Анализ изотопов, специфичных к положению , также называемый анализом изотопов, специфичных к месту , является разделом изотопного анализа, направленным на определение изотопного состава определенного положения атома в молекуле. Изотопы представляют собой элементарные варианты с различным числом нейтронов в ядрах, тем самым имеющие различные атомные массы. Изотопы встречаются в различных природных содержаниях в зависимости от элемента; их содержание в определенных соединениях может отличаться от случайного распределения (т. е. стохастического распределения) из-за условий окружающей среды, которые по-разному влияют на изменения массы. Эти различия в содержании называются «фракционированием», которое характеризуется с помощью анализа стабильных изотопов .
Содержание изотопов может варьироваться по всему субстрату (т. е. «объемная» вариация изотопов), определенным соединениям в субстрате (т. е. вариация изотопов, специфичная для соединения) или по позициям в определенных молекулах (т. е. вариация изотопов, специфичная для позиции). Содержание изотопов может быть измерено различными способами (например, масс-спектрометрией отношения изотопов , лазерной спектрометрией, ЯМР , ESI-MS ). Ранние анализы различались по технике, но обычно были ограничены их способностью измерять только средний изотопный состав по молекулам или образцам. Хотя это позволяет проводить изотопный анализ объемного субстрата, это исключает возможность различать вариации между различными участками одного и того же элемента в молекуле. Область биогеохимии позиционно-специфических изотопов изучает эти внутримолекулярные вариации, известные как обогащение «позиционно-специфическими изотопами» и «сайт-специфическими изотопами». Основное внимание уделяется позиционно-специфическому фракционированию изотопов во многих контекстах, разработке технологий для измерения этих фракционирований и применению позиционно-специфического изотопного обогащения к вопросам, связанным с биогеохимией , микробиологией , энзимологией , медицинской химией и историей Земли .
Позиционно-специфическое изотопное обогащение может сохранять критически важную информацию о синтезе и источнике атомов в молекуле. Действительно, объемный изотопный анализ усредняет сайт-специфические изотопные эффекты по всей молекуле, и поэтому, хотя все эти значения влияют на объемное значение, сигнатуры конкретных процессов могут быть разбавлены или неразличимы. Хотя теория позиционно-специфического изотопного анализа существует уже десятилетиями, [1] сейчас существуют новые технологии, позволяющие этим методам стать гораздо более распространенными. [2] Потенциальные приложения этого подхода широко распространены, такие как понимание метаболизма в биомолекулах, загрязняющих веществ в воздухе, механизмов неорганических реакций и т. д. Анализ сгруппированных изотопов , подмножество позиционно-специфического изотопного анализа, уже доказал свою полезность при характеристике источников метана , палеосреды, палеоальтиметрии и многих других приложений. Более конкретные исследования случаев позиционно-специфического изотопного фракционирования подробно описаны ниже.
Стабильные изотопы не распадаются, а массы тяжелых и легких изотопов влияют на то, как они распределяются в окружающей среде. Любое отклонение от случайного распределения легких и тяжелых изотопов в окружающей среде называется фракционированием, а последовательное фракционирование в результате определенного процесса или реакции называется «изотопными эффектами».
Изотопные эффекты — это повторяющиеся закономерности в распределении тяжелых и легких изотопов по различным химическим видам или соединениям или между атомными участками внутри молекулы. Эти изотопные эффекты могут возникать из почти бесконечного числа процессов, но большинство из них можно сузить до двух основных категорий, основанных на природе химической реакции, создающей или разрушающей интересующее соединение:
(1) Кинетические изотопные эффекты проявляются в необратимых реакциях , когда один изотополог предпочтителен в переходном состоянии из-за состояния с самой низкой энергией. Предпочтительный изотополог будет зависеть от того, является ли переходное состояние молекулы во время химической реакции более похожим на реагент или продукт. Нормальные изотопные эффекты определяются как те, которые разделяют более легкий изотоп на продукты реакции. Обратные изотопные эффекты встречаются реже, поскольку они предпочтительно разделяют более тяжелый изотоп на продукты.
(2) Равновесные изотопные эффекты проявляются в обратимых реакциях , когда молекулы могут свободно обмениваться, достигая минимально возможного энергетического состояния.
Эти изменения могут происходить на уровне, специфичном для соединений, но также и на уровне, специфичном для положения внутри молекулы. Например, карбоксильный участок аминокислот является заменяемым, и поэтому его изотопная сигнатура углерода может меняться со временем и может не отражать исходный источник углерода молекулы.
