Нуклеоид

Нуклеоид (что означает ядро - подобный ) представляет собой область неправильной формы внутри прокариотической клетки , которая содержит весь или большую часть генетического материала . ^[1]^[2]^[3] Хромосома типичного прокариота имеет круглую форму , и ее длина очень велика по сравнению с размерами клетки, поэтому ее необходимо уплотнить, чтобы она поместилась. В отличие от ядра эукариотической клетки оно не окружено ядерной мембраной . Вместо этого нуклеоид формируется путем конденсации и функционального расположения с помощью хромосомных архитектурных белков и молекул РНК , а также сверхспирализации ДНК . Длина генома широко варьируется (обычно не менее нескольких миллионов пар оснований), и клетка может содержать несколько его копий.

Пока еще не известна структура бактериального нуклеоида с высоким разрешением, однако ключевые особенности были исследованы на Escherichia coli как на модельном организме . У E. coli хромосомная ДНК в среднем отрицательно сверхспиральна и свернута в плектонемические петли , которые ограничены разными физическими областями и редко диффундируют друг в друга. Эти петли пространственно организуются в области размером с мегабазу, называемые макродоменами, внутри которых участки ДНК часто взаимодействуют, но между которыми взаимодействия редки. Конденсированная и пространственно организованная ДНК образует спиральный эллипсоид, ограниченный радиально внутри клетки. Трехмерная структура ДНК в нуклеоиде, по-видимому, варьируется в зависимости от условий и связана с экспрессией генов , поэтому архитектура нуклеоида и транскрипция генов тесно взаимозависимы, взаимно влияя друг на друга.

Фон

У многих бактерий хромосома представляет собой одиночную ковалентно замкнутую (кольцевую) двухцепочечную молекулу ДНК, кодирующую генетическую информацию в гаплоидной форме. Размер ДНК варьируется от 500 000 до нескольких миллионов пар оснований (п.н.), кодирующих от 500 до нескольких тысяч генов в зависимости от организма. ^[2] Хромосомная ДНК присутствует в клетках в очень компактной, организованной форме, называемой нуклеоидом (что означает ядро ), которая не окружена ядерной мембраной, как в эукариотических клетках. ^[6] Выделенный нуклеоид содержит 80% ДНК, 10% белка и 10% РНК по массе. ^[7]^[8]

Грамотрицательная бактерия Escherichia coli является модельной системой для исследования нуклеоида, позволяющего выяснить, как хромосомная ДНК становится нуклеоидом, какие факторы в этом участвуют, что известно о ее структуре и как некоторые структурные аспекты ДНК влияют на экспрессию генов . ^[2]^[3]

Есть два существенных аспекта формирования нуклеоида; конденсация большой ДНК в маленькое клеточное пространство и функциональная организация ДНК в трехмерной форме. Гаплоидная кольцевая хромосома E. coli состоит из ~ 4,6 х 10 ⁶ п.н. Если ДНК релаксирована в форме B , ее окружность будет составлять ~1,5 миллиметра (0,332 нм x 4,6 x 10 ⁶ ). Однако большая молекула ДНК, такая как хромосомная ДНК E. coli , не остается прямой жесткой молекулой в суспензии. ^[5] Броуновское движение вызывает искривление и изгибы ДНК. Максимальная длина, до которой двухспиральная ДНК остается прямой, сопротивляясь изгибу, вызванному броуновским движением, составляет ~ 50 нм или 150 пар оснований, что называется длиной персистентности . Таким образом, чистая ДНК существенно конденсируется без каких-либо дополнительных факторов; при тепловом равновесии он принимает случайную форму клубка . ^[4]^[5] Случайный клубок хромосомной ДНК E. coli будет занимать объем (4/3 π r ³ ) ~ 523 мкм ³ , рассчитанный по радиусу вращения ( R _g = (√N a)/√ 6) где a — длина Куна (2 x персистентная длина), а N — количество сегментов длины Куна в ДНК (общая длина ДНК, деленная на a ). ^[5] Хотя ДНК уже конденсирована в форме случайного клубка, она еще не может принять объем нуклеоида менее микрона. Таким образом, внутреннего свойства ДНК недостаточно: дополнительные факторы должны способствовать дальнейшей конденсации ДНК порядка ~10 ³ (объем случайного клубка, деленный на объем нуклеоида). Вторым важным аспектом образования нуклеоидов является функциональное расположение ДНК. Хромосомная ДНК не только конденсирована, но и функционально организована таким образом, который совместим с такими процессами транзакций ДНК, как репликация , рекомбинация , сегрегация и транскрипция . ^[9]^[10]^[11] Почти пять десятилетий исследований, начиная с 1971 года, ^[7]показал, что конечная форма нуклеоида возникает в результате иерархической организации ДНК. В наименьшем масштабе (1 т.п.н. или меньше) архитектурные белки ДНК, связанные с нуклеоидами, конденсируют и организуют ДНК путем изгиба, образования петель, образования мостиков или обертывания ДНК. В более крупном масштабе (10 т.п.н. и более) ДНК образует плектонемические петли — сплетенную форму ДНК, возникающую в результате сверхспирализации. В мегабазовом масштабе плектонемические петли объединяются в шесть пространственно организованных доменов (макродоменов), которые определяются более частыми физическими взаимодействиями между участками ДНК внутри одного и того же макродомена, чем между разными макродоменами. ^[12] Длинно- и короткодействующие связи ДНК-ДНК, образующиеся внутри и между макродоменами, способствуют конденсации и функциональной организации. Наконец, нуклеоид представляет собой спиральный эллипсоид с участками сильно конденсированной ДНК на продольной оси. ^[13]^[14]^[15]

Конденсация и организация

Нуклеоид-ассоциированные белки (NAP)

У эукариот геномная ДНК конденсирована в виде повторяющегося массива ДНК-белковых частиц, называемых нуклеосомами . ^[16]^[17]^[18]

Нуклеосома состоит из ~146 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерного комплекса белков -гистонов . Хотя у бактерий нет гистонов, они обладают группой ДНК-связывающих белков, называемых нуклеоид-ассоциированными белками (NAP), которые функционально аналогичны гистонам в широком смысле. NAP очень распространены и составляют значительную часть белкового компонента нуклеоида. ^[19]

Отличительной характеристикой NAP является их способность связывать ДНК как специфическим (специфичным для последовательности или структуры), так и неспецифичным для последовательности образом. В результате NAP представляют собой белки с двойной функцией. ^[20] Специфическое связывание NAP в основном участвует в ген-специфической транскрипции , репликации ДНК , рекомбинации и репарации . ^[9]^[10]^[11] На пике их распространенности количество молекул многих NAP на несколько порядков превышает количество сайтов специфического связывания в геноме. ^[20] Таким образом, предполагается, что NAP связываются с хромосомной ДНК в основном неспецифичным для последовательности способом, и именно этот способ имеет решающее значение для уплотнения хромосом. Примечательно, что так называемое неспецифическое связывание NAP не может быть полностью случайным. Может существовать низкая специфичность последовательности и/или структурная специфичность из-за зависимой от последовательности конформации ДНК или конформации ДНК, созданной другими NAP. ^[18]

Хотя молекулярные механизмы того, как NAP конденсируют ДНК in vivo , не совсем понятны, на основании обширных исследований in vitro выяснилось, что NAP участвуют в компактизации хромосом посредством следующих механизмов: NAP индуцируют и стабилизируют изгибы ДНК, тем самым помогая конденсации ДНК за счет уменьшения длина персистентности. ^[20] NAP конденсируют ДНК путем образования мостиков, обертывания и группирования, которые могут возникать между близлежащими сегментами ДНК или удаленными сегментами ДНК хромосомы. Другой механизм, с помощью которого NAP участвуют в уплотнении хромосом, заключается в ограничении отрицательных суперспиралей в ДНК, что способствует топологической организации хромосомы. ^[20]

В E. coli идентифицировано не менее 12 NAP , ^[20] наиболее изученными из которых являются HU, IHF, H-NS и Fis. Их распространенность, свойства связывания ДНК, а также влияние на конденсацию и организацию ДНК суммированы в таблицах ниже. ^[20]

