Преимплантационная генетическая диагностика ( ПГД или ПИГД ) — это генетическое профилирование эмбрионов до имплантации (как форма профилирования эмбрионов ), [1] а иногда даже ооцитов до оплодотворения . ПГД рассматривается аналогично пренатальной диагностике . При использовании для скрининга определенного генетического заболевания ее главным преимуществом является то, что она позволяет избежать селективного аборта , поскольку метод делает весьма вероятным, что ребенок не будет иметь рассматриваемого заболевания. Таким образом, ПГД является дополнением к вспомогательным репродуктивным технологиям и требует экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) для получения ооцитов или эмбрионов для оценки. Эмбрионы обычно получают с помощью биопсии бластомера или бластоцисты . Последняя методика оказалась менее вредной для эмбриона, поэтому рекомендуется проводить биопсию примерно на 5 или 6 день развития. [2]
Первая в мире ПГД была проведена Хэндисайдом, [3] Контоджанни и Уинстоном в больнице Хаммерсмит в Лондоне. «Женские эмбрионы были выборочно перенесены в пять пар с риском Х-сцепленного заболевания , что привело к двум близнецовым и одной одноплодной беременности ». [3] [4]
Термин «преимплантационный генетический скрининг» (ПГС) относится к набору методов для проверки эмбрионов (полученных с помощью ЭКО/ИКСИ) на наличие аномального числа хромосом . Другими словами, он проверяет, является ли эмбрион анеуплоидным или нет. ПГС также называется скринингом анеуплоидии . ПГС был переименован в преимплантационную генетическую диагностику анеуплоидии (ПГД-А) Международным обществом преимплантационной генетической диагностики (ПГДИС) в 2016 году. [5]
ПГД позволяет изучать ДНК яйцеклеток или эмбрионов, чтобы выбрать те, которые несут определенные мутации для генетических заболеваний. Это полезно, когда в семье есть предыдущие хромосомные или генетические нарушения и в контексте программ экстракорпорального оплодотворения. [6] Эти виды тестов необходимы, поскольку наследственные нарушения связаны с 20% детских смертей в развитых странах. По оценкам, в целом они ответственны за около 18% педиатрических госпитализаций.
Процедуры также можно назвать «преимплантационным генетическим профилированием», учитывая тот факт, что иногда их применяют к ооцитам или эмбрионам до имплантации по другим причинам, нежели диагностика или скрининг. [7]
Процедуры, выполняемые с половыми клетками перед оплодотворением, можно назвать методами отбора ооцитов или отбора сперматозоидов , хотя методы и цели частично совпадают с ПГД.
В 1968 году Роберт Эдвардс и Ричард Гарднер сообщили об успешной идентификации пола бластоцист кролика . [8] Только в 1980-х годах человеческое ЭКО было полностью разработано, что совпало с прорывом в области высокочувствительной технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые успешные тесты Хэндисайда, Контоджанни и Уинстона состоялись в октябре 1989 года, а первые роды произошли в 1990 году [9], хотя предварительные эксперименты были опубликованы несколькими годами ранее. [10] [11] В этих первых случаях ПЦР использовалась для определения пола пациентов с Х-сцепленными заболеваниями. В отчете 2001 года о мировом использовании ПГД с 1990 года сообщалось, что биопсия эмбриона или полярного тельца [12] проводилась в более чем 3000 клинических циклах с частотой наступления беременности 24%, что сопоставимо с методами вспомогательной репродуктивной практики, которые не включают биопсию.
Елена Контоджанни работала над докторской диссертацией в больнице Хаммерсмита по ПЦР отдельных клеток для определения пола, что она сделала, амплифицируя повторяющийся участок хромосомы Y. [3] Именно этот подход она использовала для первых в мире случаев ПГД. [4]
Женские эмбрионы были выборочно перенесены в пять пар с риском Х-сцепленного заболевания, что привело к двум близнецам и одной одноплодной беременности. Поскольку область Y-хромосомы, которую амплифицирует Контоджанни, содержит много повторов, это было более эффективно, чем пытаться амплифицировать уникальную область. Полоса на геле ПЦР указывала на то, что эмбрион был мужского пола, а отсутствие полосы указывало на то, что эмбрион был женского пола. Однако неудача амплификации или безъядерный бластомер также приводили к отсутствию полосы на геле ПЦР. Чтобы снизить риск неправильной диагностики, Контоджанни продолжил ко-амплификацию последовательностей на X и Y (Kontogianni et al., 1991). [13] В то время ничего не было известно о выпадении аллелей, загрязнении кумулюсных клеток или неудаче амплификации из отдельных клеток. В 1980-х годах человеческие эмбрионы ЭКО переносились исключительно на второй день развития, поскольку используемая культуральная среда была неспособна надежно выращивать эмбрионы после этой стадии. Поскольку биопсию нужно было сделать на третий день, все первые диагнозы были поставлены в один день, с переносом эмбрионов на третий день. Сравнение переносов на второй и третий день показало, что это не повлияет отрицательно на показатели наступления беременности. Беспокойство об остановке эмбрионов было настолько велико, что некоторые переносы проводились в ранние часы четвертого дня, чтобы эмбрионы были удалены из культуры как можно скорее. В Хаммерсмите было много вечеров, когда перенос выполнялся в час ночи на четвертый день, а исследователи возвращались в лабораторию в 7 утра, чтобы начать следующий случай. Уинстон помог принять роды большинству первых детей ПГД.
ПГД стала очень популярной в 1990-х годах, когда ее стали использовать для определения нескольких тяжелых генетических заболеваний, таких как серповидноклеточная анемия , болезнь Тея-Сакса , мышечная дистрофия Дюшенна и бета-талассемия . [14]
ПГД используется в основном для профилактики генетических заболеваний, путем отбора только тех эмбрионов, которые не имеют известных генетических нарушений. ПГД также может использоваться для увеличения шансов на успешную беременность, для соответствия брата или сестры по типу HLA , чтобы стать донором, для уменьшения предрасположенности к раку и для выбора пола . [2] [15] [16] [17]
ПГД часто используется для обнаружения аутосомно-доминантных, аутосомно-рецессивных и Х-сцепленных аномалий. Однако его использование для скрининга митохондриальных расстройств встречается реже, в первую очередь из-за непредсказуемых характеристик митохондриальной гетероплазмии. В случаях митохондриальной гетероплазмии некоторые митохондрии внутри клетки несут мутацию, а другие — нет. Соотношение мутантных митохондрий играет решающую роль в определении как проявления заболевания (его влияния на потомство), так и тяжести заболевания. [18]
ПГД доступна для большого количества моногенных расстройств , то есть расстройств, вызванных только одним геном ( аутосомно-рецессивным , аутосомно-доминантным или сцепленным с Х-хромосомой ) или хромосомными структурными аберрациями (такими как сбалансированная транслокация ). ПГД помогает этим парам идентифицировать эмбрионы, несущие генетическое заболевание или хромосомную аномалию, тем самым избегая больного потомства. Наиболее часто диагностируемыми аутосомно-рецессивными расстройствами являются муковисцидоз , бета- талассемия , серповидноклеточная анемия и спинальная мышечная атрофия типа 1. Наиболее распространенными доминантными заболеваниями являются миотоническая дистрофия , болезнь Хантингтона и болезнь Шарко-Мари-Тута ; а в случае заболеваний, сцепленных с Х-хромосомой, большинство циклов проводятся при синдроме ломкой Х-хромосомы , гемофилии А и мышечной дистрофии Дюшенна . Хотя это довольно редко, некоторые центры сообщают о ПГД для митохондриальных расстройств или двух показаний одновременно.
ПГД теперь также проводится при заболевании, называемом наследственными множественными экзостозами (МНЭ/МНЭ/ГМЭ).
Кроме того, существуют бесплодные пары, являющиеся носителями наследственного заболевания и выбирающие ПГД, поскольку ее можно легко совместить с лечением ЭКО.