Химические реакции в биологических процессах контролируются ферментами , которые катализируют превращение субстрата в продукт. Поскольку ферменты могут изменять структуру переходного состояния для реакций, они также изменяют кинетические и равновесные изотопные эффекты. В контексте метаболизма выражение изотопных эффектов на биомолекулы дополнительно контролируется точками ветвления. Различные пути биосинтеза будут использовать различные ферменты, что даст ряд позиционно-специфических изотопных обогащений. Эта изменчивость позволяет позиционно-специфическим изотопным измерениям различать несколько биосинтетических путей из одного и того же метаболического продукта. [3] Биогеохимики используют позиционно-специфические изотопные обогащения из аминокислот , липидов и сахаров в природе для интерпретации относительной важности различных метаболизмов.
Позиционно-специфический изотопный эффект ферментативной реакции выражается как отношение констант скорости для моноизотопного субстрата и субстрата, замещенного одним редким изотопом. Например, фермент формиатдегидрогеназа катализирует реакцию формиата и НАД + в углекислый газ и НАДН. Водород формиата напрямую переносится на НАД+. Этот шаг имеет изотопный эффект, поскольку скорость переноса протия из формиата в НАД+ почти в три раза выше, чем скорость той же реакции с переносом дейтерия . Это также пример первичного изотопного эффекта. [4] Первичный изотопный эффект - это эффект, при котором редкий изотоп заменяется там, где связь разрывается или образуется. Вторичные изотопные эффекты возникают в других положениях молекулы и контролируются молекулярной геометрией переходного состояния. Они, как правило, считаются незначительными, но возникают в определенных случаях, особенно для изотопов водорода . [4]
В отличие от абиотических реакций, ферментативные реакции происходят через ряд этапов, включая связывание субстрата с ферментом, превращение субстрата в продукт и диссоциацию комплекса фермента с продуктом. Наблюдаемый изотопный эффект фермента будет контролироваться этапом, ограничивающим скорость, в этом механизме. Если этап, который превращает субстрат в продукт, является этапом, ограничивающим скорость, фермент проявит свой собственный изотопный эффект, эффект реакции образования или разрыва связи. [5]
Подобно биотическим молекулам, позиционно-специфическое изотопное обогащение в абиотических молекулах может отражать источник химических предшественников и пути синтеза. Энергия для абиотических реакций может поступать из многих различных источников, что повлияет на фракционирование. Например, металлические катализаторы могут ускорять абиотические реакции. Реакции могут замедляться или ускоряться различными условиями температуры и давления, что повлияет на константу равновесия или энергию активации обратимых и необратимых реакций соответственно.
Например, углерод в межзвездной среде и солнечной туманности разделяется на различные состояния на основе термодинамической выгоды. Измерение сайт-специфического изотопного обогащения углерода из органических молекул, извлеченных из углеродистых хондритов, может прояснить, откуда берется каждый атом углерода и как органические молекулы могут быть синтезированы абиотически. [6] В более широком смысле, эти изотопные обогащения могут предоставить информацию о физических процессах в регионе, где были образованы молекулярные предшественники, и где молекула образовалась в солнечной системе (т. е. нуклеосинтетическая гетерогенность, фракционирование, не зависящее от массы , самоэкранирование и т. д.).
Другим примером отдельных сайт-специфических фракционирований в абиотических молекулах является синтез типа Фишера-Тропша , который, как полагают, производит абиогенные углеводородные цепи. [6] Благодаря этому механизму реакции, сайт-обогащение углерода будет истощаться по мере увеличения длины углеродной цепи и будет отличаться от сайт-специфического обогащения углеводородов биологического происхождения.
Субстраты должны быть подготовлены и проанализированы определенным образом, чтобы прояснить сайт-специфическое изотопное обогащение. Это требует чистого отделения интересующего соединения от исходного образца, что может потребовать различных подготовительных химических реакций. После выделения позиционно-специфическое изотопное обогащение может быть проанализировано с помощью различных инструментов, каждый из которых имеет различные преимущества и обеспечивает различную степень точности .
Для измерения кинетических изотопных эффектов ферментативных реакций биохимики проводят эксперименты in vitro с ферментами и субстратами. Целью этих экспериментов является измерение разницы в скоростях ферментативных реакций для моноизотопного субстрата и субстрата с одним редким изотопом. [5] В этих экспериментах широко используются два метода: исследования внутренней конкуренции и эксперименты прямого сравнения. Оба метода измеряют изотопные эффекты, зависящие от положения.