¹ Данные по численности (молекулы/клетка) были взяты из; ^[21] Число в скобках представляет собой микромолярную концентрацию, рассчитанную по следующей формуле: (количество нативных функциональных единиц/число Авогадро) x (1/объем клетки в литрах) x 10 ³ . Объем клеток в литрах (2×10 ^-15 ) определяли, принимая объем клеток E.coli равным 2 мкм ³ . ^[21]

¹ Сродство связывания относится к равновесной константе диссоциации (Kd) в молярных единицах (М). НД = не определено

ХУ

Гистоноподобный белок штамма E. coli U93 (HU) является эволюционно консервативным белком бактерий. ^[33]^[34] HU существует в E. coli в виде гомо- и гетеродимеров двух субъединиц HUα и HUβ, имеющих 69% аминокислотной идентичности. ^[35] Хотя его называют гистоноподобным белком, близкими функциональными родственниками HU у эукариот являются белки группы высокой подвижности (HMG), а не гистоны. ^[36]^[37] HU представляет собой ДНК-связывающий белок, не специфичный для последовательности. Он связывается с низким сродством к любой линейной ДНК. Однако он преимущественно связывается с высоким сродством со структурно искаженной ДНК. ^[38]^[39]^[40]^[41]^[42]^[24] Примеры искаженных ДНК-субстратов включают крестообразную ДНК , выпуклую ДНК, дцДНК, содержащую одноцепочечные разрывы, такие как зазубрины , разрывы или развилки . Более того, HU специфически связывает и стабилизирует петлю ДНК, опосредованную белком. ^[43] В структурно-специфичном режиме связывания ДНК HU распознает общий структурный мотив, определяемый изгибами или изломами, возникающими в результате искажения, ^[22]^[44]^[23] , тогда как он связывается с линейной ДНК путем блокировки фосфатного остова. ^[45] Хотя структурно-специфическое связывание с высоким сродством необходимо для специализированных функций HU, таких как сайт-специфическая рекомбинация , репарация ДНК , инициация репликации ДНК и регуляция генов, ^[9]^[10]^[11] оказывается, что Общее связывание с низким сродством участвует в конденсации ДНК. ^[45] При иммунопреципитации хроматина в сочетании с секвенированием ДНК ( ChIP-Seq ) HU не выявляет каких-либо специфических событий связывания. ^[46] Вместо этого он демонстрирует равномерное связывание по всему геному, предположительно отражая его в основном слабое, неспецифическое связывание, не специфичное для последовательности, таким образом маскируя высокоаффинное связывание in vivo . ^[46]

У штаммов, лишенных HU, нуклеоид «деконденсирован», что соответствует роли HU в уплотнении ДНК. ^[47] Следующие исследования in vitro предполагают возможные механизмы того, как HU может конденсировать и организовывать ДНК in vivo . HU не только стабильно связывается с искаженной ДНК с изгибами, но и индуцирует гибкие изгибы даже в линейной ДНК при концентрации менее 100 нМ. Напротив, HU демонстрирует противоположный архитектурный эффект на ДНК при более высоких физиологически значимых концентрациях. ^[45]^[9]^[10]^[11]^[47]^[48] Он образует жесткие нуклеопротеиновые нити, вызывающие выпрямление ДНК, а не изгиб. Нити могут дополнительно образовывать сеть ДНК (группировку ДНК), расширяемую как латерально, так и медиально из-за мультимеризации HU-HU, запускаемой неспецифичным для последовательности связыванием ДНК. ^[45]

Насколько такое поведение HU актуально внутри клетки? Для формирования нитей требуется связывание HU с ДНК с высокой плотностью: один димер HU на ДНК длиной 9–20 п.н. Но на каждые ~150 п.н. хромосомной ДНК приходится только один димер HU, исходя из предполагаемого содержания 30 000 димеров HU на клетку (4600 000 п.о./30 000). ^[21] Это указывает на то, что гибкие изгибы чаще возникают in vivo . Гибкий изгиб может вызвать конденсацию из-за уменьшения персистентной длины ДНК, как показали эксперименты с магнитным пинцетом , которые позволяют изучать конденсацию одной молекулы ДНК с помощью ДНК-связывающего белка. ^[48]^[49] Однако из-за кооперативности в некоторых областях хромосомы могут образовываться жесткие нити и сети. Формирование нитей само по себе не вызывает конденсацию, ^[48] но создание сетей или группировок ДНК может существенно способствовать конденсации, объединяя отдаленные или близлежащие сегменты хромосом. ^[45]

ИХФ

Интеграционный фактор хозяина (IHF) структурно почти идентичен HU ^[51] , но во многих аспектах ведет себя иначе, чем HU. В отличие от HU, который преимущественно связывается со структурным мотивом независимо от последовательности, IHF преимущественно связывается со специфической последовательностью ДНК, хотя специфичность возникает за счет зависимой от последовательности структуры ДНК и ее деформируемости. Специфическое связывание IHF в родственных сайтах резко изгибает ДНК более чем на 160 градусов. ^[51] Встречаемость мотива родственной последовательности составляет около 3000 в геноме E. coli . ^[46] Предполагаемое содержание IHF в фазе роста составляет около 6000 димеров на клетку. Если предположить, что один димер IHF связывается с одним мотивом, а нуклеоид содержит более одного геномного эквивалента во время фазы экспоненциального роста, большинство молекул IHF будут занимать определенные участки в геноме и, вероятно, только конденсируют ДНК, вызывая резкий изгиб. ^[46]

Помимо преимущественного связывания со специфической последовательностью ДНК, IHF также связывается с ДНК неспецифичным для последовательности образом со сродством, аналогичным HU. Роль неспецифического связывания IHF в конденсации ДНК, по-видимому, имеет решающее значение в стационарной фазе, поскольку содержание IHF увеличивается в пять раз в стационарной фазе, а дополнительные димеры IHF, вероятно, будут неспецифически связывать хромосомную ДНК. ^[21]^[52]^[53] В отличие от HU, IHF не образует толстые жесткие нити при более высоких концентрациях. Вместо этого его неспецифическое связывание также индуцирует изгиб ДНК, хотя степень изгиба намного меньше, чем в специфических сайтах, и аналогична гибкому изгибу, индуцированному HU в линейной ДНК при низких концентрациях. ^[54] In vitro изгиб, вызванный неспецифическим связыванием IHF, может вызывать конденсацию ДНК и способствовать образованию нуклеопротеиновых комплексов более высокого порядка в зависимости от концентраций хлорида калия и хлорида магния. ^[54] Организация ДНК высшего порядка с помощью IHF in vivo пока еще неясна. ^[54]

Х-НС

Отличительной особенностью гистоноподобного или термостабильного нуклеоидного структурирующего белка (H-NS) ^[55]^[56]^[57]^[58] от других NAP является способность переходить из гомодимерной формы при относительно низких концентрациях (<1 x 10 ^-5 М) в олигомерное состояние на более высоких уровнях. ^[59]^[60] Из-за свойств олигомеризации H-NS распространяется латерально вдоль AT-богатой ДНК в реакции нуклеации , где сайты с высоким сродством действуют как центры нуклеации. ^[61]^[62]^[28] Распространение H-NS на ДНК приводит к двум противоположным результатам в зависимости от концентрации магния в реакции. При низкой концентрации магния (< 2 мМ) H-NS образует жесткие нуклеопротеиновые нити, тогда как при более высоких концентрациях магния (> 5 мМ) он образует меж- и внутримолекулярные мостики. ^[63]^[64]^[65]^[66]^[67] Образование жестких нитей приводит к выпрямлению ДНК без конденсации, тогда как образование мостиков вызывает существенное сворачивание ДНК. ^[66] Анализ связывания H-NS в геноме с помощью анализа ChIP-Seq предоставил косвенные доказательства распространения H-NS на ДНК in vivo . H-NS избирательно связывается с 458 участками генома. ^[50] Хотя было продемонстрировано, что H-NS предпочитает изогнутую ДНК, образованную повторяющимися A-треками в последовательностях ДНК ^[61]^[68], основой селективного связывания является наличие мотива консервативной последовательности, обнаруженного в AT-богатых регионах. ^[27] Что еще более важно, частое появление мотива последовательности в области связывания H-NS, который может усилить кооперативные белок-белковые взаимодействия, и необычно большая длина области связывания согласуются с распространением белка. Преобладает ли in vivo образование нитей или образование мостиков ДНК , зависит от физиологической концентрации магния внутри клетки. ^[66]^[69] Если концентрация магния равномерно низкая (< 5 мМ), H-NS будет образовывать жесткие нуклеопротеиновые нити in vivo . ^[66] Альтернативно, если существует неравномерное распределение магния в клетке, это может способствовать как образованию мостиков ДНК, так и повышению жесткости, но в разных областях нуклеоида. ^[66]