Предимплантационное генетическое профилирование (PGP) было предложено в качестве метода определения качества эмбриона при экстракорпоральном оплодотворении , чтобы выбрать эмбрион, который, по-видимому, имеет наибольшие шансы на успешную беременность. Однако, поскольку результаты PGP основаны на оценке одной клетки, PGP имеет присущие ему ограничения, поскольку тестируемая клетка может не быть репрезентативной для эмбриона из-за мозаицизма . [19] Кроме того, исследование показало, что диагнозы биопсий одних и тех же эмбрионов в двух отдельных лабораториях совпадали только в 50% случаев. [20]
Систематический обзор и метаанализ существующих рандомизированных контролируемых испытаний пришли к выводу, что нет никаких доказательств полезного эффекта PGP, измеряемого по показателю живорождения . [19] Напротив, для женщин старшего материнского возраста PGP значительно снижает показатель живорождения. [19] Технические недостатки, такие как инвазивность биопсии и хромосомный мозаицизм, являются основными факторами, лежащими в основе неэффективности PGP. [19] Нормальные живорожденные дети со здоровым потомством после переноса эмбрионов, которые PGP сочла анеуплоидными, были зарегистрированы во всем мире. [21]
Альтернативные методы определения качества эмбрионов для прогнозирования частоты наступления беременности включают микроскопию, а также профилирование экспрессии РНК и белков .
Типирование эмбрионов по лейкоцитарному антигену человека (HLA), чтобы HLA ребенка совпадал с больным братом или сестрой, что позволяет использовать стволовые клетки пуповинной крови для донорства . [22] [23] В этом смысле ребенок является « братом-спасителем » для ребенка-реципиента. Тем временем типирование HLA стало важным показанием для ПГД в тех странах, где это разрешено законом. [24] Соответствие HLA можно сочетать с диагностикой моногенных заболеваний, таких как анемия Фанкони или бета-талассемия, в тех случаях, когда больной брат или сестра поражены этим заболеванием, или в исключительных случаях оно может проводиться само по себе в таких случаях, как дети с лейкемией . Главным этическим аргументом против является возможная эксплуатация ребенка, хотя некоторые авторы утверждают, что императив Канта не нарушается, поскольку будущий ребенок-донор будет не только донором, но и любимым человеком в семье. [ необходима цитата ]
Более недавнее применение ПГД — диагностика заболеваний с поздним началом и синдромов предрасположенности (к раку). Поскольку затронутые лица остаются здоровыми до начала заболевания, часто на четвертом десятилетии жизни, ведутся споры о том, подходит ли ПГД в этих случаях. Соображения включают высокую вероятность развития расстройств и потенциал для излечения. Например, при синдромах предрасположенности, таких как мутации BRCA , которые предрасполагают человека к раку груди, результаты неясны. Хотя ПГД часто рассматривается как ранняя форма пренатальной диагностики, характер запросов на ПГД часто отличается от запросов на пренатальну диагностику, сделанных, когда мать уже беременна. Некоторые из общепринятых показаний для ПГД были бы неприемлемы для пренатальной диагностики. [ необходима цитата ]
Женщина, являющаяся носителем гена ранней болезни Альцгеймера, использовала предимплантационную генетическую диагностику (ПГД), чтобы гарантировать, что ее ребенок не унаследует это состояние. Возникают этические вопросы относительно решения разрешить человеку, знающему о своей восприимчивости к поздней болезни, иметь ребенка, свободного от гена, несмотря на риск того, что ребенок может преждевременно потерять родителя. Некоторые утверждают, что это решение этично, утверждая, что желание репродукции является таким же законным для этих людей, как и для других, ищущих услуги по лечению бесплодия. Проводятся сравнения с другими медицинскими ситуациями, такими как вспомогательная репродукция для людей с ВИЧ или другими серьезными заболеваниями. Хотя ребенок может столкнуться с риском ранней утраты, выдвигается аргумент, что психологическая травма не лишает жизнь ребенка явных преимуществ. Поэтому помощь родителям в репродукции в этих обстоятельствах не считается причинением неоправданных или ненужных страданий ребенку. [25] [26]
Преимплантационная генетическая диагностика обеспечивает метод пренатального различения пола еще до имплантации, и поэтому может быть названа преимплантационным различением пола . Возможные применения преимплантационного различения пола включают:
В случае семей с риском Х-сцепленных заболеваний пациентам предоставляется один анализ ПГД для определения пола. Выбор пола предлагает решение для лиц с Х-сцепленными заболеваниями, которые находятся в процессе зачатия. Выбор женского эмбриона потомства используется для предотвращения передачи Х-сцепленных менделевских рецессивных заболеваний. Такие Х-сцепленные менделевские заболевания включают мышечную дистрофию Дюшенна (МДД) и гемофилию А и В, которые редко встречаются у женщин, поскольку потомство вряд ли унаследует две копии рецессивного аллеля. Поскольку для передачи заболевания потомству женского пола требуются две копии мутантного аллеля X, в худшем случае женщины будут носителями заболевания, но не обязательно будут иметь доминантный ген этого заболевания. С другой стороны, мужчинам требуется только одна копия мутантного аллеля X для возникновения заболевания в их фенотипе, и поэтому у потомства мужского пола матери-носителя есть 50% вероятность заболеть. Причины могут включать редкость заболевания или то, что затронутые мужчины находятся в репродуктивном неблагоприятном положении. Поэтому часто применяется медицинское использование ПГД для отбора потомства женского пола с целью предотвращения передачи сцепленных с Х-хромосомой менделевских рецессивных заболеваний. Преимплантационная генетическая диагностика, применяемая для выбора пола, может использоваться для неменделевских заболеваний, которые значительно более распространены у одного пола. Три оценки проводятся до начала процесса ПГД для предотвращения этих наследственных заболеваний. Для того чтобы подтвердить использование ПГД, выбор пола основан на серьезности наследственного заболевания, соотношении рисков у обоих полов или вариантах лечения заболевания. [ необходима цитата ]
ПГД иногда использовалась для выбора эмбриона с определенным заболеванием или инвалидностью, например, глухотой, чтобы ребенок разделял эту характеристику с родителями. [29]
Потенциально спорное использование ПГД может возникнуть с генетическими тестами, нацеленными на немедицинские черты, такие как слух, сексуальная ориентация, рост, красота или интеллект. Некоторые тесты, такие как тесты на мутации GJB2, связанные с наследственной глухотой, могут привести к запросам на ПГД, чтобы избежать или отдать предпочтение этим чертам. Этические проблемы включают потенциальный вред затронутым сообществам, таким как глухие. Аналогичные вопросы возникнут с генетическим тестом на сексуальную ориентацию, вызывая опасения по поводу дискриминации. Некоторые настаивают на полном запрете выбора таких черт, опасаясь более серьезных последствий, таких как генная инженерия потомства. Однако окончательные суждения по этим вопросам не могут быть сделаны, пока такие тесты не станут ближе к практической реальности. [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36]
Мы различаем три типа преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) в зависимости от оцениваемых дефектов:
ПГД — это форма генетической диагностики, проводимой до имплантации. Это подразумевает, что ооциты пациента должны быть оплодотворены in vitro , а эмбрионы должны храниться в культуре до тех пор, пока не будет установлен диагноз. Также необходимо провести биопсию этих эмбрионов, чтобы получить материал для проведения диагностики. Сама диагностика может проводиться с использованием нескольких методов в зависимости от характера изучаемого состояния. Как правило, методы на основе ПЦР используются для моногенных нарушений, а FISH — для хромосомных аномалий и для определения пола в тех случаях, когда для Х-сцепленного заболевания недоступен протокол ПЦР. Эти методы необходимо адаптировать для выполнения на бластомерах и тщательно протестировать на одноклеточных моделях перед клиническим использованием. Наконец, после замены эмбрионов излишки качественных непораженных эмбрионов можно криоконсервировать, разморозить и перенести обратно в следующем цикле.
В настоящее время все эмбрионы ПГД получают с помощью вспомогательных репродуктивных технологий , хотя в прошлом предпринимались попытки использования естественных циклов и оплодотворения in vivo с последующим промыванием матки, а сейчас от них в значительной степени отказались. Чтобы получить большую группу ооцитов, пациенты проходят контролируемую стимуляцию яичников (COH). COH проводится либо по протоколу агониста, используя аналоги гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) для десенсибилизации гипофиза в сочетании с человеческими менопаузальными гонадотропинами (ЧМГ) или рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), либо по протоколу антагониста, используя рекомбинантный ФСГ в сочетании с антагонистом ГнРГ в соответствии с клинической оценкой профиля пациентки (возраст, индекс массы тела (ИМТ), эндокринные параметры). ХГЧ вводят, когда при трансвагинальном ультразвуковом сканировании видны по крайней мере три фолликула со средним диаметром более 17 мм [ требуется проверка ] . Трансвагинальное ультразвуковое извлечение ооцитов запланировано через 36 часов после введения ХГЧ. Дополнение лютеиновой фазы состоит из ежедневного интравагинального введения 600 мкг натурального микронизированного прогестерона.