Эксперименты по прямому сравнению в основном используются для измерения эффектов изотопов водорода / дейтерия в ферментативных реакциях. Моноизотопный субстрат и дейтерированная форма субстрата по отдельности подвергаются воздействию интересующего фермента в диапазоне концентраций. Кинетические параметры Михаэлиса-Ментен для обоих субстратов определяются, а позиционно-специфический изотопный эффект в месте дейтерирования выражается как отношение моноизотопной константы скорости к константе скорости редкого изотопа. [7]
Для изотопов таких элементов, как углерод и сера , разница в кинетических параметрах слишком мала, а точность измерения слишком низка, чтобы измерить изотопный эффект путем прямого сравнения скоростей моноизотопных и редких изотопных субстратов. Вместо этого они смешиваются вместе, используя естественное обилие стабильных изотопов в молекулах. Фермент подвергается воздействию обоих изотопов одновременно, и его предпочтение легкому изотопу анализируется путем сбора продукта реакции и измерения его изотопного состава. Например, если фермент удаляет углерод из молекулы, превращая его в диоксид углерода , этот продукт диоксида углерода можно собрать и измерить на масс-спектрометре изотопного отношения для его изотопного состава углерода . Если диоксид углерода содержит меньше 13 C, чем смесь субстратов, фермент предпочтительно прореагировал с субстратом, который имеет 12 C на участке, который декарбоксилирован . Таким образом, эксперименты с внутренней конкуренцией также являются позиционно-специфичными. Если измеряется только CO2 , то регистрируется только изотопный эффект на месте декарбоксилирования. [5]
До появления технологий, позволяющих анализировать целые молекулы на предмет их внутримолекулярной изотопной структуры, молекулы последовательно расщеплялись и преобразовывались в CO2 , а затем измерялись на масс-спектрометре с изотопным отношением I , выявляя позиционно-специфическое обогащение 13C .
В 1961 году Абельсон и Хоеринг разработали метод удаления карбоновой кислоты из аминокислот с помощью реакции нингидрина . Эта реакция преобразует карбоновую кислоту в молекулу CO2 , которая измеряется с помощью масс-спектрометра изотопного отношения. [1]
Липиды представляют особый интерес для геохимиков стабильных изотопов , поскольку они сохраняются в горных породах в течение миллионов лет. Монсон и Хейс использовали озонолиз для характеристики позиционно-специфического изотопного содержания ненасыщенных жирных кислот , превращая различные позиции углерода в диоксид углерода. Используя эту технику, они напрямую измерили изотопный рисунок в жирных кислотах, который был предсказан в течение многих лет. [8]
В некоторых случаях необходимо будет добавить дополнительные функциональные группы к молекулам для облегчения других методов разделения и анализа. Дериватизация может изменить свойства аналита; например, она сделает полярное и нелетучее соединение неполярным и более летучим, что будет необходимо для анализа в определенных типах хроматографии . Однако важно отметить, что дериватизация не идеальна для сайт-специфических анализов, поскольку она добавляет дополнительные элементы, которые необходимо учитывать при анализе.
Хроматография облегчает разделение отдельных молекул в смеси на основе их соответствующих химических свойств и того, как эти свойства взаимодействуют с субстратом, покрывающим хроматографическую колонку. Это разделение может происходить «онлайн», во время самого измерения или до измерений для выделения чистого соединения. Газовая и жидкостная хроматография имеют определенные преимущества в зависимости от интересующих молекул. Например, растворимые в воде молекулы легче разделяются с помощью жидкостной хроматографии, в то время как летучие неполярные молекулы, такие как пропан или этан, разделяются с помощью газовой хроматографии.
Для проведения позиционно-специфического изотопного анализа можно использовать множество различных инструментов, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Многие из них требуют сравнения интересующего образца со стандартом известного изотопного состава; фракционирование внутри инструмента и изменение инструментальных условий с течением времени могут повлиять на точность отдельных измерений, если они не стандартизированы.
Первоначальные измерения обогащения изотопами, специфичными для позиции, были измерены с помощью масс -спектрометрии изотопного отношения , в которой участки на молекуле сначала были разложены до CO2 , CO2 был захвачен и очищен, а затем CO2 был измерен для его изотопного состава на масс-спектрометре изотопного отношения (IRMS). Py-GC-MS также использовался в этих экспериментах для дальнейшего разложения молекул и характеристики их внутримолекулярного изотопного распределения. [1] Как GC-MS, так и LC-MS способны характеризовать обогащение изотопами, специфичными для позиции, в изотопно- меченых молекулах . В этих молекулах 13C настолько распространен, что его можно увидеть на масс-спектрометре с низкой чувствительностью. Разрешение этих приборов позволяет различать две молекулы с разницей в 1 Дальтон в их молекулярных массах; однако эта разница может возникнуть из-за добавления многих редких изотопов ( 17O , 13C , 2H и т. д.). По этой причине масс-спектрометры, использующие квадруполи или методы детектирования по времени пролета, не могут быть использованы для измерения позиционно-специфического обогащения при естественной распространенности .