Более того, H-NS наиболее известен как глобальный сайленсер генов, который преимущественно ингибирует транскрипцию горизонтально переносимых генов, и именно жесткая нить приводит к молчанию генов. ^[70]^[71] В совокупности оказывается, что образование жестких нитей является наиболее вероятным результатом взаимодействий H-NS-ДНК in vivo , что приводит к молчанию генов, но не вызывает конденсацию ДНК. Соответственно, отсутствие H-NS не меняет объем нуклеоида. ^[72] Однако вполне возможно, что E. coli испытывает высокую концентрацию магния в некоторых условиях окружающей среды. В таких условиях H-NS может переключаться с формы, индуцирующей филаменты, на форму, индуцирующую мостик, которая способствует конденсации и организации ДНК. ^[66]

Фис

Фактор стимуляции инверсии (Fis) представляет собой ДНК-связывающий белок, специфичный для последовательности, который связывается со специфическими последовательностями ДНК, содержащими симметричный мотив длиной 15 пар оснований. ^[29]^[30]^[73] Как и IHF, Fis индуцирует изгиб ДНК в родственных сайтах. Способность изгибать ДНК проявляется в структуре гомодимера Fis. Гомодимер Fis имеет два мотива спираль-поворот-спираль (HTH), по одному от каждого мономера. Мотив HTH обычно распознает большую бороздку ДНК. Однако расстояние между спиралями распознавания ДНК двух мотивов HTH в гомодимере Fis составляет 25 Å , что на ~ 8 Å короче, чем шаг канонической B-ДНК , что указывает на то, что белок должен изгибать или скручивать ДНК, чтобы стабильно связываться. . ^[74]^[75] Соответственно, кристаллическая структура комплексов Fis-ДНК показывает, что расстояние между спиралями узнавания остается неизменным, тогда как ДНК изгибается в диапазоне 60-75 градусов. ^[30] Существует 1464 области связывания Fis, распределенных по геному E. coli, и мотив связывания, идентифицированный компьютерным путем, соответствует известному мотиву длиной 15 п.н. ^[50]^[76] Специфическое связывание Fis в таких сайтах будет вызывать изгибы ДНК, тем самым способствуя конденсации ДНК за счет уменьшения длины персистенции ДНК. Более того, многие сайты связывания Fis встречаются последовательно, например, в стабильных промоторах РНК, например, в промоторе P1 оперона рРНК rrnB . Когерентное изгибание Fis в тандемных участках, вероятно, создаст микропетлю ДНК, которая может в дальнейшем способствовать конденсации ДНК. ^[77]

Помимо высокоаффинного специфического связывания с родственными сайтами, Fis может связываться со случайной последовательностью ДНК. Неспецифическое связывание ДНК имеет важное значение, поскольку Fis в фазе роста так же распространен, как и HU . Следовательно, ожидается, что большинство молекул Fis будут связываться с ДНК неспецифичным для последовательности образом. Эксперименты с магнитным пинцетом показывают, что это неспецифическое связывание Fis может способствовать конденсации и организации ДНК. ^[78]^[79] Fis вызывает мягкую конденсацию одиночной молекулы ДНК при <1 мМ, но индуцирует существенную укладку за счет образования петель ДНК среднего размера ~ 800 п.н. при >1 мМ. Петли в экспериментах с магнитным пинцетом отличаются от микропетлей, созданных в результате когерентного изгиба ДНК в родственных участках, поскольку они требуют образования комплексов ДНК-белок высокой плотности, достигаемых путем независимого от последовательности связывания. Хотя появление таких петель in vivo еще предстоит продемонстрировать, связывание Fis с высокой плотностью может происходить in vivo за счет согласованного действия как специфического, так и неспецифического связывания. Тандемное появление специфических сайтов может инициировать реакцию нуклеации, подобную реакции нуклеации H-NS, а затем неспецифическое связывание может привести к образованию локализованных массивов Fis высокой плотности. Мосты между этими локализованными областями могут создавать большие петли ДНК. ^[79] Fis присутствует исключительно в фазе роста , а не в стационарной фазе . ^[80]^[81] Таким образом, любая роль Fis в хромосомной конденсации должна быть специфичной для растущих клеток. ^[81]

Нуклеоид-ассоциированные РНК (нРНК)

Ранние исследования, изучавшие влияние обработки РНКазой А на изолированные нуклеоиды, показали, что РНК участвует в стабилизации нуклеоида в конденсированном состоянии. ^[82] Более того, обработка РНКазой А разрушала волокна ДНК на более тонкие волокна, как наблюдалось с помощью атомно-силовой микроскопии нуклеоида с использованием «процедуры лизиса на подложке». ^[83] Эти результаты продемонстрировали участие РНК в структуре нуклеоида, но идентичность молекулы РНК до недавнего времени оставалась неизвестной. ^[47] Большинство исследований HU были сосредоточены на его связывании с ДНК. ^[83] Однако HU также связывается с дцРНК и гибридами РНК-ДНК с более низким сродством, аналогичным сродству с линейной дцДНК. ^[84] Более того, HU преимущественно связывается с РНК, содержащими вторичные структуры, и с гибридом РНК-ДНК, в котором РНК содержит разрыв или выступ. ^[84]^[85] Сродство связывания HU с этими РНК-субстратами аналогично тому, с которым он связывается с искаженной ДНК. Иммунопреципитация HU-связанной РНК в сочетании с обратной транскрипцией и исследованием на микрочипах (RIP-Chip), а также анализ РНК из очищенных интактных нуклеоидов выявили молекулы РНК, связанные с нуклеоидами, которые взаимодействуют с HU. ^[47] Некоторые из них являются некодирующими РНК, и одна такая РНК, названная naRNA4 (нуклеоид-ассоциированная РНК 4), кодируется повторяющимся экстрагенным палиндромом ( REP325 ). У штамма, лишенного REP325 , нуклеоид деконденсирован, как и у штамма, лишенного HU. ^[47] naRNA4, скорее всего, участвует в конденсации ДНК, соединяя сегменты ДНК в присутствии HU. ^[86] Недавние исследования дают представление о молекулярном механизме того, как naRNA4 устанавливает связи ДНК-ДНК. РНК нацелена на области ДНК, содержащие крестообразные структуры, и образует комплекс РНК-ДНК, который имеет решающее значение для установления связей ДНК-ДНК. ^[87] Удивительно, но хотя HU помогает в образовании комплекса, он не присутствует в конечном комплексе, что указывает на его потенциальную роль в качестве катализатора (шаперона). Природа комплекса РНК-ДНК остается загадочной, поскольку формирование комплекса не требует обширного спаривания оснований Уотсона/Крика, но чувствительно к РНКазе H, которая расщепляет РНК в гибриде РНК-ДНК, и комплекс связывается с антителом, специфичным для Гибриды РНК-ДНК. ^[47]^[83]^[84]

Суперспирализация

Из-за своей спиральной структуры двухцепочечная молекула ДНК становится топологически ограниченной в ковалентно замкнутой кольцевой форме, что исключает вращение свободных концов. ^[88] Число раз, когда две нити пересекают друг друга в топологически ограниченной ДНК, называется числом связи (Lk), которое эквивалентно количеству спиральных витков или скручиваний в кольцевой молекуле. ^[89] Lk топологической ДНК остается инвариантной, независимо от того, как деформируется молекула ДНК, до тех пор, пока ни одна цепь не разорвана. ^[90]^[91]