Ооциты тщательно оголяются от кумулюсных клеток, так как эти клетки могут быть источником загрязнения во время ПГД, если используется технология на основе ПЦР. В большинстве описанных циклов вместо ЭКО используется интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ). Основные причины — предотвратить загрязнение остаточной спермой, прилипшей к zona pellucida, и избежать неожиданной неудачи оплодотворения. Процедура ИКСИ проводится на зрелых ооцитах метафазы II, а оплодотворение оценивается через 16–18 часов. Развитие эмбриона дополнительно оценивается каждый день до биопсии и до переноса в матку женщины. На стадии дробления оценка эмбриона проводится ежедневно на основе количества, размера, формы клеток и скорости фрагментации бластомеров. На 4-й день эмбрионы оценивались в зависимости от степени их уплотнения, а бластоцисты оценивались в соответствии с качеством трофэктодермы и внутренней клеточной массы, а также степенью их расширения.
Поскольку ПГД может проводиться на клетках с разных стадий развития, процедуры биопсии соответственно различаются. Теоретически биопсию можно проводить на всех стадиях доимплантации, но предложены только три: на неоплодотворенных и оплодотворенных ооцитах (для полярных телец, ПБ), на эмбрионах третьего дня дробления (для бластомеров) и на бластоцистах (для клеток трофэктодермы).
Процедура биопсии всегда включает два этапа: вскрытие zona pellucida и удаление клеток. Существуют различные подходы к обоим этапам, включая механические, химические и физические ( кислотный раствор Тироде ) и лазерную технологию для прорыва zona pellucida, экструзию или аспирацию для удаления ПБ и бластомеров, а также грыжеобразование клеток трофэктодермы.
Биопсия полярного тельца — это взятие пробы полярного тельца , представляющего собой небольшую гаплоидную клетку, которая формируется одновременно с яйцеклеткой во время оогенеза , но которая, как правило, не способна к оплодотворению . По сравнению с биопсией бластоцисты , биопсия полярного тельца может быть потенциально менее затратной, иметь меньше вредных побочных эффектов и быть более чувствительной при обнаружении аномалий. [38] Главное преимущество использования полярных телец в ПГД заключается в том, что они не являются необходимыми для успешного оплодотворения или нормального эмбрионального развития, что гарантирует отсутствие пагубного воздействия на эмбрион. Одним из недостатков биопсии полярного тельца является то, что она предоставляет информацию только о материнском вкладе в эмбрион, поэтому можно диагностировать случаи наследуемых по материнской линии аутосомно-доминантных и сцепленных с Х-хромосомой заболеваний, которые передаются исключительно по материнской линии, а аутосомно-рецессивные заболевания можно диагностировать лишь частично. Другим недостатком является повышенный риск диагностической ошибки, например, из-за деградации генетического материала или событий рекомбинации, которые приводят к гетерозиготным первым полярным тельцам.
Биопсия на стадии дробления обычно проводится утром третьего дня после оплодотворения, когда нормально развивающиеся эмбрионы достигают восьмиклеточной стадии. Биопсия обычно проводится на эмбрионах с менее чем 50% безъядерных фрагментов и на восьмиклеточной или более поздней стадии развития. В zona pellucida делается отверстие, и один или два бластомера, содержащие ядро, осторожно аспирируются или выдавливаются через отверстие. Главное преимущество биопсии на стадии дробления перед анализом PB заключается в том, что можно изучить генетический вклад обоих родителей. С другой стороны, обнаружено, что эмбрионы на стадии дробления имеют высокий уровень хромосомного мозаицизма , что ставит под сомнение, будут ли результаты, полученные на одном или двух бластомерах, репрезентативными для остальной части эмбриона. Именно по этой причине некоторые программы используют комбинацию биопсии PB и биопсии бластомеров. Кроме того, биопсия на стадии дробления, как и в случае биопсии ПБ, дает очень ограниченное количество ткани для диагностики, что требует разработки методов ПЦР отдельных клеток и FISH . Хотя теоретически биопсия ПБ и биопсия бластоцисты менее вредны, чем биопсия на стадии дробления, это по-прежнему распространенный метод. Он используется примерно в 94% циклов ПГД, о которых сообщается в Консорциуме ПГД ESHRE. Основные причины в том, что он позволяет проводить более безопасную и полную диагностику, чем биопсия ПБ, и все еще оставляет достаточно времени для завершения диагностики до того, как эмбрионы должны быть перемещены в матку пациентки, в отличие от биопсии бластоцисты. Из всех стадий дробления, как правило, считается, что оптимальным моментом для биопсии является стадия восьми клеток. Это диагностически безопаснее, чем биопсия ПБ, и, в отличие от биопсии бластоцисты, позволяет диагностировать эмбрионы до 5-го дня. На этой стадии клетки все еще тотипотентны, а эмбрионы еще не уплотняются. Хотя было показано, что до четверти человеческого эмбриона можно удалить, не нарушая его развития, все еще предстоит изучить, коррелирует ли биопсия одной или двух клеток со способностью эмбриона к дальнейшему развитию, имплантации и развитию доношенной беременности.
Не все методы вскрытия zona pellucida имеют одинаковый уровень успеха, поскольку на благополучие эмбриона и бластомера может повлиять процедура, используемая для биопсии. Zona Drilling с кислотным раствором Тироде (ZD) рассматривалось в сравнении с частичной диссекцией zona (PZD), чтобы определить, какая техника приведет к более успешной беременности и окажет меньшее влияние на эмбрион и/или бластомер. ZD использует пищеварительный фермент, такой как проназа, что делает его методом химического сверления. Химикаты, используемые в ZD, могут оказывать повреждающее воздействие на эмбрион. PZD использует стеклянную микроиглу для разрезания zona pellucida, что делает его методом механического рассечения, который обычно требует умелых рук для выполнения процедуры. В исследовании, включавшем 71 пару, ZD была выполнена в 26 циклах у 19 пар, а PZD была выполнена в 59 циклах у 52 пар. В анализе отдельных клеток показатель успешности составил 87,5% в группе PZD и 85,4% в группе ZD. Возраст матери, количество извлеченных ооцитов, частота оплодотворения и другие переменные не различались между группами ZD и PZD. Было обнаружено, что PZD привела к значительно более высокому показателю беременности (40,7% против 15,4%), продолжающейся беременности (35,6% против 11,5%) и имплантации (18,1% против 5,7%), чем ZD. Это говорит о том, что использование механического метода PZD при биопсии бластомеров для преимплантационной генетической диагностики может быть более эффективным, чем использование химического метода ZD. Успех PZD по сравнению с ZD можно объяснить тем, что химический агент в ZD оказывает вредное воздействие на эмбрион и/или бластомер. В настоящее время сверление zona с помощью лазера является преобладающим методом вскрытия zona pellucida. Использование лазера — более простая техника, чем использование механических или химических средств. Однако лазерное сверление может быть вредным для эмбриона, и его использование очень дорого для лабораторий экстракорпорального оплодотворения, особенно когда ПГД не является распространенным процессом в настоящее время. ПЗД может быть жизнеспособной альтернативой для решения этих проблем. [39]
В попытке преодолеть трудности, связанные с одноклеточными методами, было предложено проводить биопсию эмбрионов на стадии бластоцисты, что обеспечивает большее количество исходного материала для диагностики. Было показано, что если в одной пробирке с образцом присутствует более двух клеток, основные технические проблемы одноклеточной ПЦР или FISH практически исчезают. С другой стороны, как и в случае биопсии на стадии дробления, хромосомные различия между внутренней клеточной массой и трофэктодермой (TE) могут снизить точность диагностики, хотя сообщалось, что этот мозаицизм ниже, чем у эмбрионов на стадии дробления.
Биопсия ТЭ показала свою эффективность в животных моделях, таких как кролики [40] , мыши [41] и приматы. [42] Эти исследования показывают, что удаление некоторых клеток ТЭ не оказывает пагубного влияния на дальнейшее развитие эмбриона in vivo .
