Конфокальная микроскопия , чаще всего конфокальная лазерная сканирующая микроскопия ( CLSM ) или лазерная сканирующая конфокальная микроскопия ( LSCM ), представляет собой метод оптической визуализации для увеличения оптического разрешения и контрастности микрофотографии посредством использования пространственного отверстия для блокировки нефокусного света. в формировании имиджа. [1] Захват нескольких двумерных изображений на разной глубине в образце позволяет реконструировать трехмерные структуры (процесс, известный как оптическое разрезание ) внутри объекта. Этот метод широко используется в научных и промышленных кругах, а типичными применениями являются науки о жизни , контроль полупроводников и материаловедение .
Свет проходит через образец под обычным микроскопом настолько глубоко, насколько это возможно, в то время как конфокальный микроскоп фокусирует только меньший луч света на одном узком уровне глубины за раз. CLSM обеспечивает контролируемую и сильно ограниченную глубину резкости.
Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Мински [2] и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных флуоресцентных микроскопов с широким полем зрения . [3] В обычном (т.е. широкоугольном) флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно освещается светом от источника света. Все части образца могут быть возбуждены одновременно, и возникающая в результате флуоресценция регистрируется фотодетектором или камерой микроскопа, включая большую несфокусированную фоновую часть. Напротив, конфокальный микроскоп использует точечное освещение (см. « Функция распространения точки» ) и точечное отверстие в оптически сопряженной плоскости перед детектором для устранения сигнала вне фокуса - название «конфокальный» происходит от этой конфигурации. Поскольку можно обнаружить только свет, создаваемый флуоресценцией очень близко к фокальной плоскости , оптическое разрешение изображения , особенно в направлении глубины образца, намного лучше, чем у широкоугольных микроскопов. Однако, поскольку большая часть света флуоресценции образца блокируется в точечном отверстии, такое повышенное разрешение достигается за счет снижения интенсивности сигнала, поэтому часто требуются длительные экспозиции . Чтобы компенсировать это падение сигнала после точечного отверстия , интенсивность света обнаруживается чувствительным детектором, обычно фотоумножителем (ФЭУ) или лавинным фотодиодом , преобразующим световой сигнал в электрический. [4]
Поскольку одновременно освещается только одна точка образца, двухмерное или трехмерное изображение требует сканирования обычного растра (т. е. прямоугольного рисунка из параллельных линий сканирования) в образце. Луч сканируется по образцу в горизонтальной плоскости с помощью одного или нескольких ( сервоуправляемых ) колеблющихся зеркал. Этот метод сканирования обычно имеет низкую задержку реакции , а скорость сканирования можно изменять. Более медленное сканирование обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум , что приводит к лучшей контрастности .
Достижимая толщина фокальной плоскости определяется главным образом длиной волны используемого света, разделенной на числовую апертуру объектива , а также оптическими свойствами образца. Возможность получения тонких оптических срезов делает эти типы микроскопов особенно эффективными при 3D-визуализации и профилировании поверхности образцов.
Последовательные срезы составляют «z-стек», который можно либо обработать для создания 3D-изображения, либо объединить в 2D-стек (преимущественно берется максимальная интенсивность пикселей, другие распространенные методы включают использование стандартного отклонения или суммирование пикселей). [1]
Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного, серийного оптического разделения неповрежденных, толстых, живых образцов с минимальной пробоподготовкой, а также незначительное улучшение латерального разрешения по сравнению с широкопольной микроскопией. [4] Биологические образцы часто обрабатывают флуоресцентными красителями, чтобы сделать выбранные объекты видимыми. Однако фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы свести к минимуму нарушение биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы. Кроме того, с помощью трансгенных методов можно создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные химерные молекулы (например, слияние GFP, зеленого флуоресцентного белка с интересующим белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (пятно, ограниченное дифракцией) и точечного обнаружения результирующего флуоресцентного сигнала. Отверстие в детекторе обеспечивает физический барьер, блокирующий флуоресценцию вне фокуса. Записывается только фокус, или центральное пятно диска Эйри .
