stringtranslate.com

Clostridioides difficile токсин А

СЭМ бактерий Clostridioides difficile
Ссылка PaLoc: штамм Clostridioides difficile 630, DSM 27543, номер доступа в GenBank генома AM180355. Позиции 770,154–789,973 п.н., общий размер локуса 19,8 кб.

Токсин Clostridioides difficile A ( TcdA ) — это токсин , вырабатываемый бактериями Clostridioides difficile , ранее известными как Clostridium difficile . [1] Он похож на токсин Clostridium difficile B. Токсины являются основными факторами вирулентности, вырабатываемыми грамположительными анаэробными [2] бактериями Clostridioides difficile . Токсины действуют, повреждая слизистую оболочку кишечника и вызывая симптомы инфекции C. difficile , включая псевдомембранозный колит .

TcdA — один из крупнейших известных бактериальных токсинов. С молекулярной массой 308 кДа его обычно описывают как мощный энтеротоксин , [3], но он также обладает некоторой активностью как цитотоксин . [4] Токсин действует, модифицируя белки ГТФазы клетки-хозяина путем глюкозилирования, что приводит к изменениям в клеточной активности. Факторы риска заражения C. difficile включают лечение антибиотиками, которое может нарушить нормальную кишечную микробиоту и привести к колонизации бактерий C. difficile . [5]

tcdAген

Ген содержит открытую рамку считывания (ORF) из 8133 нуклеотидов , кодирующих 2710 аминокислот . TcdA и TcdB разделяют 63% гомологии в своих аминокислотных последовательностях. [6] Эти гены экспрессируются во время поздней логарифмической фазы и стационарной фазы в ответ на факторы окружающей среды. Экологические стрессы, такие как антибиотики и катаболитная репрессия, могут влиять на экспрессию токсинов. [7]

Очаг патогенности

Гены tcdA и tcdB расположены на хромосоме Clostridioides difficile в локусе патогенности размером 19,6 кб (PaLoc), который обнаруживается только в токсигенных штаммах C. difficile . Нетоксигенные штаммы содержат фрагмент из 127 пар оснований, заменяющий PaLoc. [8] Этот локус также содержит три других дополнительных гена tcdC , tcdR и tcdE . [9] Экспрессия TcdC высока во время ранней экспоненциальной фазы и снижается по мере перехода роста в стационарную фазу , что согласуется с увеличением экспрессии tcdA и tcdB . Соответственно, паттерны экспрессии указали на tcdC как на возможный отрицательный регулятор продукции токсина. tcdR может служить положительным регулятором продукции токсина. [7] Предполагается, что tcdE облегчает высвобождение TcdA и TcdB посредством литической активности на мембране бактериальной клетки. Из-за его гомологии с другими белками со схожей функцией, а также расположения гена между tcdA и tcdB , предполагается, что tcdE будет функционировать как литический белок, который облегчает высвобождение, поскольку у TcdA и TcdB отсутствует сигнальный пептид для секреции . [8]

Структура

Белок содержит три домена. Амино N-концевой домен содержит активный сайт , отвечающий за гликозилирующую активность токсина. И TcdA, и TcdB используют этот высококонсервативный N-концевой регион (74% гомологии между обоими токсинами) для изменения идентичных субстратов . [7]

Карбоксильный C-концевой домен содержит повторяющиеся единицы, которые отвечают за связывание рецепторов на поверхности клеток-мишеней. Эти короткие гомологичные повторяющиеся единицы были названы комбинированными повторяющимися олигопептидами (CROP). [7] [10] Недавнее исследование показывает, что CROP определяют эффективность TcdA посредством взаимодействия со структурами на поверхности клетки. [11] Эти области CROP варьируются от 21 до 50 остатков и играют роль в связывании рецепторов. [7] Эта повторяющаяся область C-конца обозначена как иммунодоминантная область, поскольку связывание лиганда может быть заблокировано моноклональными антителами, специфичными для этой области. [12] [13] Эта область содержит наиболее гидрофильную часть молекулы. [10]

Расположенный в центре гидрофобный домен, содержащий кластер из 172 высококонсервативных гидрофобных аминокислот, считается важным для транслокации ферментативной части белка. [5] [6]

Механизм действия

TcdA должен быть интернализован в клетку-хозяина посредством эндоцитоза , чтобы получить доступ к цитозолю . Связывание рецептора является первым шагом, необходимым для проникновения в клетку посредством эндоцитоза в кислой эндосоме . [6] Низкий pH в эндосоме вызывает структурные изменения, такие как экспонирование гидрофобных доменов, которые имеют решающее значение для функции TcdA. [7] [14]