Биопсия человека на стадии бластоцисты для ПГД выполняется путем проделывания отверстия в ZP на третий день культивирования in vitro . Это позволяет развивающемуся TE выступать после бластуляции, облегчая биопсию. На пятый день после оплодотворения приблизительно пять клеток вырезаются из TE с помощью стеклянной иглы или лазерной энергии, оставляя эмбрион в значительной степени нетронутым и без потери внутренней клеточной массы. После диагностики эмбрионы можно заменить в том же цикле или криоконсервировать и перенести в последующий цикл.
У этого подхода есть два недостатка, обусловленные стадией, на которой он выполняется. Во-первых, только около половины преимплантационных эмбрионов достигают стадии бластоцисты. Это может ограничить количество бластоцист, доступных для биопсии, что в некоторых случаях ограничивает успех ПГД. МакАртур и соавторы [43] сообщают, что в 21% начатых циклов ПГД не было эмбрионов, подходящих для биопсии ТЕ. Эта цифра примерно в четыре раза превышает средний показатель, представленный в данных консорциума ПГД ESHRE, где преобладающими сообщаемыми методами являются биопсия ПП и стадия дробления. С другой стороны, отсрочка биопсии до этой поздней стадии развития ограничивает время для проведения генетической диагностики, что затрудняет повторное проведение второго раунда ПЦР или повторную гибридизацию зондов FISH перед тем, как эмбрионы должны быть перенесены обратно пациенту.
Отбор проб клеток кумулюса может быть выполнен в дополнение к отбору проб полярных телец или клеток из эмбриона. Из-за молекулярных взаимодействий между клетками кумулюса и ооцитом, профилирование экспрессии генов клеток кумулюса может быть выполнено для оценки качества ооцитов и эффективности протокола гиперстимуляции яичников , и может косвенно предсказать анеуплоидию , развитие эмбриона и исходы беременности. [44]
Традиционная биопсия эмбриона может быть инвазивной и дорогостоящей. Поэтому исследователи ведут постоянный поиск менее инвазивных методов предимплантационного генетического тестирования . Недавно были опубликованы исследования новых неинвазивных методов предимплантационного генетического скрининга, таких как бластоцельная жидкость и отработанная эмбриональная среда, в качестве альтернативы традиционным методам. [45]
Во время обычного процесса ЭКО хорошая практика витрификации эмбрионов увеличивает вероятность здоровой беременности. Во время процесса витрификации развитый бласт дегидратируется, и он вместе с его полостью бластоцеля разрушается для процесса замораживания. Существует много методов, которые использовались для облегчения разрушения, включая лазерный импульс, повторное микропипетирование , микроигольчатую пункцию или микроотсос. [46] Обычно эта жидкость затем выбрасывается, однако при предимплантационном генетическом тестировании BL эта жидкость сохраняется, а затем проверяется на ДНК. Считается, что эта ДНК происходит из клеток, которые прошли апоптоз, обнаруженных в развивающемся эмбрионе. [45]
Другой метод менее инвазивного предимплантационного генетического тестирования включает тестирование культуральной среды, в которой развивался эмбрион. Было отмечено, что эмбрион высвобождает фрагменты ДНК из клеток, которые погибли в течение инкубационного периода. Зная это, ученые пришли к выводу, что они могут выделить эту ДНК и использовать ее для предимплантационного генетического тестирования. [45]
Хотя существуют противоречивые данные о том, вредны ли для эмбриона более традиционные методы предимплантационного генетического тестирования, существуют новые методы менее инвазивного и столь же эффективного тестирования с использованием бластоцельной жидкости и отработанной эмбриональной среды. Две проблемы с этими альтернативами — это минимальное количество ДНК, с которым можно работать, и точность этой технологии. Обе эти проблемы были недавно рассмотрены Кузнецовым, который решил использовать оба метода, объединив количество ДНК, полученное с помощью обеих методик. После выделения ДНК ее использовали для предимплантационного генетического тестирования. Результаты показали, что при использовании обоих методов (бластоцистной жидкости и отработанной эмбриональной среды) в сочетании они показали уровень соответствия для всей хромосомной копии 87,5% по сравнению с трофэктодермой, 96,4% по сравнению со всей бластоцистой (золотой стандарт). Кроме того, после амплификации с использованием этого нового метода они смогли получить 25,0–54,0 нг/мкл ДНК на образец. С помощью традиционных методов, таких как трофэктодерм, они собрали от 10 до 44 нг/мкл. [45]
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) являются двумя наиболее часто используемыми технологиями первого поколения в ПГД. ПЦР обычно используется для диагностики моногенных нарушений, а FISH используется для обнаружения хромосомных аномалий (например, скрининг анеуплоидии или хромосомных транслокаций). За последние несколько лет различные достижения в тестировании ПГД позволили улучшить полноту и точность доступных результатов в зависимости от используемой технологии. [47] [48] Недавно был разработан метод, позволяющий фиксировать метафазные пластинки из отдельных бластомеров. Этот метод в сочетании с FISH, m-FISH может давать более надежные результаты, поскольку анализ проводится на целых метафазных пластинках [49]
Помимо FISH и ПЦР, в качестве метода предимплантационной генетической диагностики тестируется секвенирование генома отдельной клетки . [50] Это характеризует полную последовательность ДНК генома эмбриона.
FISH — наиболее часто применяемый метод определения хромосомного состава эмбриона. В отличие от кариотипирования , его можно использовать на интерфазных хромосомах, поэтому его можно использовать на образцах PB, бластомеров и TE. Клетки фиксируются на предметных стеклах микроскопа и гибридизуются с ДНК-зондами. Каждый из этих зондов специфичен для части хромосомы и помечен флуорохромом.
Двойной FISH считался эффективным методом определения пола человеческих эмбрионов до имплантации и дополнительной возможностью обнаружения аномальных количеств копий хромосом, что невозможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). [51]
В настоящее время доступна большая панель зондов для различных сегментов всех хромосом, но ограниченное число различных флуорохромов ограничивает количество сигналов, которые можно анализировать одновременно.
Тип и количество зондов, используемых в образце, зависят от показаний. Для определения пола (используется, например, когда протокол ПЦР для данного Х-сцепленного расстройства недоступен) зонды для хромосом X и Y применяются вместе с зондами для одной или нескольких аутосом в качестве внутреннего контроля FISH. Можно добавить больше зондов для проверки анеуплоидий , особенно тех, которые могут привести к жизнеспособной беременности (например, трисомия 21 ). Использование зондов для хромосом X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 и 22 имеет потенциал для обнаружения 70% анеуплоидий, обнаруженных при спонтанных абортах.
Для того чтобы иметь возможность проанализировать больше хромосом в одном образце, можно провести до трех последовательных раундов FISH. В случае перестроек хромосом необходимо выбрать определенные комбинации зондов, которые фланкируют интересующую область. Считается, что метод FISH имеет уровень ошибок 5–10%.
Основная проблема использования FISH для изучения хромосомного состава эмбрионов заключается в повышенной частоте мозаицизма, наблюдаемой на стадии предимплантации человека. Метаанализ более 800 эмбрионов показал, что приблизительно 75% предимплантационных эмбрионов являются мозаичными, из которых приблизительно 60% являются диплоидно-анеуплоидными мозаичными и приблизительно 15% анеуплоидными мозаичными. [52] Ли и его коллеги [53] обнаружили, что 40% эмбрионов, диагностированных как анеуплоидные на 3-й день, на 6-й день имели эуплоидную внутреннюю клеточную массу. Штессен и его коллеги обнаружили, что 17,5% эмбрионов, диагностированных как аномальные во время ПГС и подвергнутых повторному анализу после ПГД, также содержали нормальные клетки, а 8,4% были признаны в целом нормальными. [54] В результате возник вопрос, являются ли одна или две изученные клетки эмбриона фактически репрезентативными для всего эмбриона, и не отбраковываются ли жизнеспособные эмбрионы из-за ограничений метода. Тем не менее, мозаичные эмбрионы можно переносить, но только если нет доступных эуплоидов, предварительно проинформировав пациентов о рисках и желательно проведя пренатальную диагностику.