В продаже имеются четыре типа конфокальных микроскопов:
В конфокальных лазерных сканирующих микроскопах используется несколько зеркал (обычно 2 или 3, сканирующих линейно вдоль осей X и Y) для сканирования лазером по образцу и «десканирования» изображения через фиксированное отверстие и детектор. Этот процесс обычно медленный и не работает для изображений в реальном времени, но может быть полезен для создания репрезентативных изображений фиксированных образцов с высоким разрешением.
Конфокальные микроскопы с вращающимся диском ( диск Нипкова ) используют серию движущихся отверстий на диске для сканирования световых пятен. Поскольку ряд точечных отверстий сканирует область параллельно, каждому точечному отверстию разрешено зависать над определенной областью в течение более длительного периода времени, тем самым уменьшая энергию возбуждения, необходимую для освещения образца, по сравнению с лазерными сканирующими микроскопами. Снижение энергии возбуждения снижает фототоксичность и фотообесцвечивание образца, что часто делает его предпочтительной системой для визуализации живых клеток или организмов.
Конфокальные микроскопы с улучшенными микролинзами или с двойным вращающимся диском работают по тем же принципам, что и конфокальные микроскопы с вращающимся диском, за исключением того, что второй вращающийся диск, содержащий микролинзы, помещается перед вращающимся диском, содержащим точечные отверстия. Каждому точечному отверстию соответствует соответствующая микролинза. Микролинзы улавливают широкую полосу света и фокусируют ее в каждом точечном отверстии, значительно увеличивая количество света, направляемого в каждое точечное отверстие, и уменьшая количество света, блокируемого вращающимся диском. Таким образом, конфокальные микроскопы с микролинзами значительно более чувствительны, чем стандартные системы с вращающимся диском. Yokogawa Electric изобрела эту технологию в 1992 году. [5]
В микроскопах с программируемой матрицей (PAM) используется пространственный модулятор света (SLM) с электронным управлением, который создает набор движущихся точечных отверстий. SLM — это устройство, содержащее массив пикселей с некоторыми свойствами ( непрозрачностью , отражательной способностью или оптическим вращением ) отдельных пикселей, которые можно регулировать электронным способом. SLM содержит микроэлектромеханические зеркала или жидкокристаллические компоненты. Изображение обычно получается камерой с зарядовой связью (CCD).
Каждый из этих классов конфокальных микроскопов имеет свои преимущества и недостатки. Большинство систем оптимизированы либо для скорости записи (т. е. захвата видео), либо для высокого пространственного разрешения. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы могут иметь программируемую плотность выборки и очень высокое разрешение, в то время как Nipkow и PAM используют фиксированную плотность выборки, определяемую разрешением камеры. Частота кадров изображения обычно ниже для систем одноточечного лазерного сканирования, чем для систем с вращающимся диском или PAM. Коммерческие конфокальные микроскопы с вращающимся диском достигают частоты кадров более 50 в секунду [6] – желательная функция для динамических наблюдений, таких как визуализация живых клеток.
На практике Нипков и PAM позволяют нескольким точечным отверстиям сканировать одну и ту же область параллельно [7] при условии, что точечные отверстия находятся достаточно далеко друг от друга.
Передовые разработки конфокальной лазерной сканирующей микроскопии теперь позволяют получать изображения со скоростью видеосъемки, превышающей стандартную (60 кадров в секунду), с использованием нескольких микроэлектромеханических сканирующих зеркал.