N-концевой домен TcdA функционирует для катализа реакции глюкотрансферазы, которая переносит молекулу глюкозы из UDP-глюкозы и ковалентно прикрепляет ее к консервативным аминокислотам в молекулах-мишенях. [6] Таким образом, TcdA катализирует глюкозилирование и последующую необратимую инактивацию молекул-мишеней в семействе Ras малых ГТФаз. [9] Эти молекулы-мишени включают RhoA , Rac и Cdc42 , которые являются регуляторными белками актинового цитоскелета эукариот и модуляторами многих различных сигнальных путей клеток. [7]

Внутриклеточные мишени

TcdA в первую очередь нацелен на Rho , Rac и Cdc42 . Эти молекулы являются важными регуляторами клеточной сигнализации. Малые ГТФазы, такие как Rho, Rac и Cdc42, регулируют свою активность, чередуя активное состояние, связанное с ГТФ , и неактивное состояние, связанное с ГДФ . [7] Факторы обмена гуанина (ГЭФ) регулируют обмен ГТФ и ГДФ . [15]

TcdA глюкозилирует RhoA , перенося молекулу глюкозы из UDP-глюкозы , нуклеотидного сахара, в Thr-37 RhoA GTPase. В Rac и Cdc42 остаток сахара переносится в Thr-35. Глюкозилирование препятствует правильному связыванию GTP и блокирует активацию. [7] TcdA действует преимущественно на GDP-связанную форму белков GTPase, поскольку эта конфигурация обнажает остаток треонина , который гликозилируется токсином. [5]

RhoA регулирует актиновый цитоскелет и формирует стрессовые волокна и фокальные адгезии . [16] Когда RhoA инактивируется через TcdA, его взаимодействие с нижестоящими эффекторами ингибируется. Это приводит к изменениям в актиновом цитоскелете, которые увеличивают проницаемость кишечного эпителия . Rac и Cdc42 участвуют в формировании филоподий, что имеет решающее значение для движения и миграции клеток. В целом, Rho , Rac и Cdc42 регулируют процессы в клетках, которые зависят от полимеризации актина. Многие из физиологических эффектов, которые клетки испытывают после воздействия TcdA, могут быть связаны с нарушением регуляции полимеризации актина и клеточных путей, контролируемых мишенями TcdA. [7]

Физиологические эффекты

Морфология клетки

Воздействие TcdA приводит к немедленным изменениям в морфологии клеток, включая потерю структурной целостности из-за уменьшения нитевидного актина ( F-актина ) и увеличение глобулярного актина . [17] Дезорганизация актиновых филаментов и цитоскелета приводит к повышенной проницаемости плотных контактов, что приводит к серьезному повреждению эпителиальных клеток и секреции жидкости. [18] [19] Накопление и секреция жидкости являются вторичными по отношению к повреждению слизистой оболочки, которое происходит после воздействия TcdA. Отчетливые изменения в системе микрофиламентов приводят к округлению клеток и гибели клеток. [17] Эти изменения являются результатом инактивации белков Rho , которые играют важную роль в регуляции плотных контактов . [7] [20]

Апоптоз

Апоптоз является наиболее вероятным механизмом, объясняющим гибель клеток, подвергшихся воздействию TcdA. Инактивация Rho может активировать каспазу-3 и каспазу-9 ; два ключевых компонента апоптотического пути. TcdA был связан с разрушением митохондриальной мембраны и высвобождением цитохрома C через активацию каспазы и инактивацию Rho , что дополнительно предполагает, что TcdA способен вызывать апоптоз. [21] [22]

Клиническое значение

Clostridioides difficileассоциированная диарея (CDAD)

Животные модели показали, что TcdA включает диарею, нейтрофильную инфильтрацию, воспаление слизистой оболочки кишечника и некроз эпителиальных клеток . Этот токсин считается основной причиной CDAD. [18] TcdA повреждает кончики кишечных ворсинок, что нарушает мембрану щеточной каймы , что приводит к эрозии клеток и утечке жидкости из поврежденной области. Это повреждение и связанная с ним реакция жидкости вызывают диарею, связанную с инфекцией Clostridioides difficile . [17]

