых продуктов, так и новых способов производства существующих сельскохозяйственных продуктов, таких как молоко, (выращенное) мясо , ароматизаторы и рог носорога из клеток и микроорганизмов. Поэтому это считается одним из средств достижения сельского хозяйства без животных . Это также центральный инструмент для обучения клеточной биологии. [47]
Исследования в области тканевой инженерии , стволовых клеток и молекулярной биологии в основном включают культивирование клеток на плоских пластиковых чашках. Этот метод известен как двумерная (2D) клеточная культура, и был впервые разработан Вильгельмом Ру , который в 1885 году удалил часть мозговой пластинки эмбрионального цыпленка и выдержал ее в теплом физиологическом растворе в течение нескольких дней на плоском стекле. тарелка. Благодаря развитию полимерных технологий возникла сегодняшняя стандартная пластиковая чашка для двумерной культуры клеток, широко известная как чашка Петри . Это изобретение приписывают Юлиусу Рихарду Петри , немецкому бактериологу , работавшему ассистентом Роберта Коха . Различные исследователи сегодня также используют лабораторные колбы для культивирования , конические контейнеры и даже одноразовые пакеты, подобные тем, которые используются в одноразовых биореакторах .
Помимо чашек Петри, ученые уже давно выращивают клетки в матрицах биологического происхождения, таких как коллаген или фибрин, а в последнее время и в синтетических гидрогелях, таких как полиакриламид или ПЭГ. Они делают это, чтобы вызвать фенотипы, которые не экспрессируются на традиционно жестких субстратах. Растет интерес к контролю жесткости матрицы [48] . Эта концепция привела к открытиям в таких областях, как:
Клеточная культура в трех измерениях рекламировалась как «Новое измерение биологии». [63] В настоящее время практика культивирования клеток по-прежнему основана на различных комбинациях одиночных или множественных клеточных структур в 2D. [64] В настоящее время наблюдается рост использования 3D-культур клеток в исследовательских областях, включая разработку лекарств , биологию рака, регенеративную медицину , оценку наноматериалов и фундаментальные исследования в области медико-биологических наук . [65] [66] [67] Трехмерные клеточные культуры можно выращивать с использованием каркаса или матрицы или без каркаса. Культуры на основе каркаса используют бесклеточную трехмерную матрицу или жидкую матрицу. Безкаркасные методы обычно создаются в суспензиях. [68] Существует множество платформ, используемых для облегчения роста трехмерных клеточных структур, включая каркасные системы, такие как гидрогелевые матрицы [69] и твердые каркасы, а также системы без каркасов, такие как пластины с низкой адгезией, магнитная левитация с использованием наночастиц. , [70] подвесные капельные планшеты, [71] [72] и вращающаяся клеточная культура. Культивирование клеток в 3D приводит к широкому варьированию показателей экспрессии генов и частично имитирует ткани в физиологических состояниях. [73] 3D-модель клеточной культуры показала рост клеток, аналогичный росту клеток in vivo, чем монослойная культура, и все три культуры были способны поддерживать рост клеток. [74] Поскольку 3D-культурирование было разработано, оказалось, что оно имеет большой потенциал для разработки моделей опухолей и исследования злокачественной трансформации и метастазирования. 3D-культуры могут предоставить расширенный инструмент для понимания изменений, взаимодействий и клеточной передачи сигналов. [75]
3D-культура клеток в каркасах
Эрик Саймон в отчете о гранте NIH SBIR 1988 года показал, что электропрядение можно использовать для производства нано- и субмикронных волокнистых каркасов из полистирола и поликарбоната, специально предназначенных для использования в качестве клеточных субстратов in vitro . Это раннее использование электропряденых волокнистых решеток для клеточной культуры и тканевой инженерии показало, что различные типы клеток, включая фибробласты крайней плоти человека (HFF), трансформированную карциному человека (HEp-2) и эпителий легких норки (MLE), будут прикрепляться к поликарбонатным волокнам и размножаться на них. . Было отмечено, что в отличие от уплощенной морфологии, обычно наблюдаемой в 2D-культуре, клетки, выращенные на волокнах электропрядения, демонстрировали более гистотипическую округлую трехмерную морфологию, обычно наблюдаемую in vivo . [17]
Поскольку природный внеклеточный матрикс (ЕСМ) важен для выживания, пролиферации, дифференциации и миграции клеток, различные гидрогелевые культуральные матрицы, имитирующие естественную структуру ЕСМ, рассматриваются как потенциальные подходы к культивированию клеток, подобному in vivo. [76] Гидрогели состоят из взаимосвязанных пор с высокой степенью удержания воды, что обеспечивает эффективный транспорт таких веществ, как питательные вещества и газы. Для 3D-культуры клеток доступно несколько различных типов гидрогелей из натуральных и синтетических материалов, включая гидрогели экстракта ЕСМ животных, белковые гидрогели, пептидные гидрогели, полимерные гидрогели и гидрогель наноцеллюлозы на основе древесины .
Метод 3D-клеточного культивирования методом магнитной левитации (MLM) представляет собой применение выращивания 3D-тканей путем воздействия на клетки, обработанные сборками магнитных наночастиц, в пространственно изменяющихся магнитных полях с использованием неодимовых магнитных драйверов и содействия межклеточным взаимодействиям путем подъема клеток в воздух. Жидкостная граница стандартной чашки Петри. Сборки магнитных наночастиц состоят из магнитных наночастиц оксида железа, наночастиц золота и полимера полилизина. Трехмерное культивирование клеток масштабируется: можно культивировать от 500 клеток до миллионов клеток или от одной чашки до высокопроизводительных систем малого объема.