Конфокальная рентгеновская флуоресцентная визуализация — это новый метод, который позволяет контролировать глубину в дополнение к горизонтальному и вертикальному наведению, например, при анализе скрытых слоев на картине. [8]
CLSM — это метод сканирования изображений, полученное разрешение которого лучше всего объяснить путем сравнения его с другим методом сканирования, например, с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM). Преимущество CLSM заключается в том, что не требуется подвешивать датчик на расстоянии нанометра от поверхности, как, например, в AFM или STM , где изображение получается путем сканирования тонкой иглой по поверхности. Расстояние от объектива до поверхности (называемое рабочим расстоянием ) обычно сравнимо с расстоянием обычного оптического микроскопа. Оно зависит от оптической конструкции системы, но типичными являются рабочие расстояния от сотен микрометров до нескольких миллиметров.
В CLSM образец освещается точечным лазерным источником, и каждому элементу объема соответствует дискретная интенсивность рассеяния или флуоресценции. Здесь размер объема сканирования определяется размером пятна (близкого к дифракционному пределу) оптической системы, поскольку изображение сканирующего лазера представляет собой не бесконечно малую точку, а трехмерную дифракционную картину. Размер этой дифракционной картины и определяемый ею фокальный объем контролируются числовой апертурой объектива системы и длиной волны используемого лазера. Это можно рассматривать как классический предел разрешения обычных оптических микроскопов, использующих широкоугольное освещение. Однако с помощью конфокальной микроскопии можно даже улучшить предел разрешения методов широкопольного освещения, поскольку конфокальную апертуру можно закрыть, чтобы исключить более высокие порядки дифракционной картины . Например, если диаметр точечного отверстия установлен на 1 единицу Эйри , то только первый порядок дифракционной картины проходит через апертуру детектора, в то время как более высокие порядки блокируются, что улучшает разрешение за счет небольшого уменьшения яркости. При флуоресцентных наблюдениях предел разрешения конфокальной микроскопии часто ограничивается соотношением сигнал/шум, вызванным небольшим количеством фотонов, обычно доступных во флуоресцентной микроскопии. Компенсировать этот эффект можно применением более чувствительных фотоприемников или увеличением интенсивности освещающего точечного лазерного источника. Увеличение интенсивности лазерного освещения может привести к чрезмерному обесцвечиванию или другому повреждению интересующего образца, особенно для экспериментов, в которых требуется сравнение яркости флуоресценции. При визуализации тканей с дифференциальной рефракцией, таких как губчатый мезофилл листьев растений или других тканей, содержащих воздушное пространство, часто возникают сферические аберрации, ухудшающие качество конфокального изображения. Однако такие аберрации можно значительно уменьшить, помещая образцы в оптически прозрачные, нетоксичные перфторуглероды , такие как перфтордекалин , который легко проникает в ткани и имеет показатель преломления, почти идентичный показателю преломления воды. [9] При визуализации в геометрии отражения также можно обнаружить интерференцию отраженного и рассеянного света объекта, такого как внутриклеточная органелла. Интерферометрическая природа сигнала позволяет уменьшить диаметр точечного отверстия до 0,2 единиц Эйри и, следовательно, обеспечивает идеальное повышение разрешения на √2 без ущерба для соотношения сигнал/шум, как в конфокальной флуоресцентной микроскопии. [10]
CLSM широко используется в различных биологических дисциплинах, от клеточной биологии и генетики до микробиологии и биологии развития . [11] Он также используется в квантовой оптике, визуализации нанокристаллов и спектроскопии.
Клинически CLSM используется при оценке различных заболеваний глаз и особенно полезен для визуализации, качественного анализа и количественного определения эндотелиальных клеток роговицы . [12] Он используется для локализации и выявления присутствия нитевидных грибковых элементов в строме роговицы в случаях кератомикоза , что позволяет быстро поставить диагноз и, тем самым, на раннем этапе назначить окончательную терапию. Многообещающими также являются исследования методов CLSM для эндоскопических процедур ( эндомикроскопии ). [13] В фармацевтической промышленности было рекомендовано следить за процессом изготовления тонкопленочных лекарственных форм, чтобы контролировать качество и равномерность распределения лекарств. [14] Конфокальную микроскопию также используют для изучения биопленок — сложных пористых структур, которые являются предпочтительной средой обитания микроорганизмов. Некоторые временные и пространственные функции биопленок можно понять только путем изучения их структуры на микро- и мезо-масштабах. Исследование на микроуровне необходимо для выявления активности и организации одиночных микроорганизмов. [15]
CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых системах хранения 3D-оптических данных и помог определить возраст папируса Магдалины .