Псевдомембранозный колит

TcdA может вызывать физиологические изменения, которые происходят при псевдомембранозном колите (ПМК), связанном с C. difficile , тяжелом изъязвлении толстой кишки. Повреждение слизистой оболочки толстой кишки токсином способствует накоплению фибрина , муцина и мертвых клеток, образуя слой детрита в толстой кишке (псевдомембраны), вызывая воспалительную реакцию . [5] Повреждение TcdA вызывает повышенную проницаемость эпителия, продукцию цитокинов и хемокинов , инфильтрацию нейтрофилов, продукцию активных форм кислорода (ROS), активацию тучных клеток и прямое повреждение слизистой оболочки кишечника. [23] Все это можно отнести к инактивации белков Rho GTPase, вызванной TcdA . [20] Потеря плотных соединений может обеспечить проникновение нейтрофилов в кишечник, что приводит к накоплению нейтрофилов; отличительный признак ПМК. TcdA-индуцированная продукция цитокинов IL-8 и других воспалительных медиаторов способствует стадиям воспаления, наблюдаемым в PMC. Инфильтрация нейтрофилами, макрофагами и тучными клетками в ответ на повреждение TcdA усиливает воспалительную реакцию за счет продукции и высвобождения других медиаторов, таких как фактор некроза опухоли альфа , IL-1 , IL-6 и другие монокины . Эти медиаторы вызывают дополнительное повреждение слизистой оболочки кишечника и еще больше усиливают воспалительную реакцию, влияя на персистенцию PMC. [24] Если происходит обширное повреждение стенки кишечника, бактерии могут попасть в кровоток и вызвать септический шок и смерть. [5]

Обнаружение и диагностика токсинов

TcdA и TcdB присутствуют в супернатантных жидкостях культур C. difficile и могут быть очищены из фильтратов. Оба токсина постоянно обнаруживаются в образцах кала людей и животных [25] и в настоящее время используются в качестве маркеров для диагностики инфекции C. difficile . [7] У более чем 90% пациентов, инфицированных C. difficile, была обнаружена цитотоксическая активность в их стуле. Глюкозилирование Rho ГТФаз инактивирует белки ГТФазы, что приводит к коллапсу цитоскелета, что приводит к округлению клеток. Был разработан анализ культуры тканей для обнаружения токсинов C. difficile в образцах стула. [17] Был разработан анализ округления клеток (анализ цитотоксичности) для диагностики инфекции C. difficile . [11] Иммуноферментные анализы (ИФА) использовались для обнаружения TcdA и TcdB с помощью специфических антител . При использовании с ИФА анализ цитотоксичности является «золотым стандартом» при использовании на клетках Vero для диагностики C. difficile . [11]