Lk ДНК в релаксированной форме определяется как Lk ₀ . Для любой ДНК Lk ₀ можно рассчитать, разделив длину (в п.н.) ДНК на количество п.н. на один виток спирали. Это соответствует 10,4 п.н. для релаксированной B-формы ДНК . Любое отклонение от Lk ₀ вызывает сверхспирализацию ДНК. Уменьшение числа связывания (Lk<Lk ₀ ) создает отрицательную сверхспирализацию, тогда как увеличение числа связывания (Lk>Lk ₀ ) создает положительную сверхспирализацию. ^[92]^[90]

Состояние сверхспирализации (когда Lk не равно Lk ₀ ) приводит к переходу в структуре ДНК, который может проявляться в изменении количества витков (отрицательное <10,4 п.н./виток, положительное >10,4 п.н. на оборот) и/или в образование корчей , называемых суперспиралами. Таким образом, Lk математически определяется как знакозависимая сумма двух геометрических параметров: скручивания и скручивания. Количественной мерой сверхспирализации, не зависящей от размера молекул ДНК, является плотность суперспирализации (σ), где σ =∆Lk/Lk ₀ . ^[91]

Писцы могут принимать две структуры; плектонема и соленоид или тороид. Плектонемическая структура возникает в результате переплетения винтовых осей. Тороидальные суперспирали возникают, когда ДНК образует несколько спиралей, расположенных вокруг оси и не пересекающихся друг с другом, как в телефонном шнуре. ^[90] Корчи в форме плектонем являются правосторонними и левосторонними в положительно или отрицательно сверхспиральной ДНК соответственно. Ориентальность тороидальных суперспиралей противоположна таковой у плектонем. И плектонемы, и тороидальные суперспирали могут находиться как в свободной форме, так и в связанной форме с белками. Лучшим примером связанной тороидальной суперспирализации в биологии является эукариотическая нуклеосома , в которой ДНК обертывается вокруг гистонов . ^[17]

Плектонемические суперспирали у E. coli

У большинства бактерий ДНК присутствует в сверхспиральной форме. Круговая природа хромосомы E. coli делает ее топологически ограниченной молекулой, которая в основном имеет отрицательную сверхспирализацию с расчетной средней плотностью сверхспирализации (σ) -0,05. ^[93] В хроматине эукариот ДНК находится в основном в тороидальной форме, которая ограничена и определяется гистонами посредством образования нуклеосом. Напротив, в нуклеоиде E. coli около половины хромосомной ДНК организовано в виде свободных плектонемических суперспиралей. ^[94]^[95]^[96] Оставшаяся ДНК удерживается либо в плектонемической форме, либо в альтернативных формах, включая, помимо прочего, тороидальную форму, за счет взаимодействия с белками, такими как NAP. Таким образом, плектонемические суперспирали представляют собой эффективную суперспираль генома E. coli , отвечающую за его конденсацию и организацию. И плектонемическая, и тороидальная суперспирализация способствуют конденсации ДНК. Примечательно, что из-за разветвленности плектонемических структур она обеспечивает меньшую конденсацию ДНК, чем тороидальная структура. Молекула ДНК одинакового размера с одинаковой плотностью суперспирализации более компактна в тороидальной форме, чем в плектонемической форме. Помимо конденсации ДНК, сверхспирализация способствует организации ДНК. Он способствует распутыванию ДНК, уменьшая вероятность сцепления. ^[97] Суперспирализация также помогает сблизить два удаленных участка ДНК, тем самым способствуя потенциальному функциональному взаимодействию между различными сегментами ДНК. ^[91]

Источники сверхспирализации E. coli

Три фактора способствуют созданию и поддержанию сверхспирализации хромосомной ДНК в E. coli : (i) активность топоизомераз , (ii) акт транскрипции и (iii) NAP. ^[95]

Топоизомеразы

Топоизомеразы представляют собой особую категорию метаболических ферментов ДНК, которые создают или устраняют сверхспирализацию путем разрыва, а затем повторного лигирования нитей ДНК. ^[98] E. coli обладает четырьмя топоизомеразами. ДНК-гираза вызывает отрицательную сверхспирализацию в присутствии АТФ и устраняет положительную сверхспирализацию в отсутствие АТФ. ^[99] Во всех формах жизни ДНК-гираза является единственной топоизомеразой, которая может создавать отрицательную суперспираль, и именно из-за этой уникальной способности бактериальные геномы обладают свободными отрицательными суперспиралями; ДНК-гираза обнаружена у всех бактерий, но отсутствует у высших эукариот. Напротив, Topo I противостоит ДНК-гиразе, расслабляя отрицательно сверхспирализованную ДНК. ^[100]^[101] Имеются генетические данные, позволяющие предположить, что баланс между противоположными активностями ДНК-гиразы и Topo I ответственен за поддержание устойчивого уровня средней отрицательной сверхспиральности в E. coli . ^[100]^[102] Оба фермента необходимы для выживания E. coli . Нулевой штамм topA , гена, кодирующего Topo I, выживает только благодаря наличию супрессорных мутаций в генах, кодирующих ДНК-гиразу. ^[100]^[102] Эти мутации приводят к снижению активности гиразы, что позволяет предположить, что избыточная отрицательная сверхспирализация из-за отсутствия Topo I компенсируется снижением активности отрицательной суперспирализации ДНК-гиразы. Topo III необязателен для E. coli , и неизвестно, играет ли он какую-либо роль в суперспирализации E. coli. ^[103] Основная функция Topo IV — разделение сестринских хромосом. Однако было показано, что он также способствует устойчивому уровню отрицательной сверхспирализации за счет ослабления отрицательной суперспирализации вместе с Топо I. ^[104]^[105]

Транскрипция

Модель двойного суперспирального домена, предложенная Лю и Вангом, утверждала, что раскручивание двойной спирали ДНК во время транскрипции вызывает суперспирализацию ДНК, как показано на рисунке ^106. Согласно их модели, транскрибирующая РНК-полимераза (РНКП), скользящая вдоль ДНК, заставляет ДНК вращаться. его винтовая ось. Препятствие свободному вращению ДНК может возникнуть из-за топологического ограничения, в результате чего ДНК перед РНКП станет чрезмерно перекрученной (положительно сверхспиральной), а ДНК позади РНКП станет недостаточно перекрученной (отрицательно сверхспиральной). Было обнаружено, что топологическое ограничение не требуется, поскольку RNAP генерирует достаточный крутящий момент, который вызывает суперспирализацию даже в линейной матрице ДНК. ^[107] Если ДНК уже имеет отрицательную суперспираль, это действие расслабляет существующие отрицательные суперспирали, прежде чем вызвать накопление положительных суперспиралей перед РНКП и вводит больше отрицательных суперспиралей позади РНКП. В принципе, ДНК-гираза и Topo I должны удалять избыток положительных и отрицательных суперспиралей соответственно, но если скорость элонгации РНКП превышает оборот двух ферментов, транскрипция способствует устойчивому уровню суперспирализации. ^[107]

Контроль сверхспирализации с помощью NAP

В хроматине эукариот ДНК редко присутствует в свободной сверхспиральной форме, поскольку нуклеосомы сдерживают почти всю отрицательную суперспирализацию за счет прочного связывания ДНК с гистонами. Аналогично, в E. coli нуклеопротеиновые комплексы, образованные NAP, сдерживают половину плотности суперспирализации нуклеоида. ^[93]^[96] Другими словами, если NAP диссоциирует от нуклеопротеинового комплекса , ДНК примет свободную плектонемическую форму. Экспериментально было показано, что связывание ДНК HU, Fis и H-NS сдерживает отрицательную сверхспирализацию в расслабленной, но топологически ограниченной ДНК. ^[108]^[109]^[110]^[111]^[112] Они могут делать это либо путем изменения шага спирали ДНК, либо создавая тороидальные корчи за счет изгиба и свертывания ДНК. Альтернативно, NAP могут преимущественно связываться и стабилизировать другие формы внутренней ДНК, такие как крестообразные структуры и разветвленные плектонемы. Сообщалось, что Fis организует разветвленные плектонемы посредством связывания с кроссоверными областями, а HU преимущественно связывается с крестообразными структурами. ^[112]

NAP также косвенно регулируют сверхспирализацию ДНК. Fis может модулировать суперспирализацию, подавляя транскрипцию генов, кодирующих ДНК-гиразу. ^[113] Существуют генетические данные, позволяющие предположить, что HU контролирует уровни суперспирализации путем стимуляции ДНК-гиразы и снижения активности Topo I. ^[114]^[115] В подтверждение генетических исследований было показано, что HU стимулирует декатенацию, катализируемую ДНК-гиразой. ДНК in vitro . ^[116] Механически неясно, как HU модулирует активность гиразы и Topo I. HU может физически взаимодействовать с ДНК-гиразой и Topo I, или деятельность по организации ДНК HU, такая как изгиб ДНК, может облегчать или ингибировать действие ДНК-гиразы и Topo I. Я соответственно. ^[114]^[116]

Плектонемические суперспирали организуются в несколько топологических доменов.