Система IRENE использует конфокальную микроскопию для оптического сканирования и восстановления поврежденных исторических аудиозаписей. [16]
Лазерные сканирующие конфокальные микроскопы используются для исследования поверхности микроструктурированных материалов, таких как кремниевые пластины, используемые при производстве солнечных элементов . На первых этапах обработки пластины подвергаются мокрому химическому травлению кислотными или щелочными соединениями, придающими текстуру их поверхности. Затем с помощью лазерной конфокальной микроскопии наблюдают за состоянием полученной поверхности на рычаге микрометра. Лазерную конфокальную микроскопию также можно использовать для анализа толщины и высоты пальцев металлизации, напечатанных на верхней части солнечных элементов.
Функция рассеяния точки точечного отверстия представляет собой эллипсоид, длина которого в несколько раз превышает его ширину. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Одним из методов решения этой проблемы является микроскопия 4Pi, при которой падающий и/или излучаемый свет может интерферировать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативный метод — конфокальная тета-микроскопия . В этом методе конус освещающего света и обнаруженный свет располагаются под углом друг к другу (наилучшие результаты, когда они перпендикулярны). Пересечение двух точечных функций распределения дает гораздо меньший эффективный объем выборки. В результате появился микроскоп с одноплоскостным освещением . Кроме того, можно использовать деконволюцию с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки для удаления не сфокусированного света, улучшая контраст как в осевой, так и в боковой плоскостях.
Существуют конфокальные варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как микроскопия истощения стимулированного излучения (STED). Помимо этого метода , доступен широкий спектр других (не конфокальных) методов сверхразрешения, таких как PALM, (d)STORM , SIM и так далее. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость специального оборудования, буферов или флуорофоров.
Для изображения образцов при низких температурах использовались два основных подхода, оба основанные на архитектуре лазерной сканирующей конфокальной микроскопии . Один из подходов заключается в использовании криостата непрерывного потока : только образец находится при низкой температуре и оптически обрабатывается через прозрачное окно. [17] Другой возможный подход — поместить часть оптики (особенно объектива микроскопа) в криогенный дьюар для хранения . [18] Этот второй подход, хотя и более громоздкий, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из-за окна.
Для изучения молекулярных взаимодействий с использованием CLSM можно использовать резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET), чтобы подтвердить, что два белка находятся на определенном расстоянии друг от друга.