Значение TcdA и TcdB вC. трудныйинфекция

Начиная с 1980-х и начала 1990-х годов, роль TcdA и TcdB в инфекции C. difficile была предметом многочисленных споров. Предыдущие отчеты с очищенными токсинами показали, что одного TcdA было достаточно, чтобы вызвать симптомы инфекции, а TcdB не мог сделать этого, если не сочетался с TcdA. [7] Более поздний эксперимент показал, что TcdB, по сути, необходим для вирулентности . [26] Более ранние исследования установили, что TcdA строго является энтеротоксином , а TcdB — цитотоксином , но позже было обнаружено, что оба токсина имеют одинаковый механизм действия. [6] Чтобы полностью изучить роль обоих токсинов в патогенезе инфекции C. difficile , была разработана система нокаута генов в модели инфекции хомяка. Постоянное отключение tcdA , tcdB или обоих (двойной нокаут) показало, что C. difficile, продуцирующий один или оба токсина, способен проявлять цитотоксическую активность, и эта активность напрямую транслируется в вирулентность in vivo . Также было обнаружено, что двойной нокаут tcdAtcdB полностью ослабляет вирулентность . В целом, это исследование продемонстрировало важность как TcdA, так и TcdB в инфекции C. difficile , показав, что любой токсин способен проявлять цитотоксичность. [9]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Planche T, Aghaizu A, Holliman R, Riley P, Poloniecki J, Breathnach A, Krishna S (декабрь 2008 г.). «Диагностика инфекции Clostridium difficile с помощью наборов для обнаружения токсинов: систематический обзор». The Lancet Infectious Diseases . 8 (12): 777–84. doi :10.1016/S1473-3099(08)70233-0. PMID  18977696.
  2. ^ Эдвардс AN, Суарес JM, Макбрайд SM (сентябрь 2013 г.). «Культивирование и поддержание Clostridium difficile в анаэробной среде». Журнал визуализированных экспериментов (79): e50787. doi :10.3791/50787. PMC 3871928. PMID  24084491 . 
  3. ^ Peterson LR, Holter JJ, Shanholtzer CJ, Garrett CR, Gerding DN (август 1986 г.). «Обнаружение токсинов Clostridium difficile A (энтеротоксин) и B (цитотоксин) в клинических образцах. Оценка теста латексной агглютинации». American Journal of Clinical Pathology . 86 (2): 208–11. doi : 10.1093/ajcp/86.2.208 . PMID  3739972.
  4. ^ Tucker KD, Carrig PE, Wilkins TD (май 1990 г.). «Токсин А Clostridium difficile — мощный цитотоксин». Журнал клинической микробиологии . 28 (5): 869–71. doi :10.1128/JCM.28.5.869-871.1990. PMC 267826. PMID  2112562 . 
  5. ^ abcde Winkler ME, Wilson BJ, Salyers AA, Whitt DD (2010). Бактериальный патогенез: молекулярный подход . Metals Park, Ohio: ASM. ISBN 978-1-55581-418-2.
  6. ^ abcde Chaves-Olarte E, Weidmann M, Eichel-Streiber C, Thelestam M (октябрь 1997 г.). «Токсины A и B из Clostridium difficile различаются по ферментативной активности, клеточной субстратной специфичности и поверхностному связыванию с культивируемыми клетками». Journal of Clinical Investigation . 100 (7): 1734–41. doi :10.1172/JCI119698. PMC 508356 . PMID  9312171. 
  7. ^ abcdefghijklm Voth DE, Ballard JD (апрель 2005 г.). "Токсины Clostridium difficile: механизм действия и роль в заболевании". Clinical Microbiology Reviews . 18 (2): 247–63. doi :10.1128/CMR.18.2.247-263.2005. PMC 1082799. PMID  15831824 . 
  8. ^ ab Tan KS, Wee BY, Song KP (июль 2001 г.). «Доказательства холиновой функции гена tcdE в патогенности Clostridium difficile». J. Med. Microbiol . 50 (7): 613–9. doi : 10.1099/0022-1317-50-7-613 . PMID  11444771.
  9. ^ abc Kuehne SA, Cartman ST, Heap JT, Kelly ML, Cockayne A, Minton NP (октябрь 2010 г.). «Роль токсина A и токсина B в инфекции Clostridium difficile ». Nature . 467 (7316): 711–3. Bibcode :2010Natur.467..711K. doi :10.1038/nature09397. hdl : 10044/1/15560 . PMID  20844489. S2CID  4417414.
  10. ^ ab Dove CH, Wang SZ, Price SB, Phelps CJ, Lyerly DM, Wilkins TD, Johnson JL (февраль 1990 г.). «Молекулярная характеристика гена токсина A Clostridium difficile». Инфекция и иммунитет . 58 (2): 480–8. doi :10.1128/IAI.58.2.480-488.1990. PMC 258482. PMID  2105276 . 
  11. ^ abc Olling A, Goy S, Hoffmann F, Tatge H, Just I, Gerhard R (2011). «Повторяющиеся олигопептидные последовательности модулируют цитопатическую силу, но не имеют решающего значения для клеточного поглощения токсина A Clostridium difficile». PLOS ONE . ​​6 (3): e17623. Bibcode :2011PLoSO...617623O. doi : 10.1371/journal.pone.0017623 . PMC 3060812 . PMID  21445253. 