Культура клеток является фундаментальным компонентом культуры тканей и тканевой инженерии , поскольку она закладывает основы выращивания и поддержания клеток in vitro . Основное применение культуры клеток человека находится в производстве стволовых клеток, где мезенхимальные стволовые клетки можно культивировать и криоконсервировать для будущего использования. Тканевая инженерия потенциально предлагает значительные улучшения в недорогом медицинском обслуживании сотен тысяч пациентов ежегодно.
Вакцины от полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи и ветряной оспы в настоящее время производятся на клеточных культурах. Из-за угрозы пандемии H5N1 исследования по использованию клеточной культуры для вакцин против гриппа финансируются правительством США . Новые идеи в этой области включают вакцины на основе рекомбинантной ДНК , например вакцину, созданную с использованием аденовируса человека (вирус простуды) в качестве вектора [77] [78] и новые адъюванты. [79]
Метод совместного культивирования используется для изучения перекрестных помех между двумя или более типами клеток на планшете или в трехмерной матрице. Культивирование различных стволовых клеток и взаимодействие иммунных клеток можно исследовать на модели in vitro, аналогичной биологической ткани. Поскольку большинство тканей содержат более одного типа клеток, важно оценить их взаимодействие в среде трехмерной культуры, чтобы лучше понять их взаимодействие и ввести миметические ткани. Существует два типа совместного культивирования: прямое и косвенное. В то время как прямое взаимодействие предполагает, что клетки находятся в прямом контакте друг с другом в одной и той же культуральной среде или матрице, непрямое взаимодействие включает в себя разные среды, что позволяет участвовать сигнальным и растворимым факторам. [15] [80]
Дифференцировку клеток в тканевых моделях во время взаимодействия между клетками можно изучать с помощью системы совместного культивирования для моделирования раковых опухолей, для оценки влияния лекарств на терапевтические испытания и для изучения влияния лекарств на терапевтические испытания. Система совместного культивирования в 3D-моделях может предсказать реакцию на химиотерапию и эндокринную терапию, если микроокружение определяет биологическую ткань для клеток.
Метод совместного культивирования используется в тканевой инженерии для создания тканей при непосредственном взаимодействии нескольких клеток. [81]
Техника микрофлюидики представляет собой разработанные системы, которые могут выполнять процессы в потоке, размер которого обычно составляет микроны. Микрофлюидные чипы также известны как «лаборатория на чипе», и они могут проводить непрерывные процедуры и этапы реакции с запасным количеством реагентов и пространством. Такие системы позволяют идентифицировать и изолировать отдельные клетки и молекулы в сочетании с соответствующими биологическими анализами и методами высокочувствительного обнаружения. [82] [83]
Системы OoC имитируют и контролируют микроокружение клеток путем выращивания тканей в микрофлюидике. Сочетая тканевую инженерию, производство биоматериалов и клеточную биологию, он дает возможность создать биомиметическую модель для изучения заболеваний человека в лаборатории. В последние годы наука о 3D-культуре клеток добилась значительного прогресса, что привело к развитию OoC. ОоС рассматривается как доклинический этап, который приносит пользу фармацевтическим исследованиям, разработке лекарств и моделированию заболеваний. [84] [85] OoC — это важная технология, которая может преодолеть разрыв между тестированием на животных и клиническими исследованиями, а также благодаря достижениям, достигнутым наукой, может заменить исследования in vivo по доставке лекарств и патофизиологические исследования. [86]
Помимо культуры хорошо зарекомендовавших себя иммортализованных клеточных линий, клетки из первичных эксплантов множества организмов можно культивировать в течение ограниченного периода времени, прежде чем наступит старение (см. Предел Хейфлика). Культивированные первичные клетки широко использовались в исследованиях, как и кератоциты рыб в исследованиях миграции клеток. [87] [47] [88]
Культуры растительных клеток обычно выращивают в виде суспензионных культур клеток в жидкой среде или в виде каллусных культур на твердой среде. Культивирование недифференцированных растительных клеток и каллусов требует надлежащего баланса гормонов роста растений ауксина и цитокинина . [ нужна цитата ]
Клетки, полученные из Drosophila melanogaster (чаще всего, клетки Шнайдера 2 ), можно использовать для экспериментов, которые может быть трудно провести на живых мухах или личинках, таких как биохимические исследования или исследования с использованием миРНК . Клеточные линии, полученные из армейского червя Spodoptera frugiperda , включая Sf9 и Sf21 , и из капустной петельки Trichoplusia ni , клетки High Five , обычно используются для экспрессии рекомбинантных белков с использованием бакуловируса . [89]
Для бактерий и дрожжей небольшие количества клеток обычно выращивают на твердой подложке, содержащей внедренные в нее питательные вещества, обычно это гель, такой как агар, тогда как крупномасштабные культуры выращиваются на клетках, суспендированных в питательном бульоне. [ нужна цитата ]
Культура вирусов требует культуры клеток млекопитающих, растений, грибкового или бактериального происхождения в качестве хозяев для роста и репликации вируса. Целые вирусы дикого типа , рекомбинантные вирусы или вирусные продукты могут быть получены в типах клеток, отличных от их естественных хозяев, при правильных условиях. В зависимости от вида вируса инфекция и репликация вируса могут привести к лизису клетки-хозяина и образованию вирусной бляшки . [ нужна цитата ]