Лазерная спектроскопия может использоваться для измерения изотопного обогащения газов в окружающей среде. Лазерная спектроскопия использует преимущества различных частот колебаний изотопологов, которые заставляют их поглощать различные длины волн света. Пропускание света через газообразный образец при контролируемой температуре может быть количественно преобразовано в утверждение об изотопном составе. Для N2O эти измерения могут определять позиционное изотопное обогащение ( 15 N. [9] Эти измерения выполняются быстро и могут достигать относительно хорошей точности (1-10 промилле ). Он используется для характеристики потоков газов окружающей среды и воздействия на эти потоки . [10] Этот метод ограничен измерением и характеристикой газов.
Ядерный магнитный резонанс наблюдает небольшие различия в молекулярных реакциях на осциллирующие магнитные поля . Он способен характеризовать атомы с активными нуклидами, которые имеют ненулевой ядерный спин (например, 13 C, 1 H, 17 O 35 Cl, 15 N, 37 Cl), что делает его особенно полезным для идентификации определенных изотопов. В типичном протонном или 13C ЯМР химические сдвиги атомов протия (1H) и углерода-13 внутри молекулы измеряются соответственно, поскольку они возбуждаются магнитным полем, а затем релаксируют с диагностической резонансной частотой. При сайт-специфическом естественном фракционировании изотопов ( SNIF ) ЯМР релаксационные резонансы атомов дейтерия и 13C. [11] ЯМР не обладает чувствительностью для обнаружения изотопологов с несколькими редкими изотопами. Единственные пики, которые появляются в спектрах SNIF-ЯМР, — это пики изотопологов с одним редким изотопом. Поскольку прибор измеряет только резонансы редких изотопов, каждый изотополог будет иметь один пик. Например, молекула с шестью химически уникальными атомами углерода будет иметь шесть пиков в спектре 13C SNIF ЯМР. Место замещения 13C можно определить по химическому сдвигу каждого из пиков. В результате ЯМР способен идентифицировать сайт-специфическое изотопное обогащение внутри молекул. [11] [12]
Orbitrap — это масс-спектрометр с преобразованием Фурье высокого разрешения , который недавно был адаптирован для проведения анализов, специфичных для конкретного участка. [2] Молекулы , вводимые в Orbitrap, фрагментируются , ускоряются и анализируются. Поскольку Orbitrap характеризует молекулярные массы , измеряя колебания на радиочастотах , он способен достигать очень высокого уровня точности в зависимости от метода измерения (т. е. до 0,1 промилле для длительного времени интеграции). Он значительно быстрее, чем измерения изотопов, специфичных для конкретного участка, которые могут быть выполнены с помощью ЯМР , и может измерять молекулы с различными редкими изотопами, но с одинаковой номинальной массой при естественном содержании (в отличие от ГХ и ЖХМС). Он также широко обобщается на молекулы, которые могут быть введены через газ или жидкий растворитель. [2] Разрешение Orbitrap таково, что номинальные изобары (например, обогащение 2 H против 15 N против 13 C ) можно отличить друг от друга, и поэтому молекулы не нужно преобразовывать в однородный субстрат для облегчения изотопного анализа. Как и другие изотопные измерения, измерения обогащения участков на орбитальной ловушке следует сравнивать со стандартом известного состава. [2]
Чтобы проиллюстрировать полезность позиционно-специфического изотопного обогащения, ниже описаны несколько тематических исследований, в которых ученые использовали позиционно-специфический изотопный анализ для ответа на важные вопросы о биохимии, загрязнении и климате.
Фосфоенолпируваткарбоксилаза (PEPC) — это фермент, который объединяет бикарбонат и фосфоенолпируват (PEP) для образования четырехуглеродной кислоты, оксалоацетата . Это важный фермент в фотосинтезе C4 и анаплеротических путях. [13] Он также отвечает за позиционно-специфическое обогащение оксалоацетата из-за равновесного изотопного эффекта преобразования линейной молекулы CO2 в тригональную плоскую молекулу HCO3- , которая разделяет 13C на бикарбонат. [14] Внутри фермента PEPC H12CO3- реагирует в 1,0022 раза быстрее, чем H13CO3- , так что PEPC имеет 0,22%-ный кинетический изотопный эффект. [15] Этого недостаточно, чтобы компенсировать обогащение 13C в бикарбонате . Таким образом, оксалоацетат остается с углеродом, обогащенным 13 C, в позиции C4. Однако сайт C1 испытывает небольшой обратный вторичный изотопный эффект из-за его связывающей среды в переходном состоянии , оставляя сайт C1 оксалоацетата обогащенным 13 C. [16] Таким образом, PEPC одновременно разделяет 12 C в сайт C4 и 13 C в сайт C1 оксалоацетата, что является примером множественных позиционно-специфических изотопных эффектов.