Кэри Маллис задумал ПЦР в 1985 году как упрощенное воспроизведение in vitro процесса репликации ДНК in vivo . Используя химические свойства ДНК и доступность термостабильных ДНК-полимераз , ПЦР позволяет обогащать образец ДНК для определенной последовательности. ПЦР дает возможность получить большое количество копий определенного участка генома, что делает возможным дальнейший анализ. Это высокочувствительная и специфичная технология, что делает ее пригодной для всех видов генетической диагностики, включая ПГД. В настоящее время существует множество различных вариаций самой ПЦР, а также различных методов для последующего анализа продуктов ПЦР.
При использовании ПЦР в ПГД мы сталкиваемся с проблемой, которая отсутствует в обычном генетическом анализе: ничтожно малые количества доступной геномной ДНК. Поскольку ПГД выполняется на отдельных клетках, ПЦР необходимо адаптировать и довести до ее физических пределов, а также использовать минимально возможное количество матрицы: одну нить. Это подразумевает длительный процесс тонкой настройки условий ПЦР и восприимчивость ко всем проблемам обычной ПЦР, но в несколько раз усиленным. Большое количество необходимых циклов ПЦР и ограниченное количество матрицы делают ПЦР на отдельных клетках очень чувствительной к загрязнению. Еще одной проблемой, характерной для ПЦР на отдельных клетках, является феномен выпадения аллелей (ADO). Он заключается в случайной неамплификации одного из аллелей, присутствующих в гетерозиготном образце. ADO серьезно подрывает надежность ПГД, поскольку гетерозиготный эмбрион может быть диагностирован как пораженный или непораженный в зависимости от того, какой аллель не сможет амплифицироваться. Это особенно актуально при ПГД аутосомно-доминантных заболеваний, когда АДО пораженного аллеля может привести к переносу пораженного эмбриона.
Было разработано несколько анализов на основе ПЦР для различных заболеваний, таких как гены триплетного повтора, связанные с миотонической дистрофией и ломкой Х-хромосомой в отдельных человеческих соматических клетках, гаметах и эмбрионах. [55]
Основная философия массового параллельного секвенирования, используемая в NGS, адаптирована из секвенирования дробовиком, разработанного для секвенирования более длинных участков ДНК. Технологии NGS считывают целевые шаблоны ДНК случайным образом. Целевая ДНК или весь геном разбивается на небольшие части, а затем эти части ДНК лигируются с назначенными адаптерами для случайного считывания во время [56] параллельного синтеза ДНК. Длина считывания соответствует фактическому числу непрерывно секвенированных оснований. Длина считывания намного короче, чем при секвенировании по Сэнгеру, поэтому результаты NGS называются короткими считываниями .
С 2014 года в PGT проводится секвенирование следующего поколения (NGS). [57] NGS — это группа методов, способных секвенировать большие объемы ДНК по разумной цене и времени. Это может дать нам общую перспективу полного генома эмбриона, включая митохондриальный . Эти методы основаны на секвенировании коротких прочтений около 400 оснований каждое и наложении этих прочтений с помощью мощного программного обеспечения для выравнивания.
Аналогично, NGS используется для обнаружения анеуплоидий в 24 хромосомах и дефектов одного гена, когда есть указание от родителей-носителей. Главное преимущество заключается в том, что NGS может сочетать обнаружение как анеуплоидий, так и моногенных заболеваний с одной биопсией и имеет сниженные доступные затраты, что делает его более доступным.
Двумя примерами NGS являются пиросеквенирование и обратимый краситель-терминатор .
Метод пиросеквенирования основан на принципе секвенирования путем синтеза и на обнаружении высвобожденного пирофосфата во время синтеза ДНК. Он использует серию из четырех ферментов для точного обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот во время синтеза. [58]
Циклы из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) по отдельности добавляются в реакционную смесь итеративно. Каскад начинается с реакции полимеризации нуклеиновой кислоты, в которой неорганический пирофосфат высвобождается в результате включения нуклеотида полимеразой. Каждое событие включения нуклеотида сопровождается высвобождением неорганического пирофосфата в количестве, эквимолярном количеству включенного нуклеотида. Высвобожденный пирофосфат количественно преобразуется в АТФ сульфурилазой АТФ в присутствии APS. Образованный АТФ запускает опосредованное люциферазой превращение люциферина в оксилюциферин, производя видимый свет в количествах, пропорциональных количеству АТФ. Во время этого процесса синтеза цепь ДНК удлиняется комплементарными нуклеотидами, а последовательность ДНК демонстрируется пирограммой на экране. Общая реакция от полимеризации до обнаружения света происходит в течение 3–4 секунд при комнатной температуре. АТФ-сульфурилаза преобразует пирофосфат в АТФ примерно за 1,5 секунды, а генерация света люциферазой происходит менее чем за 0,2 секунды.
Наряду с преимуществами, предлагаемыми этими технологиями, существует ряд проблем, как технических, так и этических, которые необходимо рассмотреть и решить до того, как технологии NGS выйдут на клиническую арену диагностики эмбрионов. Одним из ограничений будет интерпретация массивных данных последовательностей, полученных с помощью технологий NGS. Фоновые полиморфизмы необходимо отличать от потенциально болезнетворных мутаций и вариаций числа копий. Благодаря выборочному восстановлению и последующему секвенированию интересующих геномных локусов полученные данные и усилия по анализу могут быть значительно сокращены по сравнению с подходом секвенирования всего генома. [56]
Постановка диагноза в ПГД не всегда проста. Критерии, используемые для выбора эмбрионов для замены после результатов FISH или ПЦР, не одинаковы во всех центрах. В случае FISH в некоторых центрах заменяют только те эмбрионы, которые признаны хромосомно нормальными (то есть показывающими два сигнала для гоносом и проанализированных аутосом) после анализа одного или двух бластомеров, и при анализе двух бластомеров результаты должны совпадать. Другие центры утверждают, что эмбрионы, диагностированные как моносомные, могут быть перенесены, поскольку ложная моносомия (то есть потеря одного сигнала FISH в нормальной диплоидной клетке) является наиболее часто встречающейся ошибкой диагностики. В этих случаях нет риска анеуплоидной беременности, и нормальные диплоидные эмбрионы не теряются для переноса из-за ошибки FISH. Более того, было показано, что эмбрионы, диагностированные как моносомные на 3-й день (за исключением хромосом X и 21), никогда не развиваются в бластоцисту, что коррелирует с тем фактом, что эти моносомии никогда не наблюдаются при продолжающихся беременностях.
Диагностика и ошибочная диагностика при ПГД с использованием ПЦР были математически смоделированы в работах Навиди и Арнхейма, а также Льюиса и соавторов. [59] [60] Самым важным выводом этих публикаций является то, что для эффективной и точной диагностики эмбриона требуются два генотипа. Это может быть основано на связанном маркере и генотипах заболевания из одной клетки или на генотипах маркера/болезни двух клеток. Интересным аспектом, исследованным в этих работах, является подробное изучение всех возможных комбинаций аллелей, которые могут появиться в результатах ПЦР для конкретного эмбриона. Авторы указывают, что некоторые из генотипов, которые могут быть получены во время диагностики, могут не соответствовать ожидаемому образцу связанных маркерных генотипов, но все же обеспечивают достаточную уверенность в отношении незатронутого генотипа эмбриона. Хотя эти модели обнадёживают, они основаны на теоретической модели, и, как правило, диагноз устанавливается на более консервативной основе, стремясь избежать возможности ошибочной диагностики. Когда во время анализа клетки появляются неожиданные аллели, в зависимости от наблюдаемого генотипа считается, что либо была проанализирована аномальная клетка, либо произошло загрязнение, и что диагноз не может быть установлен. Случай, в котором аномалия анализируемой клетки может быть четко определена, это когда с помощью мультиплексной ПЦР для сцепленных маркеров в образце обнаруживаются только аллели одного из родителей. В этом случае клетку можно считать несущей моносомию по хромосоме, на которой расположены маркеры, или, возможно, гаплоидной. Появление одного аллеля, указывающего на затронутый генотип, считается достаточным для диагностики эмбриона как затронутого, и эмбрионы, у которых был диагностирован полностью непоражённый генотип, являются предпочтительными для замены. Хотя такая политика может привести к меньшему количеству здоровых эмбрионов, пригодных для переноса, она считается предпочтительнее возможности постановки неправильного диагноза.