  12. ^ Салливан Н. М., Пеллетт С., Уилкинс Т. Д. (март 1982 г.). «Очистка и характеристика токсинов А и В Clostridium difficile». Инфекция и иммунитет . 35 (3): 1032–40. doi :10.1128/IAI.35.3.1032-1040.1982. PMC 351151. PMID 7068210  . 
  13. ^ фон Эйхель-Штрайбер С., Лауфенберг-Фельдманн Р., Сартинген С., Шульце Дж., Зауэрборн М. (май 1992 г.). «Сравнительный анализ последовательностей токсинов A и B Clostridium difficile ». Молекулярная генетика и геномика . 233 (1–2): 260–8. дои : 10.1007/bf00587587. PMID  1603068. S2CID  7052419.
  14. ^ Флорин И, Телестам М (декабрь 1983 г.). «Интернализация цитотоксина Clostridium difficile в культивируемые фибробласты легких человека». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research . 763 (4): 383–92. doi :10.1016/0167-4889(83)90100-3. PMID  6652117.
  15. ^ Zhou K, Wang Y, Gorski JL, Nomura N, Collard J, Bokoch GM (июль 1998). «Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов регулируют специфичность нисходящей сигнализации от Rac и Cdc42». Журнал биологической химии . 273 (27): 16782–6. doi : 10.1074/jbc.273.27.16782 . PMID  9642235.
  16. ^ Just I, Selzer J, von Eichel-Streiber C, Aktories K (март 1995). «Низкомолекулярный белок, связывающий ГТФ, Rho подвергается влиянию токсина А из Clostridium difficile». Journal of Clinical Investigation . 95 (3): 1026–31. doi :10.1172/JCI117747. PMC 441436 . PMID  7883950. 
  17. ^ abcd Lyerly DM, Krivan HC, Wilkins TD (январь 1988 г.). «Clostridium difficile: его болезнь и токсины». Clinical Microbiology Reviews . 1 (1): 1–18. doi :10.1128/cmr.1.1.1. PMC 358025. PMID  3144429 . 
  18. ^ ab Warny M, Vaerman JP, Avesani V, Delmée M (февраль 1994 г.). «Реакция антител человека на токсин A Clostridium difficile в связи с клиническим течением инфекции». Инфекция и иммунитет . 62 (2): 384–9. doi :10.1128/IAI.62.2.384-389.1994. PMC 186119. PMID  8300199 . 
  19. ^ Хехт Г, Потулакис К, Ламонт Дж. Т., Мадара Дж. Л. (ноябрь 1988 г.). «Токсин А Clostridium difficile нарушает структуру цитоскелета и проницаемость плотных контактов культивируемых человеческих кишечных эпителиальных монослоев». Журнал клинических исследований . 82 (5): 1516–24. doi :10.1172/JCI113760. PMC 442717. PMID  3141478. 
  20. ^ ab Nusrat A, Giry M, Turner JR, Colgan SP, Parkos CA, Carnes D, Lemichez E, Boquet P, Madara JL (ноябрь 1995 г.). «Rho-белок регулирует плотные контакты и периконтактную организацию актина в поляризованных эпителиях». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (23): 10629–33. Bibcode : 1995PNAS...9210629N. doi : 10.1073 /pnas.92.23.10629 . PMC 40665. PMID  7479854. 
  21. ^ Hippenstiel S, Schmeck B, N'Guessan PD, Seybold J, Krüll M, Preissner K, Eichel-Streiber CV, Suttorp N (октябрь 2002 г.). «Инактивация белка Rho индуцировала апоптоз культивируемых эндотелиальных клеток человека». American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology . 283 (4): L830–8. doi :10.1152/ajplung.00467.2001. PMID  12225960. S2CID  7033902.
  22. ^ Brito GA, Fujji J, Carneiro-Filho BA, Lima AA, Obrig T, Guerrant RL (ноябрь 2002 г.). «Механизм апоптоза, вызванного токсином А Clostridium difficile в клетках T84». Журнал инфекционных заболеваний . 186 (10): 1438–47. doi : 10.1086/344729 . PMID  12404159.
  23. ^ Kelly CP, Becker S, Linevsky JK, Joshi MA, O'Keane JC, Dickey BF, LaMont JT, Pothoulakis C (март 1994). «Рекрутирование нейтрофилов при энтерите Clostridium difficile toxin A у кроликов». Journal of Clinical Investigation . 93 (3): 1257–65. doi :10.1172/JCI117080. PMC 294078. PMID  7907603 . 
  24. ^ Flegel WA, Müller F, Däubener W, Fischer HG, Hadding U, Northoff H (октябрь 1991 г.). «Цитокиновый ответ человеческих моноцитов на токсины Clostridium difficile A и B». Инфекция и иммунитет . 59 (10): 3659–66. doi :10.1128/IAI.59.10.3659-3666.1991. PMC 258935. PMID  1910012 . 
  25. ^ Lima AA, Lyerly DM, Wilkins TD, Innes DJ, Guerrant RL (март 1988 г.). «Влияние токсинов Clostridium difficile A и B на тонкий и толстый кишечник кролика in vivo и на культивируемые клетки in vitro». Инфекция и иммунитет . 56 (3): 582–8. doi :10.1128/IAI.56.3.582-588.1988. PMC 259330. PMID  3343050 . 
  26. ^ Lyras D, O'Connor JR, Howarth PM, Sambol SP, Carter GP, Phumoonna T, Poon R, Adams V, Vedantam G, Johnson S, Gerding DN, Rood JI (апрель 2009 г.). «Токсин B необходим для вирулентности Clostridium difficile». Nature . 458 (7242): 1176–9. Bibcode :2009Natur.458.1176L. doi :10.1038/nature07822. PMC 2679968 . PMID  19252482.