Одной из поразительных особенностей нуклеоида является то, что плектонемические суперспирали организованы в несколько топологических доменов. ^[117] Другими словами, одиночный разрез в одной области ослабит только эту область, а не другие. Топологическая область образуется из-за барьера суперспирали-диффузии. Независимые исследования с использованием различных методов показали, что размер топологических доменов варьируется от 10 до 400 КБ. ^[95]^[117]^[118] Случайное размещение барьеров, обычно наблюдаемое в этих исследованиях, по-видимому, объясняет широкую вариабельность размеров доменов. ^[117]

Хотя идентичность доменных барьеров еще предстоит установить, возможные механизмы, ответственные за формирование барьеров, включают: (i) Доменный барьер может формироваться, когда белок, способный сдерживать суперспирали, одновременно связывается с двумя разными участками на хромосоме, образуя топологически изолированная петля или домен ДНК. Экспериментально было продемонстрировано, что опосредованное белком петлеобразование в суперспиральной ДНК может создавать топологический домен. ^[119]^[120] NAP, такие как H-NS и Fis, являются потенциальными кандидатами, основываясь на их способностях к образованию петель ДНК и распределении их сайтов связывания. (ii) Элементы бактериальной мозаики (BIME) также являются потенциальными кандидатами на роль доменных барьеров. BIME — это палиндромные повторяющиеся последовательности, которые обычно встречаются между генами. Было показано, что BIME препятствует диффузии суперспирализации в синтетически созданной топологической кассете, встроенной в хромосому E. coli . ^[121] По всему геному распределено около 600 BIME, что, возможно, разделяет хромосому на 600 топологических доменов. ^[122] (iii) Барьеры также могут возникать в результате прикрепления ДНК к клеточной мембране посредством белка, который связывается как с ДНК, так и с мембраной, или в результате зарождающейся транскрипции и трансляции белков, закрепленных на мембране. (iv) Транскрипционная активность может создавать барьеры суперспирализации-диффузии. Было показано, что активно транскрибирующая РНКП блокирует диссипацию плектонемических суперспиралей, тем самым образуя барьер диффузии суперспиралей. ^[123]^[124]^[125]

Динамика нуклеоида, зависящая от фазы роста

Нуклеоид реорганизуется в клетках в стационарной фазе, что позволяет предположить, что структура нуклеоида очень динамична и определяется физиологическим состоянием клеток. Сравнение карт контактов нуклеоида с высоким разрешением показало, что дальние контакты в макродомене Ter увеличились в стационарной фазе по сравнению с фазой роста . ^[126] Кроме того, границы CID в стационарной фазе отличались от границ, обнаруженных в фазе роста. Наконец, морфология нуклеоида претерпевает массивную трансформацию во время длительной стационарной фазы; ^[127] нуклеоид имеет упорядоченную тороидальную структуру. ^[128]

Специфические изменения в структуре нуклеоида в фазе роста могут быть вызваны изменением уровней архитектурных белков ДНК, связанных с нуклеоидами (NAP и субъединицы Muk), суперспирализацией и транскрипционной активностью. Содержание NAP и субъединиц Muk меняется в зависимости от цикла роста бактерий. Fis и индуцированный голоданием ДНК-связывающий белок Dps, еще один NAP, почти исключительно присутствуют в фазе роста и стационарной фазе соответственно. Уровни Fis повышаются при входе в экспоненциальную фазу, а затем быстро снижаются, пока клетки все еще находятся в экспоненциальной фазе, достигая уровней, которые невозможно обнаружить в стационарной фазе. ^[129] В то время как уровни Fis начинают снижаться, уровни Dps начинают расти и достигают максимума в стационарной фазе. ^[21] Резкий переход в структуре нуклеоида, наблюдаемый в длительной стационарной фазе, в основном объясняется Dps. Он образует ДНК/ кристаллические сборки, которые защищают нуклеоид от агентов, повреждающих ДНК, присутствующих во время голодания. ^[128]

HU, IHF и H-NS присутствуют как в фазе роста, так и в стационарной фазе. ^[21] Однако их численность значительно меняется, так что HU и Fis являются наиболее распространенными NAP в фазе роста, тогда как IHF и Dps становятся наиболее распространенными NAP в стационарной фазе. ^[21] HUαα является преобладающей формой на ранней экспоненциальной фазе, тогда как гетеродимерная форма преобладает в стационарной фазе с небольшим количеством гомодимеров. ^[130] Этот переход имеет функциональные последствия в отношении структуры нуклеоида, поскольку две формы, по-видимому, по-разному организуют и конденсируют ДНК; как гомо-, так и гетеродимеры образуют нити, но только гомодимер может объединять несколько сегментов ДНК, образуя сеть ДНК. ^[45] Число копий MukB увеличивается в два раза в стационарной фазе. ^[131]^[132] Увеличение числа молекул MukB может влиять на процессивность комплекса MukBEF как фактора выдавливания петель ДНК, что приводит к увеличению или увеличению числа петель. ^[131]^[132]

Суперспирализация может действовать согласованно с архитектурными белками ДНК, реорганизовывая нуклеоид. Общий уровень суперспирализации снижается в стационарной фазе, а на региональном уровне суперспирализация имеет иную картину. ^[133] Изменения в суперспирализации могут изменить топологическую организацию нуклеоида. Более того, поскольку хромосомная область с высокой транскрипционной активностью образует границу CID, изменения в транскрипционной активности во время разных фаз роста могут изменять формирование границ CID и, следовательно, пространственную организацию нуклеоида. Возможно, изменения границ CID, наблюдаемые в стационарной фазе, могут быть связаны с высокой экспрессией другого набора генов в стационарной фазе по сравнению с фазой роста. ^[126]

Структура нуклеоида и экспрессия генов

NAP и экспрессия генов

Структура хромосом E. coli и экспрессия генов, по-видимому, взаимно влияют друг на друга. С одной стороны, корреляция границы CID с высокой транскрипционной активностью указывает на то, что организация хромосом регулируется транскрипцией. С другой стороны, трехмерная структура ДНК внутри нуклеоида на всех уровнях может быть связана с экспрессией генов. Во-первых, было показано, что реорганизация трехмерной архитектуры нуклеоида в E. coli может динамически модулировать паттерн клеточной транскрипции. ^[134] Мутант HUa сделал нуклеоид очень сильно конденсированным за счет повышенной положительной сверхспиральности хромосомной ДНК. Следовательно, многие гены были подавлены, а многие покоящиеся гены экспрессировались. Кроме того, существует множество конкретных случаев, когда белково-опосредованные локальные архитектурные изменения изменяют транскрипцию генов. Например, образование жестких нуклеопротеиновых нитей с помощью H-NS блокирует доступ РНКП к промотору, тем самым предотвращая транскрипцию гена. ^[135] Посредством подавления генов H-NS действует как глобальный репрессор, преимущественно ингибирующий транскрипцию горизонтально переносимых генов. ^[50]^[27] В другом примере специфическое связывание HU с опероном gal способствует образованию петли ДНК, которая поддерживает репрессию оперона gal в отсутствие индуктора. ^[136] Топологически отличная микропетля ДНК, созданная в результате когерентного изгиба ДНК с помощью Fis на стабильных промоторах РНК, активирует транскрипцию. ^[77] Изгиб ДНК с помощью IHF дифференциально контролирует транскрипцию с двух тандемных промоторов оперона ilvGMEDA в E. coli . ^[137]^[138] Специфические топологические изменения, вызванные NAP, не только регулируют транскрипцию генов, но также участвуют в других процессах, таких как инициация репликации ДНК, рекомбинация и транспозиция. ^[9]^[10]^[11] В отличие от специфической регуляции генов, еще предстоит выяснить, как структура хромосом высшего порядка и ее динамика влияют на глобальную экспрессию генов на молекулярном уровне. ^[139]

Сверхспирализация ДНК и экспрессия генов

Между суперспирализацией ДНК и транскрипцией генов существует двусторонняя взаимосвязь. ^[139] Отрицательная сверхспирализация промоторной области может стимулировать транскрипцию, облегчая плавление промотора и увеличивая аффинность связывания ДНК белка-регулятора. Стохастические всплески транскрипции, по-видимому, являются общей характеристикой высокоэкспрессируемых генов, а уровни суперспирализации матрицы ДНК способствуют взрыву транскрипции. ^[140] Согласно модели двойного суперспирального домена, транскрипция гена может влиять на транскрипцию других близлежащих генов посредством реле суперспирализации. Одним из таких примеров является активация промотора leu-500 . ^[139] Суперспирализация не только опосредует ген-специфичные изменения, но также опосредует крупномасштабные изменения в экспрессии генов. Топологическая организация нуклеоида может обеспечить независимую экспрессию генов, чувствительных к суперспирализации, в разных топологических доменах. Карта неограниченной суперспирализации в масштабе генома показала, что геномные регионы имеют разные плотности суперспирализации в стационарном состоянии, что указывает на то, что уровень суперспирализации различается в отдельных топологических доменах. ^[133] В результате изменение суперспирализации может привести к домен-специфической экспрессии генов, в зависимости от уровня суперспирализации в каждом домене. ^[133]

Эффект суперспирализации на экспрессию генов может быть опосредован NAP, которые прямо или косвенно влияют на суперспирализацию. Влияние HU на экспрессию генов, по-видимому, связано с изменением суперспирализации и, возможно, организацией ДНК более высокого порядка. Положительная корреляция между связыванием ДНК-гиразы и активацией генов, вызванной отсутствием HU, позволяет предположить, что изменения в суперспирализации ответственны за дифференциальную экспрессию. Также было обнаружено, что HU отвечает за позиционный эффект на экспрессию генов путем изоляции транскрипционных единиц путем ограничения суперспирализации, индуцированной транскрипцией. ^[141] Точечные мутации в HUa резко изменили профиль экспрессии генов E. coli, изменив ее морфологию , физиологию и метаболизм . В результате мутантный штамм оказался более инвазивным по отношению к клеткам млекопитающих. ^[134]^[142] Этот драматический эффект сопровождался уплотнением нуклеоида и усилением положительной сверхспирализации. ^[45]^[143] Мутантный белок представлял собой октамер, в отличие от димера дикого типа. Он оборачивает ДНК на своей поверхности правосторонним образом, сдерживая положительные суперспирали, в отличие от HU дикого типа. ^[143] Эти исследования показывают, что аминокислотные замены в HU могут оказывать существенное влияние на структуру нуклеоида, что, в свою очередь, приводит к значительным фенотипическим изменениям. ^[143]

Поскольку MukB и HU стали ключевыми игроками во взаимодействиях ДНК на больших расстояниях, будет полезно сравнить влияние каждого из этих двух белков на глобальную экспрессию генов. ^[144] Хотя HU, по-видимому, контролирует экспрессию генов путем модуляции плотности суперспирализации, точный молекулярный механизм остается неизвестным, а влияние MukB на экспрессию генов еще предстоит проанализировать. ^[144]^[145]

Пространственная организация

Домены хромосомного взаимодействия

В последние годы появление молекулярного метода, называемого захватом конформации хромосом (3C), позволило изучить пространственную организацию хромосом с высоким разрешением как у бактерий, так и у эукариот. ^[146] 3C и его версия, связанная с глубоким секвенированием (Hi-C) ^[147], определяют физическую близость, если таковая имеется, между любыми двумя геномными локусами в трехмерном пространстве. Карта контактов бактериальных хромосом с высоким разрешением, включая хромосому E. coli , показала, что бактериальная хромосома сегментирована на множество областей с высокой степенью самодействия, называемых доменами хромосомного взаимодействия (CID). ^[126]^[148]^[149] CID эквивалентны топологически ассоциированным доменам (TAD), наблюдаемым во многих эукариотических хромосомах, ^[150] предполагая, что образование CID является общим явлением организации генома. Две характеристики определяют CID или TAD. Во-первых, геномные области CID физически взаимодействуют друг с другом чаще, чем с геномными областями за пределами этого CID или с областями соседнего CID. Во-вторых, наличие границы между CID, препятствующей физическому взаимодействию геномных областей двух соседних CID. ^[126]

Было обнаружено, что хромосома E. coli состоит из 31 CID в фазе роста. Размер CID варьировался от 40 до ~300 КБ. Похоже, что барьер суперспирализации-диффузии, ответственный за разделение плектонемических петель ДНК на топологические домены, функционирует как граница CID у E. coli и многих других бактерий. Другими словами, наличие сверхспирально-диффузионного барьера определяет формирование CID. Результаты зондирования Hi-C хромосом в E. coli , Caulobacter crescentus и Bacillus subtilis сходятся в модели, согласно которой формируются CID, поскольку плектонемическое образование петель вместе с деятельностью по организации ДНК NAP способствует физическому взаимодействию между геномными локусами, а граница CID состоит из область без плектонем (PFR), которая предотвращает эти взаимодействия. PFR создается из-за высокой транскрипционной активности, поскольку спиральное раскручивание ДНК за счет активной транскрипции РНКП сдерживает плектонемические суперспирали. В результате диссипация суперспиралей также блокируется, создавая барьер диффузии суперспиралей. Косвенным подтверждением этой модели является наблюдение, что CID бактериальных хромосом, включая хромосому E. coli , содержат на своих границах гены с высокой степенью транскрипции, что указывает на роль транскрипции в формировании границы CID. ^[126]^[148] Более прямое доказательство было получено в результате открытия того, что размещение высоко транскрибируемого гена в положении, где не было границы, создавало новую границу CID в хромосоме C. crescentus . ^[148] Однако не все границы CID коррелируют с высоко транскрибируемыми генами в хромосоме E. coli, что позволяет предположить, что другие неизвестные факторы также ответственны за формирование границ CID и диффузионных барьеров суперспирализации. ^[148]

Макродомены

Плектонемические петли ДНК, организованные в виде топологических доменов или CID, по-видимому, далее сливаются, образуя большие пространственно различные домены, называемые макродоменами (MD). В E. coli MDs первоначально были идентифицированы как большие сегменты генома, чьи ДНК-маркеры локализовались вместе (совместно) в исследованиях флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). ^[151]^[152] Большая область генома (~ 1 Мб), охватывающая локус oriC (начало репликации хромосом), колокализовалась и называлась макродоменом Ori. Аналогично, большая геномная область (~1-Mb), покрывающая область конца репликации ( ter ), локализовалась совместно и была названа макродоменом Ter. Позже MD были идентифицированы на основании того, как часто пары лямбда- атт -сайтов, вставленных в различные удаленные места хромосомы, рекомбинировали друг с другом. В этом методе, основанном на рекомбинации, MD определялся как большая область генома, сайты ДНК которой могут преимущественно рекомбинировать друг с другом, но не с участками за пределами этого MD. Метод, основанный на рекомбинации, подтвердил MD Ори и Тер, которые были идентифицированы в исследованиях FISH, и идентифицировал два дополнительных MD. ^[12]^[153]

Два дополнительных MD были образованы дополнительными областями размером ~ 1 Мб, фланкирующими Ter, и назывались левым и правым. Эти четыре MD (Ori, Ter, Left и Right) составляют большую часть генома, за исключением двух геномных областей, фланкирующих Ori. Эти два региона (NS-L и NS-R) были более гибкими и неструктурированными по сравнению с МД, поскольку сайты ДНК в них рекомбинировали с сайтами ДНК, расположенными в МД с обеих сторон. Генетическое положение oriC, по-видимому, диктует формирование MD, поскольку изменение положения oriC посредством генетических манипуляций приводит к реорганизации MD. Например, геномные регионы, ближайшие к oriC , всегда ведут себя как NS независимо от последовательности ДНК, а регионы, расположенные дальше, всегда ведут себя как MD. ^[154]