Преимплантационное генетическое гаплотипирование (ПГГ) — это метод ПГД, при котором идентифицируется гаплотип генетических маркеров , имеющих статистические ассоциации с целевым заболеванием, а не мутация, вызывающая заболевание. [61]
После того, как панель ассоциированных генетических маркеров будет установлена для конкретного заболевания, ее можно использовать для всех носителей этого заболевания. [61] Напротив, поскольку даже моногенное заболевание может быть вызвано множеством различных мутаций в пораженном гене, обычные методы ПГД, основанные на поиске конкретной мутации, потребуют специфических для мутации тестов. Таким образом, ПГД расширяет доступность ПГД для случаев, когда специфические для мутации тесты недоступны.
PGH также имеет преимущество перед FISH в том, что FISH обычно не может провести различие между эмбрионами, обладающими сбалансированной формой хромосомной транслокации , и теми, которые несут гомологичные нормальные хромосомы. Эта неспособность может быть серьезно вредна для поставленного диагноза. PGH может провести различие, которое FISH часто не может. PGH делает это, используя полиморфные маркеры, которые лучше подходят для распознавания транслокаций. Эти полиморфные маркеры способны различать эмбрионы, несущие нормальные, сбалансированные и несбалансированные транслокации. FISH также требует большей фиксации клеток для анализа, тогда как PGH требует только переноса клеток в пробирки для полимеразной цепной реакции. Перенос клеток является более простым методом и оставляет меньше места для ошибок анализа. [62]
Перенос эмбрионов обычно осуществляется на третий или пятый день после оплодотворения, сроки зависят от методики, используемой для ПГД, и стандартных процедур центра ЭКО , где она проводится.
С введением в Европе политики переноса одного эмбриона, направленной на снижение частоты многоплодных беременностей после ВРТ, обычно один эмбрион или ранняя бластоциста переносится в матку. Уровень ХГЧ в сыворотке определяется на 12-й день. Если беременность установлена, проводится ультразвуковое исследование на 7-й неделе для подтверждения наличия сердцебиения плода. Парам обычно рекомендуют пройти ПНД из-за, хотя и низкого, риска неправильной диагностики.
Нередко после ПГД остается больше эмбрионов, пригодных для переноса обратно женщине, чем необходимо. Для пар, проходящих ПГД, эти эмбрионы очень ценны, поскольку текущий цикл пары может не привести к продолжающейся беременности. Криоконсервация эмбрионов и последующее размораживание и замена могут дать им второй шанс на беременность без необходимости повторного проведения громоздких и дорогостоящих процедур ВРТ и ПГД.
ПГД/ПГС — это инвазивная процедура, которая требует серьезного рассмотрения, по словам Майкла Такера, доктора философии, научного директора и главного эмбриолога Georgia Reproductive Specialists в Атланте. [63] По словам Серены Х. Чен, доктора медицины, репродуктивного эндокринолога из Нью-Джерси из IRMS Reproductive Medicine в Saint Barnabas, одним из рисков ПГД является повреждение эмбриона во время процедуры биопсии (что, в свою очередь, разрушает эмбрион в целом). [63] Другим риском является криоконсервация, когда эмбрион хранится в замороженном состоянии и позже размораживается для процедуры. Около 20% размороженных эмбрионов не выживают. [64] [65] Было проведено исследование, указывающее на то, что биопсированный эмбрион имеет меньшую вероятность выживания при криоконсервации. [66] Другое исследование предполагает, что ПГС с биопсией на стадии дробления приводит к значительно более низкому уровню живорождения у женщин пожилого материнского возраста. [19] Кроме того, другое исследование рекомендует соблюдать осторожность и проводить долгосрочное наблюдение, поскольку ПГД/ПГС увеличивает уровень перинатальной смертности при многоплодной беременности. [67]
В исследовании на мышиной модели ПГД связывали с различными долгосрочными рисками, включая увеличение веса и ухудшение памяти; протеомный анализ мозга взрослых мышей показал значительные различия между биопсийными и контрольными группами, многие из которых тесно связаны с нейродегенеративными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна. [68] [69]
ПГД подняла этические вопросы, хотя этот подход может снизить зависимость от фетального деселектирования во время беременности. Этот метод может быть использован для пренатального определения пола эмбриона и, таким образом, потенциально может быть использован для выбора эмбрионов одного пола в пользу другого в контексте « семейного балансирования ». [12] Использование ПГД для гендерного разнообразия было отмечено в Индии, где программа ЭКО в Бомбее теперь предоставляет ПГД для выбора потомства мужского пола в качестве второго ребенка пар, у которых уже была дочь. Из-за важности наследника мужского пола в Индии эти пары могли бы прибегнуть к аборту, если бы были беременны плодом женского пола (хотя это незаконно для этой цели). В этой обстановке ПГД для выбора пола для гендерного разнообразия, по-видимому, оправдана. Возможно, в будущем можно будет сделать другие выборы «социального отбора», которые привнесут социально-экономические проблемы. Только непораженные эмбрионы имплантируются в матку женщины; пораженные либо отбраковываются, либо передаются в науку. [70]
Возражения против ПГД, основанные на его влиянии на эмбрионы, воспроизводят дебаты по поводу абортов и статуса эмбриона, которые происходили во многих других контекстах, от абортов до исследований эмбриональных стволовых клеток. Люди, которые считают, что эмбрион или плод — это личность, будут возражать против создания и уничтожения эмбрионов и выступают против большинства применений ПГД. Другие считают, что преимплантационные эмбрионы слишком рудиментарны в развитии, чтобы иметь интересы или права, но что они заслуживают особого уважения как первая стадия на пути к новому человеку. [12]
ПГД имеет потенциал для скрининга генетических проблем, не связанных с медицинской необходимостью , таких как интеллект и красота, а также против отрицательных черт, таких как инвалидность. Медицинское сообщество расценило это как нелогичное и спорное предложение. [71] Перспектива « дизайнерского ребенка » тесно связана с техникой ПГД, создавая опасения, что увеличение частоты генетического скрининга приведет к современному евгеническому движению. [12] С другой стороны, предлагается принцип прокреативной благотворительности , который является предполагаемым моральным обязательством родителей , которые могут выбирать своих детей в пользу тех, кто, как ожидается, будет иметь лучшую жизнь. [72] Аргумент в пользу этого принципа заключается в том, что черты (такие как эмпатия, память и т. д.) являются «универсальными средствами» в том смысле, что они имеют инструментальную ценность в реализации любых жизненных планов, которые может иметь ребенок. [73] Уолтер Вайт утверждал, что нет никакой внутренней моральной разницы между «созданием» и «выбором» жизни, таким образом, делая евгенику естественным следствием принятия принципа репродуктивной благодати. [74]
В 2006 году три процента клиник ПГД в США сообщили о выборе эмбриона из-за наличия инвалидности. [75] Пары, вовлеченные в это, обвинялись в преднамеренном причинении вреда ребенку. Эта практика примечательна в случае карликовости, когда родители намеренно создают ребенка-карлика. [75] При выборе брата-спасителя для обеспечения соответствующей трансплантации костного мозга для уже существующего больного ребенка возникают проблемы, включая коммерциализацию и благополучие ребенка-донора. [76]
Опираясь на результат одной клетки из многоклеточного эмбриона, ПГД работает, предполагая, что эта клетка является репрезентативной для остальной части эмбриона. Это может быть не так, поскольку частота мозаицизма часто относительно высока. [77] Иногда ПГД может привести к ложноотрицательному результату, ведущему к принятию ненормального эмбриона, или к ложноположительному результату, ведущему к отмене отбора нормального эмбриона.