Первая статья о сайт-специфическом обогащении использовала реакцию нингидрина для отщепления карбоксильного участка от альфа-аминокислот в фотосинтезирующих организмах. [1] Авторы продемонстрировали обогащенный карбоксильный участок относительно основной δ 13 C молекул, что они приписывают поглощению более тяжелого CO 2 через цикл Кальвина . [1] Недавнее исследование применило похожую теорию для понимания обогащения метионином, что, как они предположили, будет иметь большое значение в исследованиях происхождения и синтеза. [17]
В 2012 году группа ученых использовала ЯМР- спектроскопию для измерения всех позиционно-специфических изотопных содержаний углерода в глюкозе и других сахарах. Было показано, что изотопные содержания неоднородны . Различные части молекул сахара используются для биосинтеза на основе метаболического пути, используемого организмом. [12] Поэтому любые интерпретации позиционно-специфических изотопов молекул ниже по потоку от глюкозы должны учитывать эту внутримолекулярную неоднородность.
Глюкоза — мономер целлюлозы, полимера, который делает растения и деревья жесткими. После появления позиционно-специфических анализов глюкозы биогеохимики из Швеции изучили концентрические годичные кольца Pinus nigra , которые регистрировали годовой прирост в период с 1961 по 1995 год. Они расщепили целлюлозу до ее глюкозных единиц и использовали ЯМР-спектроскопию для анализа ее внутримолекулярных изотопных моделей. Они обнаружили корреляции с позиционно-специфическими изотопными обогащениями, которые не были очевидны при целомолекулярном углеродном изотопном анализе глюкозы. Измеряя позиционно-специфические обогащения в 6-углеродной молекуле глюкозы, они собрали в шесть раз больше информации из того же образца. [18]
Биосинтез жирных кислот начинается с предшественников ацетил-КоА , которые объединяются для создания липидов с длинной прямой цепью. Ацетил- КоА вырабатывается в аэробных организмах пируватдегидрогеназой , ферментом, который, как было показано, выражает большой, 2,3% изотопный эффект на участке C2 пирувата и небольшое фракционирование на участке C3. [19] Они становятся нечетными и четными позициями углерода жирных кислот соответственно и теоретически должны были бы привести к картине истощения и обогащения 13C в нечетных и четных позициях соответственно. В 1982 году Монсон и Хейс разработали технологию для измерения позиционно-специфического содержания изотопов углерода в жирных кислотах. Их эксперименты на Escherichia coli выявили предсказанное относительное обогащение 13C в нечетных углеродных позициях. [20] Однако эта картина не была обнаружена в Saccharomyces cerevisiae , которые питались глюкозой. Вместо этого его жирные кислоты были обогащены 13 C в нечетных позициях. [8] Это было интерпретировано либо как продукт изотопных эффектов во время деградации жирных кислот , либо как внутримолекулярная изотопная гетерогенность глюкозы, которая в конечном итоге отражается в позиционно-специфических моделях жирных кислот. [21]
Изотопное обогащение N 2 O в зависимости от местоположения измеряется в окружающей среде, чтобы помочь разделить микробные источники и стоки в окружающей среде. Различные изотопологи N2O поглощают свет на разных длинах волн. Лазерная спектроскопия преобразует эти различия, сканируя по длинам волн, чтобы измерить распространенность 14 N- 15 N- 16 O против 15 N- 14 N- 16 O, различие, которое невозможно на других приборах. Эти измерения достигли очень высокой точности, вплоть до 0,2 промилле. [10]
Изотопы, специфичные для позиции, могут использоваться для отслеживания загрязняющих веществ в окружающей среде в локальном и глобальном масштабе. [22] Это особенно полезно, поскольку тяжелые изотопы часто используются для синтеза химикатов, а затем попадают в природную среду посредством биодеградации . Таким образом, отслеживание изотопов, специфичных для позиции, в окружающей среде может помочь отслеживать перемещение этих загрязняющих веществ и химических продуктов.
Эти тематические исследования представляют некоторые потенциальные приложения для анализа изотопов, специфичных для позиции, но, конечно, не все. Возможности для образцов для измерения и процессов для характеристики практически безграничны, и новые методологические разработки помогут сделать эти измерения возможными в будущем.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )