Белок С , также известный как аутопротромбин IIA и фактор свертывания крови XIV , [5] :6822 [6] представляет собой зимоген , то есть неактивный фермент. Активированная форма играет важную роль в регулировании антикоагуляции , воспаления и гибели клеток , а также в поддержании проницаемости стенок кровеносных сосудов у людей и других животных. Активированный белок C ( APC ) выполняет эти операции главным образом путем протеолитической инактивации белков Фактор Va и Фактор VIIIa . APC классифицируется как сериновая протеаза, поскольку она содержит остаток серина в своем активном центре . [7] : 35 У человека белок С кодируется геном PROC , который находится на хромосоме 2 . [8]
Зимогенная форма протеина С — витамин К -зависимый гликопротеин , циркулирующий в плазме крови . Его структура представляет собой двухцепочечный полипептид, состоящий из легкой цепи и тяжелой цепи, соединенных дисульфидной связью . [8] : 4673 Зимоген белка C активируется, когда он связывается с тромбином , другим белком, активно участвующим в коагуляции, а активации белка C в значительной степени способствует присутствие тромбомодулина и эндотелиальных рецепторов белка C (EPCR). Из-за роли EPCR активированный белок C обнаруживается преимущественно вблизи эндотелиальных клеток (т.е. тех, которые составляют стенки кровеносных сосудов), и именно на эти клетки и лейкоциты (лейкоциты) влияет APC. [7] : 34 [9] : 3162 Из-за решающей роли, которую протеин C играет в качестве антикоагулянта , люди с дефицитом протеина C или с некоторой устойчивостью к APC страдают от значительно повышенного риска образования опасных тромбов ( тромбоз ).
Исследования клинического использования рекомбинантной формы человеческого активированного протеина C (rhAPC), известной как Дротрекогин альфа-активированный под торговой маркой Xigris от компании Eli Lilly and Company , вызвали споры. Компания Eli Lilly провела агрессивную маркетинговую кампанию по пропаганде его использования у людей с тяжелым сепсисом и септическим шоком, а также выступила спонсором Руководства по проведению кампании по выживанию при сепсисе 2004 года . [10] Однако Кокрейновский обзор 2012 года показал, что его использование не может быть рекомендовано, поскольку оно не улучшает выживаемость и увеличивает риск кровотечений. [11] В октябре 2011 года компания Eli Lilly отозвала Зигрис с рынка из-за более высокой смертности в ходе исследования среди взрослых. [12]
Антикоагулянтная роль протеина С в организме человека была впервые отмечена Seegers et al. в 1960 году [13], который дал белку С его первоначальное название — аутопротромбин II-а . [5] : Протеин С 6822 был впервые выделен Йоханом Стенфло из бычьей плазмы в 1976 году, и Стенфло определил, что это витамин К-зависимый белок . [14] Он назвал его белком C, потому что это был третий белок («пик C»), который элюировался с ионообменного хроматографа на DEAE-сефарозе . В то время Сигерс занимался поиском витамин К-зависимых факторов свертывания крови, не обнаруженных с помощью анализов свертывания крови , которые измеряют глобальную функцию свертывания крови. Вскоре после этого Сигерс признал, что открытие Стенфло идентично его собственному. [5] : 6822 Активированный белок C был обнаружен позже в том же году, [15] и в 1977 году было впервые признано, что APC инактивирует фактор Va . [16] : 2382 [17] В 1980 году Вехар и Дэви обнаружили, что APC также инактивирует фактор VIIIa , [ 18] и вскоре после этого Уокер признал протеин S в качестве кофактора . [19] В 1982 году семейное исследование, проведенное Griffin et al . впервые связал дефицит протеина С с симптомами венозного тромбоза . [20] Гомозиготный дефицит протеина С и вытекающие из него серьезные последствия для здоровья были описаны в 1984 году несколькими учеными. [21] : Клонирование 1214 кДНК белка C было впервые выполнено в 1984 году Beckmann et al. которые создали карту гена, ответственного за выработку белка С в печени. [22] В 1987 году был проведен плодотворный эксперимент (Taylor et al. ), в ходе которого было продемонстрировано, что активированный протеин C предотвращает коагулопатию и смерть у павианов , которым вводили летальные концентрации E. coli . [16] : 2382 [23]
В 1993 году Dahlbäck et al. обнаружили наследственную устойчивость к APC . и связано с семейной тромбофилией . [24] В 1994 году была отмечена относительно распространенная генетическая мутация, вызывающая Лейденский фактор V (Bertina et al. ). [25] Два года спустя Gla-доменный APC был сфотографирован с разрешением 2,8 Ангстрема . [α] [5] Начиная с клинического исследования PROWESS в 2001 году [26] было признано, что многие симптомы сепсиса можно облегчить путем инфузии АПК, а уровень смертности пациентов с сепсисом может быть значительно снижен. [9] : 3161, 6 Ближе к концу того же года Дротрекогин альфа (активированный) , рекомбинантный активированный белок С человека, стал первым препаратом, одобренным FDA США для лечения тяжелого сепсиса . [27] В 2002 году журнал Science опубликовал статью, в которой впервые было показано, что белок C активирует протеазо-активируемый рецептор-1 (PAR-1), и этот процесс объясняет модуляцию белка иммунной системой. [16] : 2382 [28]
Биологические инструкции по синтезу белка С у человека закодированы в гене, официально названном «белок С (инактиватор факторов свертывания крови Va и VIIIa)». Символ гена, одобренный Комитетом по генной номенклатуре HUGO, — «PROC» от « протеина С ». Он расположен на второй хромосоме (2q13-q14) и состоит из девяти экзонов . [8] [16] : 2383 Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок C человека, имеет длину примерно 11 000 оснований. [8] : 4675
Человеческий белок C представляет собой витамин К-зависимый гликопротеин, структурно похожий на другие витамин К-зависимые белки, влияющие на свертывание крови, [29] такие как протромбин , фактор VII , фактор IX и фактор X. [21] : Синтез белка С 1215 происходит в печени и начинается с одноцепочечной молекулы-предшественника: сигнального пептида из 32 аминокислот на N-конце, предшествующего пропептиду . [30] : Белок C S11 образуется при удалении дипептида Lys 198 и Arg 199 ; это вызывает превращение в гетеродимер с N -связанными углеводами в каждой цепи. Белок имеет одну легкую цепь (21 кДа ) и одну тяжелую цепь (41 кДа), соединенные дисульфидной связью между Cys 183 и Cys 319 .