Другим проблемным случаем являются случаи желаемого неразглашения результатов ПГД для некоторых генетических нарушений, которые могут еще не быть очевидными у родителя, таких как болезнь Хантингтона . Она применяется, когда пациенты не хотят знать свой статус носителя, но хотят убедиться, что у них есть потомство, свободное от этого заболевания. Эта процедура может поставить практикующих врачей в сомнительные этические ситуации, например, когда нет здоровых, непораженных эмбрионов для переноса, и необходимо провести имитационный перенос, чтобы такие пациенты не заподозрили, что они являются носителями. Целевая группа по этике Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) в настоящее время рекомендует вместо этого использовать исключающее тестирование . Исключающее тестирование основано на анализе сцепления с полиморфными маркерами , в котором можно установить родительское и прародительское происхождение хромосом. Таким образом, заменяются только эмбрионы, которые не содержат хромосому, полученную от пораженного прародителя, избегая необходимости обнаружения самой мутации. [ необходима цитата ]
Из-за деликатности вопроса предимплантационная генетическая диагностика вызвала оживленные дебаты в академических кругах и за их пределами. [78]
Те, кто выступает против возможности отбраковки эмбриона, чтобы избежать риска инвалидности (например, возможного неблагоприятного отбора эмбрионов, которые могут развить «инвалидность», такую как глухота), утверждают, что если единственными двумя возможностями являются «существование и несуществование» («появление на свет» или «непоявление на свет»), предоставление им права появиться на свет лучше, чем альтернатива несуществования. [78]
Другой широко используемый аргумент в пользу отказа от преимплантационной генетической диагностики касается значения термина «инвалидность» (Bickenach & Chatterji, 2003). Медицинский язык описывает инвалидность как нечто, функциональность чего отклоняется от нормального функционирования. [79] Однако большая часть сообщества инвалидов подчеркивает, что инвалидность часто определяется тем, как общество структурирует мир . [80] Таким образом, понятия «нормальность» и «здоровье» относительны и зависят от времени, места и общества. Противники ПГД выступают против предотвращения рождения людей с инвалидностью с помощью преимплантационной генетической диагностики и что люди должны сначала определить, как определить, что такое инвалидность. [81]
В литературе выделяются три наиболее распространенных типа аргументов в пользу предимплантационной генетической диагностики. [78] Первый тип аргументов в основном выдвигается частью академических кругов, которые считают, что инвалидность или расстройство, вероятно, подразумевает снижение качества жизни для будущего ребенка. [82] Второй наиболее распространенный тип аргументов фокусируется в первую очередь на обязанностях родителей по отношению к человеческому процветанию индивидуума. Этот аргумент питается идеей, что родители обязаны и несут ответственность за обеспечение минимальных условий жизни для будущего ребенка. [82]
Последняя категория аргументов подчеркивает важность появления в мире людей с ограниченными возможностями и расстройствами с учетом того, какой вклад они могут внести в социально-экономический рост общества, предполагая, что эти люди не смогут внести вклад в улучшение статус-кво и благосостояния общества в целом. [78]
В Японии предимплантационное генетическое тестирование-моногенное (ПГТ-М) стало темой ожесточенных дебатов между людьми, страдающими генетическими заболеваниями, с одной стороны, и феминистскими группами и группами активистов по вопросам инвалидности, с другой. Как отмечает Кройдон, «потенциальные пациенты ПГТ-М, такие как люди репродуктивного возраста, затронутые инвалидностью, и их супруги... хотели воспользоваться этой технологией», но они столкнулись с противодействием со стороны «групп, выступающих за права женщин и людей с ограниченными возможностями, [которые] включают людей, которые рассматривают генетическое тестирование эмбрионов одним или всеми из следующих способов: 1) оно оказывает неоправданное давление на участвующих женщин, передавая им сообщение о том, что им разрешено размножаться, только если они производят на свет здоровое потомство; 2) оно усиливает существующие в обществе дискриминационные взгляды на людей с ограниченными возможностями; и 3) обход болезни посредством репродуктивного процесса снижает потребность научного сообщества в продолжении разработки методов лечения/излечения для людей, которые в настоящее время живут с инвалидностью». В конечном итоге использование ПГТ-М в Японии остается ограниченным и неофициально регулируется Японским обществом акушерства и гинекологии (JSOG). [83]
PGD допускает дискриминацию в отношении людей с интерсексуальными чертами. Джорджиан Дэвис утверждает, что такая дискриминация не учитывает, что многие люди с интерсексуальными чертами вели полноценную и счастливую жизнь. [84] Морган Карпентер подчеркивает появление нескольких интерсексуальных вариаций в списке Управления по оплодотворению и эмбриологии человека «серьезных» «генетических состояний», которые могут быть исключены в Великобритании, включая дефицит 5-альфа-редуктазы и синдром нечувствительности к андрогенам , черты, очевидные у элитных женщин-спортсменок и «первого в мире открыто интерсексуального мэра ». [85] Организация Intersex International Australia призвала Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям запретить такие вмешательства, отметив «тесную взаимосвязь интерсексуального статуса, гендерной идентичности и сексуальной ориентации в социальном понимании пола и гендерных норм, а также в медицинской и медицинской социологической литературе». [86]
В 2015 году Совет Европы опубликовал исследовательский доклад « Права человека и интерсекс-люди» , в котором отмечалось:
Право интерсекс-людей на жизнь может быть нарушено в результате дискриминационного «полового отбора» и «предимплантационной генетической диагностики, других форм тестирования и отбора по определенным характеристикам». Такой деселекционный или селективный аборт несовместим с этикой и стандартами прав человека из-за дискриминации, совершаемой в отношении интерсекс-людей на основе их половых характеристик. [87]
ПГД в сочетании с HLA (человеческий лейкоцитарный антиген) позволяет парам выбирать эмбрионы, которые не поражены генетическим заболеванием, в надежде спасти существующего, пораженного ребенка. «Спаситель» предположительно пожертвует спасающую жизнь ткань, совместимую с его/ее братом или сестрой. [88] Некоторые специалисты по этике утверждают, что «спасители», созданные в результате этой процедуры, будут рассматриваться как товар. [88] Еще один аргумент против выбора «спасителей» заключается в том, что это приводит к генетически модифицированным «дизайнерским младенцам». [89] Этот аргумент побуждает к дискуссии между моральным различием улучшения черт и предотвращения болезней. [90] Наконец, противники «спасителей» обеспокоены благополучием ребенка, в основном тем, что процедура нанесет ребенку эмоциональный и психологический вред. [88]
В настоящее время в Соединенных Штатах не существует никаких официальных правил или рекомендаций. [91] Этические решения относительно этой процедуры принимаются по усмотрению поставщиков медицинских услуг и их пациентов. [91] Напротив, использование ПГД в Великобритании регулируется Законом о человеческом оплодотворении и эмбриологии (HFEA), который требует, чтобы клиники, применяющие эту технику, получали лицензию и следовали строгим критериям. [91]
Некоторые религиозные организации не одобряют эту процедуру. Римско-католическая церковь, например, придерживается позиции, что она подразумевает уничтожение человеческой жизни. [92] и, кроме того, выступает против необходимости экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток как противоречащего аристотелевским принципам природы. [ необходима цитата ] Ортодоксальный иудаизм, напротив, поддерживает ПГД. [70]
Проведенный метаанализ показывает, что исследования, проведенные в ПГД, подчеркивают будущие исследования. Это связано с положительными результатами опроса отношения, послеродовыми контрольными исследованиями, не демонстрирующими существенных различий между теми, кто использовал ПГД, и теми, кто зачал естественным путем, и этнографическими исследованиями, которые подтвердили, что те, у кого в прошлом был негативный опыт, считали ПГД облегчением. Во-первых, в опросе отношения женщины с историей бесплодия, прерывания беременности и повторных выкидышей сообщили о более позитивном отношении к преимплантационной генетической диагностике. Они были более терпимы к проведению ПГД. Во-вторых, как и в первом исследовании отношения, этнографическое исследование, проведенное в 2004 году, дало схожие результаты. Пары с историей множественных выкидышей, бесплодия и больного ребенка считали, что преимплантационная генетическая диагностика была жизнеспособным вариантом. Они также чувствовали большее облегчение; «те, кто использовал эту технологию, были фактически мотивированы не повторять потерю беременности». [93] Подводя итог, можно сказать, что хотя некоторые из этих исследований ограничены из-за их ретроспективного характера и ограниченных выборок, результаты исследования указывают на общую удовлетворенность участников использованием ПГД. Однако авторы исследований указывают, что эти исследования подчеркивают необходимость будущих исследований, таких как создание перспективного дизайна с валидной психологической шкалой, необходимой для оценки уровней стресса и настроения во время переноса эмбриона и имплантации. [93]
До принятия Закона о вспомогательной репродукции человека (AHR) в 2004 году ПГД не регулировалась в Канаде. Закон запрещал выбор пола в немедицинских целях. [94]
Из-за сокращения национального бюджета в 2012 году AHR был упразднен. Затем регулирование вспомогательной репродукции было делегировано каждой провинции. [95] Это делегирование предоставляет провинциям большую свободу действий, чтобы они могли делать то, что им заблагорассудится. В результате, такие провинции, как Квебек, Альберта и Манитоба, внесли почти полную стоимость ЭКО в счет государственного здравоохранения. [96] Доктор Сантьяго Мунне, разработчик первого теста ПГД на синдром Дауна и основатель Reprogenetics, увидел в этих провинциальных решениях возможность для своей компании расти и открывать больше лабораторий Reprogenetics по всей Канаде. Он отклонил все споры относительно детей из каталога и заявил, что у него нет проблем с идеальными детьми. [96]
Однако в Онтарио нет конкретных правил относительно ПГД. С 2011 года Министерство детских и молодежных служб в Онтарио выступает за развитие финансируемого правительством образования в области «безопасной фертильности», мониторинга эмбрионов и вспомогательных репродуктивных услуг для всех жителей Онтарио. Этот правительственный отчет показывает, что в Онтарио не только существуют неопределенные правила относительно вспомогательных репродуктивных услуг, таких как ЭКО и ПГД, но и не финансируются ни одна из этих услуг. Все существующие репродуктивные клиники являются частными и расположены только в Брамптоне, Маркхэме, Миссиссоге, Скарборо, Торонто, Лондоне и Оттаве. [97] Напротив, в таких провинциях, как Альберта и Квебек, не только больше клиник, но и действуют подробные законы относительно вспомогательных репродуктивных услуг и государственного финансирования этих практик.