Метод Hi-C дополнительно подтвердил иерархическую пространственную организацию CID в форме макродоменов. ^[126] Другими словами, CID макродомена физически взаимодействовали друг с другом чаще, чем с CID соседнего макродомена или с геномными локусами вне этого макродомена. Данные Hi-C показали, что хромосома E. coli разделилась на два отдельных домена. Область, окружающая ter, образует изолированный домен, который перекрывается с ранее идентифицированным Ter MD. Контакты ДНК-ДНК в этом домене происходили только в диапазоне до ~280 т.п.н. Остальная часть хромосомы образовывала один домен, геномные локусы которого имели контакты в диапазоне> 280 т.п.н. ^[126] Хотя большинство контактов в этом домене были ограничены максимальным расстоянием ~ 500 т.п.н., были две рыхлые области, геномные локусы которых образовывали контакты на еще больших расстояниях (до ~1 Мб). Эти рыхлые области соответствовали ранее выявленным гибким и менее структурированным областям (NS). Границы изолированного домена, охватывающего ter , и две рыхлые области, идентифицированные методом Hi-C, сегментировали всю хромосому на шесть областей, которые соответствуют четырем MD и двум NS областям, определенным с помощью анализов на основе рекомбинации. ^[126]

Белки, управляющие образованием макродоменов

МатП

Поиск белка(ов), ответственного за образование макродоменов, привел к идентификации белка Macrodomain Ter (MatP). MatP почти исключительно связывается с Ter MD путем распознавания мотива длиной 13 п.о., называемого макродоменной последовательностью ter ( matS ). ^[32] В домене Ter присутствует 23 сайта matS , в среднем на каждые 35 КБ приходится один сайт. Дополнительные доказательства связывания MatP с доменом Ter получены при флуоресцентной визуализации MatP. Наблюдались дискретные фокусы MatP, которые локализовались совместно с маркерами ДНК домена Ter. ^[32] Сильное обогащение сигнала ChIP-Seq в Ter MD также подтверждает преимущественное связывание MatP с этим доменом. ^[32]

MatP конденсирует ДНК в домене Ter, поскольку отсутствие MatP увеличивает расстояние между двумя флуоресцентными маркерами ДНК, расположенными на расстоянии 100 т.п.н. друг от друга в домене Ter. Более того, MatP играет решающую роль в изоляции домена Ter от остальной части хромосомы. ^[126] Он способствует контактам ДНК-ДНК внутри домена Ter, но предотвращает контакты между локусами ДНК домена Ter и локусами фланкирующих областей. Как MatP конденсирует ДНК и способствует контактам ДНК-ДНК? Результаты экспериментов противоречивы. MatP может образовывать петлю ДНК между двумя сайтами matS in vitro , и его активность образования петли ДНК зависит от тетрамеризации MatP. Тетрамеризация происходит посредством спиральных взаимодействий между двумя молекулами MatP, связанными с ДНК. ^[156] Одна очевидная модель, основанная на результатах in vitro , заключается в том, что MatP способствует контактам ДНК-ДНК in vivo путем соединения сайтов matS . Однако, хотя MatP соединял удаленные сайты в исследованиях Hi-C, он не связывал конкретно сайты matS . Более того, мутант MatP, который не мог образовывать тетрамеры, вел себя как дикий тип. Эти результаты противоречат модели мостиков matS для организации Ter, оставляя механизм действия MatP неуловимым. Одна из возможностей состоит в том, что MatP распространяется на близлежащие сегменты ДНК от своего первичного сайта связывания matS и удаленных сайтов мостика по механизму, который не зависит от тетрамеризации. ^[156]

МукБЭФ

MukB принадлежит к семейству АТФаз, называемых структурным обеспечением белков хромосом (SMC), которые участвуют в организации хромосом высшего порядка у эукариот. ^[145] Два мономера MukB связываются посредством непрерывного антипараллельного спирального взаимодействия, образуя жесткий стержень длиной 100 нм. В середине стержня имеется гибкая шарнирная область. ^[162]^[163] Благодаря гибкости шарнирной области MukB принимает характерную V-образную форму семейства SMC. Субъединицами, не относящимися к SMC, связанными с MukB, являются MukE и MukF. Ассоциация замыкает образование V, в результате чего образуются крупные кольцевые структуры. MukE и MukF кодируются вместе с MukB в одном опероне E. coli . ^[164] Делеция любой субъединицы приводит к одному и тому же фенотипу, что позволяет предположить, что комплекс MukBEF является функциональной единицей in vivo . ^[160] ДНК-связывающая активность комплекса находится в субъединице MukB, тогда как MukE и MukF модулируют активность MukB. ^[164]

Комплекс MukBEF вместе с Topo IV необходим для декатенации и репозиционирования вновь реплицированных oriC s. ^[165]^[166]^[167]^[168]^[155] Роль MukBEF не ограничивается во время репликации ДНК. Он организует и конденсирует ДНК даже в нереплицирующихся клетках. ^{[131] Недавняя карта конформации хромосом высокого разрешения штамма}E. coli , лишенного MukB, показывает, что MukB участвует в формировании взаимодействий ДНК-ДНК на всей хромосоме, за исключением домена Ter. ^[126] Как MukB не может действовать в домене Ter? MatP физически взаимодействует с MukB, тем самым предотвращая локализацию MukB в домене Ter. ^[155] Это очевидно по связыванию ДНК MatP и MukB в домене Ter. ДНК-связывание MatP обогащено доменом Ter, тогда как ДНК-связывание MukB снижено по сравнению с остальной частью генома. Более того, у штамма, уже лишенного MatP, отсутствие MukB вызывает уменьшение контактов ДНК по всей хромосоме, включая домен Ter. ^[126] Этот результат согласуется с мнением, что MatP вытесняет MukB из домена Ter. ^[126]

Как комплекс MukBEF организует хромосому E. coli ? Согласно современным представлениям, комплексы SMC организуют хромосомы путем выдавливания петель ДНК. ^[169] Комплексы SMC перемещаются вдоль ДНК, выдавливая петли цис-способом (на одной и той же молекуле ДНК), при этом размер петель зависит от процессивности комплекса. Комплексы ГМК разных организмов различаются механизмом экструзии петель. ^[169] Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул MukBEF в E. coli позволяет предположить, что минимальной функциональной единицей in vivo является димер из димеров. ^[160] Эта единица образуется путем соединения двух АТФ-связанных комплексов MukBEF посредством димеризации, опосредованной MukF. МукБЕФ локализуется в клетке в виде 1-3 кластеров, вытянутых параллельно длинной оси клетки. Каждый кластер содержит в среднем ~8-10 димеров. Согласно текущей модели, MukBEF выдавливает петли ДНК методом «скалолазания». ^[160]^[170] Димер из димеров высвобождает один сегмент ДНК и захватывает новый сегмент ДНК, не отделяясь от хромосомы. Помимо образования петель ДНК, связь между отрицательной суперспирализацией и функцией MukBEF in vivo вместе со способностью субъединицы MukB ограничивать отрицательные суперспирали in vitro позволяет предположить, что MukBEF организует ДНК путем создания суперспиралей. ^[171]^[172]^[173]