.tif/lossless-page1-1280px-Mitotic_spindle_in_Arabidopsis_primary_root_meristem_cells_(anaphase).tif.png)
В 1940 году Ганс Гольдманн, офтальмолог из Берна , Швейцария, разработал систему щелевой лампы для документирования осмотров глаз. [19] Некоторые более поздние авторы считают эту систему первой конфокальной оптической системой. [20] [21]
В 1943 году Зюн Коана опубликовал конфокальную систему. [22] [20]
В 1951 году Хирото Наора, коллега Коана, описал в журнале Science конфокальный микроскоп для спектрофотометрии . [23]
Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Марвином Мински в 1955 году, а патент был подан в 1957 году. Сканирование точки освещения в фокальной плоскости достигалось за счет перемещения предметного столика. Никакой научной публикации представлено не было, и никаких изображений, сделанных с ее помощью, не сохранилось. [2] [24]
В 1960-х годах чехословацкий Моймир Петрань с медицинского факультета Карлова университета в Пльзене разработал тандемный сканирующий микроскоп, первый коммерческий конфокальный микроскоп. Он продавался небольшой компанией в Чехословакии и в США компанией Tracor-Northern (позже Noran) и использовал вращающийся диск Нипкова для создания множества точечных отверстий возбуждения и излучения. [21] [25]
Чехословацкий патент был подан в 1966 году Петраном и Миланом Хадравским, чехословацким коллегой. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученными с помощью этого микроскопа, была опубликована в журнале Science в 1967 году под авторством М. Дэвида Эггера из Йельского университета и Петрана. [26] В примечании к этой статье упоминается, что Петрань спроектировал микроскоп и руководил его конструкцией, а также что он частично был «научным сотрудником» в Йельском университете. Во второй публикации 1968 года описывалась теория и технические детали прибора, а дополнительными авторами были Хадравский и Роберт Галамбос , руководитель группы в Йельском университете. [27] В 1970 году был выдан патент США. Оно было подано в 1967 году. [28]
В 1969 и 1971 годах М. Дэвид Эггер и Пол Давидовиц из Йельского университета опубликовали две статьи, описывающие первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. [29] [30] Это был точечный сканер, то есть генерировалось только одно пятно освещения. Для наблюдения за нервной тканью использовалась микроскопия с отражением эпи-освещения. Гелий-неоновый лазер мощностью 5 мВт и длиной волны 633 нм отражался полупрозрачным зеркалом в сторону объектива. Объектив представлял собой простую линзу с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличие от всех более ранних и большинства более поздних систем, образец сканировался движением этой линзы (объективное сканирование), приводящим к перемещению точки фокуса. Отраженный свет возвращался к полупрозрачному зеркалу, прошедшая часть фокусировалась другой линзой на детектирующем отверстии, за которым располагался фотоумножитель. Сигнал визуализировался ЭЛТ осциллографа , катодный луч перемещался одновременно с объективом. Специальное устройство позволило сделать фотографии Polaroid , три из которых были показаны в публикации 1971 года.
Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований in vivo . Они цитируют патент Мински, благодарят Стива Баера, в то время аспиранта Медицинской школы Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке , где он разработал конфокальный линейный сканирующий микроскоп, [31] за предложение использовать лазер с «микроскопом Минского» и Благодарим Галамбоса, Хадравского и Петрана за обсуждения, приведшие к разработке их микроскопа. Мотивацией для их разработки было то, что в тандемном сканирующем микроскопе только часть 10 -7 света освещения участвует в формировании изображения в окуляре. Таким образом, качество изображения было недостаточным для большинства биологических исследований. [20] [32]
В 1977 году Колин Дж. Р. Шеппард и Амарджиоти Чоудхури из Оксфорда , Великобритания, опубликовали теоретический анализ конфокальных и лазерных сканирующих микроскопов. [33] Вероятно, это первая публикация, в которой используется термин «конфокальный микроскоп». [20] [32]
В 1978 году братья Кристоф Кремер и Томас Кремер опубликовали конструкцию конфокального лазерного сканирующего микроскопа, использующего флуоресцентное возбуждение с электронной автофокусировкой. Они также предложили лазерную подсветку точек с использованием «4π-точечной голограммы ». [32] [34] Эта конструкция CLSM впервые объединила метод лазерного сканирования с 3D-обнаружением биологических объектов, меченных флуоресцентными маркерами .
В 1978 и 1980 годах Оксфордская группа во главе с Колином Шеппардом и Тони Уилсоном описала конфокальный микроскоп с эпилазерной подсветкой, предметным сканированием и фотоумножителями в качестве детекторов. Стол мог перемещаться вдоль оптической оси (ось Z), позволяя делать оптические последовательные срезы. [32]
В 1979 году Фред Бракенхофф и его коллеги продемонстрировали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимы на практике. В 1985 году эта группа стала первой, кто опубликовал убедительные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа и способные ответить на биологические вопросы. [35] Вскоре после этого многие другие группы начали использовать конфокальную микроскопию для ответа на научные вопросы, которые до тех пор оставались загадкой из-за технологических ограничений.