До 2010 года использование ПГД находилось в правовой серой зоне. [98] В 2010 году Федеральный суд Германии постановил, что ПГД может использоваться в исключительных случаях. [98] 7 июля 2011 года Бундестаг принял закон, разрешающий ПГД в определенных случаях. Процедура может использоваться только в том случае, если существует высокая вероятность того, что родители передадут генетическое заболевание, или когда существует высокая генетическая вероятность мертворождения или выкидыша. [99] 1 февраля 2013 года Бундесрат одобрил правило, регулирующее, как ПГД может использоваться на практике. [98]
В Венгрии ПГД разрешена в случае тяжелых наследственных заболеваний (когда генетический риск превышает 10%). Предимплантационная генетическая диагностика анеуплоидии (ПГС/ПГД-А) также является общепринятым методом. В настоящее время она рекомендуется в случае множественных выкидышей и/или нескольких неудачных попыток ЭКО и/или когда мать старше 35 лет. [100] Несмотря на то, что это одобренный метод, ПГД-А доступен только в одной клинике по лечению бесплодия в Венгрии. [101] [ нужен лучший источник ]
В Индии Министерство здравоохранения и благосостояния семьи регулирует эту концепцию в соответствии с Законом о методах преконцепции и пренатальной диагностики 1994 года . Закон был дополнительно пересмотрен после 1994 года, и необходимые поправки были внесены и своевременно обновлены на официальном веб-сайте индийского правительства, посвященном этому вопросу. [102] Использование ПГД для определения пола/выбора ребенка является незаконным в Индии. [103] [104]
С 2006 года клиники в Мексике легально предоставляли услуги ПГД. [105]
В Южной Африке, где право на репродуктивную свободу является конституционно защищенным правом, было предложено, чтобы государство могло ограничивать ПГД только в той степени, в которой родительский выбор может нанести вред будущему ребенку или в той степени, в которой родительский выбор усилит общественные предрассудки. [106]
Преимплантационная генетическая диагностика разрешена в Украине и с 1 ноября 2013 года регламентируется приказом Министерства здравоохранения Украины «Об утверждении Порядка применения вспомогательных репродуктивных технологий в Украине» от 09.09.2013 № 787. [107]
В Великобритании вспомогательные репродуктивные технологии регулируются Законом о человеческом оплодотворении и эмбриологии (HFE) 2008 года. Однако Закон HFE не затрагивает вопросы, связанные с ПГД. Таким образом, в 2003 году был создан Орган HFE (HFEA), который должен действовать как национальный регулирующий орган, выдающий лицензии и контролирующий клиники, предоставляющие ПГД. HFEA разрешает использование ПГД только в том случае, если соответствующая клиника имеет лицензию от HFEA, и устанавливает правила этого лицензирования в своем Кодексе практики. [108] Для каждой клиники и каждого медицинского состояния требуется отдельная заявка, в которой HFEA проверяет пригодность предлагаемого генетического теста, а также навыки персонала и возможности клиники. Только в этом случае ПГД может быть использована для пациента.
HFEA строго запрещает выбор пола по социальным или культурным причинам, но позволяет избегать расстройств, связанных с полом. Они заявляют, что PGD неприемлема для «социальных или психологических характеристик, нормальных физических вариаций или любых других состояний, которые не связаны с инвалидностью или серьезным заболеванием». Однако она доступна парам или лицам с известным семейным анамнезом серьезных генетических заболеваний. [109] Тем не менее, HFEA рассматривает интерсексуальные вариации как «серьезное генетическое заболевание», такое как дефицит 5-альфа-редуктазы , черта, связанная с некоторыми элитными спортсменками. [110] Сторонники интерсексуальности утверждают, что такие решения основаны на социальных нормах пола, гендера и культурных причинах. [111]
В Соединенных Штатах не существует единой системы регулирования вспомогательных репродуктивных технологий, включая генетическое тестирование. Практика и регулирование ПГД чаще всего подпадают под действие законов штатов или профессиональных руководств, поскольку федеральное правительство не имеет прямой юрисдикции над медицинской практикой. На сегодняшний день ни один штат не принял законов, напрямую относящихся к ПГД, поэтому исследователям и врачам приходится соблюдать руководящие принципы, установленные профессиональными ассоциациями. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) заявляют, что все клиники, предоставляющие ЭКО, должны ежегодно сообщать федеральному правительству о показателях успешности беременности, но отчетность об использовании и результатах ПГД не требуется. Профессиональные организации, такие как Американское общество репродуктивной медицины (ASRM), предоставили ограниченные рекомендации по этическому использованию ПГД. [112] Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) заявляет, что «ПГД следует рассматривать как устоявшуюся методику с конкретными и расширяющимися применениями для стандартной клинической практики». Они также заявляют: «Хотя использование ПГД с целью профилактики заболеваний, связанных с полом, является этичным, использование ПГД исключительно для выбора пола не рекомендуется» [113] .
В 2024 году Верховный суд Алабамы постановил в влиятельном деле, что замороженные эмбрионы в пробирках следует считать детьми, тем самым поднимая сложные правовые вопросы, имеющие последствия для репродуктивной медицины, выходящие далеко за рамки Алабамы. [114]
В Испании преимплантационная генетическая диагностика не допускается к проведению в открытом и доступном для всех порядке, чтобы избежать евгеники. Поэтому она легализована только в случаях высокого риска.
Для проведения преимплантационной генетической диагностики эмбриона необходимо выполнить три основных требования (за исключением исключений, разрешенных комитетами по биоэтике). Все три должны быть выполнены:
Любое заболевание, не отвечающее этим трем требованиям, должно пройти процедуру рассмотрения в Комитете по биоэтике и получить его одобрение до проведения ПГД.
Законодательство начало приниматься поздно, спустя десять лет после рождения в Соединенном Королевстве Луизы Браун , первого человека, зачатого с помощью ЭКО.
В исследовании 135 клиник ЭКО 88% имели веб-сайты, 70% упоминали ПГД, и 27% из последних были университетскими или больничными, а 63% были частными клиниками. Сайты, упоминающие ПГД, также упоминали использование и преимущества ПГД гораздо чаще, чем связанные с этим риски. Из сайтов, упоминающих ПГД, 76% описывали тестирование на заболевания одного гена, но только 35% упоминали риски пропуска целевых диагнозов, и только 18% упоминали риски потери эмбриона. 14% описывали ПГД как новый или спорный. Частные клиники чаще, чем другие программы, перечисляли определенные риски ПГД, такие как, например, диагностическая ошибка, или отмечали, что ПГД был новым или спорным, ссылались на источники информации о ПГД, предоставляли показатели точности генетического тестирования эмбрионов и предлагали выбор пола по социальным причинам. [115]