Роль NAP и naRNA

Помимо вклада в уплотнение хромосом за счет изгиба, образования мостов и образования петель ДНК в меньшем масштабе (~ 1 т.п.н.), NAP участвуют в конденсации и организации ДНК, способствуя дальним контактам ДНК-ДНК. Два NAP, Fis и HU, стали ключевыми игроками в обеспечении дальних контактов ДНК-ДНК, которые происходят по всей хромосоме. ^[126] Еще предстоит изучить, как деятельность по организации ДНК Fis и HU, которая хорошо понята в меньшем масштабе (~ 1 т.п.н.), приводит к образованию дальнодействующих взаимодействий ДНК-ДНК. Тем не менее, некоторые взаимодействия ДНК, опосредованные HU, требуют присутствия naRNA4. ^[86] naRNA4 также участвует в установлении дальних контактов ДНК. HU катализирует некоторые контакты, а не все, что позволяет предположить, что РНК участвует вместе с другими NAP в формировании контактов ДНК. HU также, по-видимому, действует вместе с MukB, способствуя долгосрочным взаимодействиям ДНК-ДНК. Эта точка зрения основана на наблюдениях о том, что отсутствие HU или MukB вызывало уменьшение одних и тех же контактов ДНК-ДНК. Неясно, как MukB и HU потенциально действуют вместе, способствуя взаимодействиям ДНК-ДНК. Вполне возможно, что два белка взаимодействуют физически. Альтернативно, в то время как MukBEF выдавливает большие петли ДНК, HU конденсирует и организует эти петли. ^[169]^[48]

Роль функционального родства генов

Есть сообщения о том, что функционально связанные гены E. coli физически находятся вместе в трехмерном пространстве внутри хромосомы, хотя они находятся далеко друг от друга на генетическом расстоянии. Пространственная близость функционально связанных генов не только делает биологические функции более разделенными и эффективными, но также способствует сворачиванию и пространственной организации нуклеоида. Недавнее исследование с использованием флуоресцентных маркеров для обнаружения специфических локусов ДНК изучило попарные физические расстояния между семью оперонами рРНК, которые генетически отделены друг от друга (на целых два миллиона пар оснований). В нем сообщалось, что все опероны, кроме rrn C, находились в физической близости. ^[174]^[175] Удивительно, но исследования 3C-seq не выявили физической кластеризации оперонов rrn , что противоречит результатам исследования, основанного на флуоресценции. ^[126] Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для разрешения этих противоречивых наблюдений. В другом примере GalR образует сеть взаимодействия сайтов связывания GalR, разбросанных по хромосоме. ^[176] GalR представляет собой регулятор транскрипции галактозного регулона, состоящий из генов, кодирующих ферменты транспорта и метаболизма сахара D-галактозы. ^[177] GalR существует только в одном-двух очагах в клетках ^[176] и может самоорганизовываться в большие упорядоченные структуры. ^[178] Таким образом, оказывается, что связанный с ДНК GalR мультимеризуется с образованием взаимодействий на больших расстояниях. ^[176]^[178]

Глобальная форма и структура

Традиционная трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ) химически фиксированных клеток E. coli показала нуклеоид как органеллу неправильной формы . Однако широкопольная флуоресцентная визуализация живых нуклеоидов в 3D выявила дискретную эллипсоидную форму. ^[3]^[14]^[15] Наложение фазово-контрастного изображения клетки и флуоресцентного изображения нуклеоида показало близкое сопоставление только в радиальном измерении по всей длине нуклеоида до периферии клетки. Эта находка указывает на радиальное ограничение нуклеоида. ^[13] Детальное изучение трехмерного флуоресцентного изображения после поперечного сечения перпендикулярно его длинной оси дополнительно выявило две глобальные особенности нуклеоида: кривизну и продольные области с высокой плотностью. Исследование киральности центральной линии нуклеоида путем соединения центра интенсивности каждого поперечного сечения показало, что общая форма нуклеоида изогнута. ^[15] Распределение интенсивности флуоресценции в поперечных сечениях выявило субструктуру плотности, состоящую из изогнутых областей или пучков высокой плотности в центральном ядре и областей низкой плотности на периферии. ^[13]^[14] Одним из следствий радиального ограничения является то, что оно определяет изогнутую форму нуклеоида. Согласно одной модели, нуклеоид вынужден изгибаться, потому что он заключен в цилиндрическую клетку E. coli , радиус которой меньше ее сгибаемой длины (персистенции). ^[13] Эта модель была подтверждена наблюдениями о том, что удаление клеточной стенки или ингибирование синтеза клеточной стенки увеличивает радиус клетки и приводит к сопутствующему увеличению радиуса спирали и уменьшению шага спирали в нуклеоиде. ^[13]

Нуклеоидно-мембранные связи

Сила расширения, обусловленная связями ДНК-мембрана, по-видимому, действует в противовес силам конденсации, поддерживая оптимальный уровень конденсации нуклеоида. Исследования клеточного фракционирования и электронной микроскопии впервые указали на возможность связей ДНК с мембраной. ^[179]^[180] В настоящее время известно несколько примеров соединений ДНК-мембраны. Трансерция — это механизм одновременной транскрипции, трансляции и вставки возникающих мембранных белков, который образует временные контакты ДНК-мембрана. ^[181] Было продемонстрировано, что трансерция двух мембранных белков LacY и TetA вызывает репозиционирование хромосомных локусов по направлению к мембране. ^[182] Другой механизм нуклеоидно-мембранных связей заключается в прямом контакте между мембранно-заякоренными регуляторами транскрипции и их целевыми сайтами в хромосоме. Одним из примеров такого регулятора транскрипции в E.coli является CadC. CadC содержит периплазматический сенсорный домен и цитоплазматический ДНК-связывающий домен. Ощущение кислой среды периплазматическим сенсорным доменом стимулирует ДНК-связывающую активность CadC, которая затем активирует транскрипцию его генов-мишеней. ^[183] Мембранная локализация генов, регулируемых мембранно-заякоренным регулятором транскрипции, еще не продемонстрирована. Тем не менее, ожидается, что активация генов-мишеней в хромосоме этими регуляторами приведет к контакту нуклеоид-мембрана, хотя это будет динамический контакт. Помимо этих примеров, хромосома также специфически закрепляется на клеточной мембране посредством белок-белкового взаимодействия между ДНК-связанными белками, например, SlmA и MatP, и дивисомой . ^[184]^[185] Поскольку гены, кодирующие мембранные белки, распределены по всему геному, динамические контакты ДНК-мембраны посредством трансерции могут действовать как сила расширения нуклеоида. Эта сила расширения будет действовать в противовес силам конденсации для поддержания оптимального уровня конденсации. Образование высококонденсированных нуклеоидов при воздействии на клетки E. coli хлорамфеникола, который блокирует трансляцию, обеспечивает поддержку силы расширения временных контактов ДНК-мембрана, образующихся в результате трансерции. ^[186]^[187] Круглая форма чрезмерно конденсированных нуклеоидов после обработки хлорамфениколом также предполагает роль опосредованных трансерцией контактов ДНК-мембраны в определении эллипсоидной формы нуклеоида. ^[187]

Визуализация

Нуклеоид можно четко визуализировать на электронной микрофотографии при очень большом увеличении , где, хотя его внешний вид может отличаться, он отчетливо виден на фоне цитозоля . ^[188] Иногда видны даже нити того, что принято считать ДНК . Окрашивая красителем Фельгена , который специфически окрашивает ДНК, нуклеоид также можно увидеть под световым микроскопом . ^[189]Интеркалирующие ДНК красители DAPI и бромид этидия широко используются для флуоресцентной микроскопии нуклеоидов. Он имеет неправильную форму и встречается в прокариотических клетках. ^[13]^[14]

Повреждение и восстановление ДНК

Изменения в структуре нуклеоида бактерий и архей наблюдаются после воздействия на ДНК повреждающих условий. Нуклеоиды бактерий Bacillus subtilis и Escherichia coli становятся значительно более компактными после УФ-облучения. ^[190]^[191] Формирование компактной структуры в E. coli требует активации RecA посредством специфических взаимодействий RecA-ДНК. ^[192] Белок RecA играет ключевую роль в гомологичной рекомбинационной репарации повреждений ДНК.

Подобно B. subtilis и E. coli , описанным выше, воздействие на архей Haloferax volcanii стрессов, повреждающих ДНК, вызывает уплотнение и реорганизацию нуклеоида. ^[193] Компактирование зависит от белкового комплекса Mre11-Rad50, который катализирует раннюю стадию гомологичной рекомбинационной репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Было высказано предположение, что уплотнение нуклеоидов является частью реакции на повреждение ДНК, которая ускоряет восстановление клеток, помогая белкам репарации ДНК определять местонахождение мишеней и облегчая поиск интактных последовательностей ДНК во время гомологичной рекомбинации. ^[193]