В 1983 году И. Дж. Кокс и К. Шеппард из Оксфорда опубликовали первую работу, в которой конфокальный микроскоп управлялся компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, этапный сканер SOM-25, был предложен Oxford Optoelectronics (после нескольких поглощений, приобретенных BioRad), начиная с 1982 года. Он был основан на разработке Оксфордской группы. [21] [36]
В середине 1980-х годов Уильям Брэдшоу Амос и Джон Грэм Уайт и их коллеги, работавшие в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, построили первый сканирующий конфокальный лучевой микроскоп. [37] [38] Стол с образцом не двигался, вместо этого двигалось пятно освещения, что позволяло быстрее получать изображения: четыре изображения в секунду по 512 строк каждое. Чрезвычайно увеличенные промежуточные изображения благодаря длине пути луча 1–2 метра позволили использовать обычную ирисовую диафрагму в качестве «обскуры» диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были сделаны с длительной экспозицией на пленку до того, как была добавлена цифровая камера. Дальнейшее усовершенствование позволило впервые приблизиться к подготовке. Zeiss , Leitz и Cambridge Instruments не были заинтересованы в коммерческом производстве. [39] Совет медицинских исследований (MRC) наконец спонсировал разработку прототипа. Конструкция была приобретена компанией Bio-Rad , дополнена компьютерным управлением и коммерциализирована как «MRC 500». Преемник MRC 600 позже стал основой для разработки первого двухфотонного флуоресцентного микроскопа, разработанного в 1990 году в Корнельском университете . [35]
Примерно в то же время разработки в Королевском технологическом институте KTH в Стокгольме привели к созданию коммерческого CLSM, распространяемого шведской компанией Sarastro. [40] Предприятие было приобретено в 1990 году компанией Molecular Dynamics, [41] но в конечном итоге деятельность CLSM была прекращена. В Германии компания Heidelberg Instruments, основанная в 1984 году, разработала CLSM, который изначально предназначался для промышленного применения, а не для биологии. Этот инструмент был приобретен в 1990 году компанией Leica Lasertechnik . Zeiss уже имел на рынке неконфокальный лазерный сканирующий микроскоп с летающим пятном, который был модернизирован до конфокального. В отчете 1990 года [42] упоминались некоторые производители конфокальных линз: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern и Zeiss. [35]
В 1989 году Фриц Карл Прейкшат вместе со своим сыном Экхардом Прейкшатом изобрел сканирующий лазерный диодный микроскоп для анализа размеров частиц. [43] [44] и стал соучредителем Lasentec для его коммерциализации. В 2001 году компания Lasentec была приобретена Mettler Toledo . [45] Они используются в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля процесса кристаллизации на месте в крупных системах очистки.
В стандартных конфокальных инструментах второе или «выходное» отверстие используется для фильтрации излучаемого или рассеянного света. Традиционно это отверстие представляет собой пассивный компонент, который блокирует свет для его оптической фильтрации. Однако в новых разработках эту фильтрацию пытались выполнить в цифровом виде.
Недавние подходы заменили пассивную обскуру составным детекторным элементом. Обычно после цифровой обработки этот подход приводит к лучшему разрешению и фотонному бюджету, поскольку предел разрешения может приближаться к бесконечно маленькому точечному отверстию. [46]
Другие исследователи попытались в цифровом виде перефокусировать свет от точечного источника возбуждения, используя глубокие сверточные нейронные сети. [47]
{{cite journal}}: Отсутствует или пусто |title=( помощь ) Статья доступна на сайте журнала. PDF-файл с пометкой «P359 - 402» имеет размер 19 020 килобайт и содержит также соседние статьи из того же номера. На рисунке 1б статьи показана схема конфокального пути прохождения луча.