Неактивный белок C содержит 419 аминокислот в нескольких доменах : [16] : 2383 одного домена Gla (остатки 43–88); спиральный ароматический сегмент (89–96); два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF) (97–132 и 136–176); активационный пептид (200–211); и трипсиноподобный домен сериновой протеазы (212–450). Легкая цепь содержит Gla- и EGF-подобные домены и ароматический сегмент. Тяжелая цепь содержит протеазный домен и активационный петид. Именно в этой форме 85–90% протеина С циркулирует в плазме в виде зимогена , ожидая активации. [5] : 6822 Оставшийся зимоген белка С включает слегка модифицированные формы белка. Активация фермента происходит, когда молекула тромбина отщепляет активационный пептид от N-конца тяжелой цепи. [8] : 4673 [30] : S11 Активный центр содержит каталитическую триаду, типичную для сериновых протеаз (His 253 , Asp 299 и Ser 402 ). [16] : 2833
Домен Gla особенно полезен для связывания с отрицательно заряженными фосфолипидами для антикоагуляции и с EPCR для цитопротекции . Один конкретный экзосайт увеличивает способность белка C эффективно инактивировать фактор Va . Еще один необходим для взаимодействия с тромбомодулином. [16] : 2833
Посттрансляционные модификации . Человеческий белок C имеет по крайней мере пять типов посттрансляционных модификаций : (1) гамма- карбоксилирование первых девяти остатков глутаминовой кислоты в последовательности белка. Это событие модификации осуществляется витамин К-зависимой микросомальной карбоксилазой. Полный набор Gla необходим для обеспечения полной активности белка C. (2) бета- гидроксилирование Asp71 в одном из двух EGF-подобных доменов с образованием эритро-L-бета-гидроксиаспартата (bHA). Модификация необходима для функциональной активности, как было продемонстрировано путем мутации Asp71 на Glu. (3) N-связанное гликозилирование в трех возможных сайтах гликозилирования. Сообщается, что белок C человека в плазме на 23% состоит из углеводов. (4) Образование дисульфида. (5) Множественное протеолитическое расщепление основной цепи полипептида для удаления сигнального пептида из 18 аминокислот , пропептида из 24 аминокислот, а затем расщепление по аминокислотам 155-156 и 157-158 с получением двухцепочечной структуры циркулирующего зимогена. [31]
Активации протеина С в значительной степени способствуют тромбомодулин и рецептор эндотелиального протеина С (EPCR), последний из которых обнаруживается преимущественно на эндотелиальных клетках (клетках внутри кровеносных сосудов). Присутствие тромбомодулина ускоряет активацию на несколько порядков, [7] : 34 , а EPCR ускоряет активацию в 20 раз. Если какой-либо из этих двух белков отсутствует в мышиных образцах, мышь умирает от чрезмерного свертывания крови, еще будучи неподвижной. в эмбриональном состоянии. [32] : 1983 [33] : 43335 На эндотелии АПК играет важную роль в регуляции свертывания крови, воспаления и гибели клеток ( апоптоз ). [34] : 28S Из-за ускоряющего действия тромбомодулина на активацию белка С можно сказать, что белок активируется не тромбином, а комплексом тромбин-тромбомодулин (или даже тромбин-тромбомодулин-EPCR). [16] : 2381 Находясь в активной форме, APC может оставаться связанным или не оставаться связанным с EPCR, к которому он имеет примерно такое же сродство, как и белок-зимоген. [9] : 3162
Протеин С в форме зимогена присутствует в плазме крови нормального взрослого человека в концентрациях от 65 до 135 МЕ / дл . Активированный протеин С обнаруживается на уровне примерно в 2000 раз ниже этого. [9] : 3161 Легкий дефицит протеина С соответствует уровням в плазме выше 20 МЕ/дл, но ниже нормального диапазона. Умеренно тяжелые дефициты характеризуются концентрацией в крови от 1 до 20 МЕ/дл; при серьезном дефиците уровень протеина С оказывается ниже 1 МЕ/дл или не обнаруживается. Уровни белка С у здорового доношенного ребенка составляют в среднем 40 МЕ/дл. Концентрация протеина С увеличивается до шести месяцев, когда средний уровень составит 60 МЕ/дл; уровень остается низким в детстве, пока не достигнет уровня взрослых после подросткового возраста . [21] : 1216 Период полувыведения активированного протеина С составляет около 15 минут. [5] : 6823
Пути протеина C представляют собой специфические химические реакции, которые контролируют уровень экспрессии APC и его активность в организме. [7] : 34 Белок С плейотропен , имеет два основных класса функций: антикоагулянтную и цитопротекторную (его прямое воздействие на клетки). Какую функцию выполняет белок C, зависит от того, остается ли APC связанным с EPCR после его активации; антикоагулянтный эффект АПК возникает, когда его нет. В этом случае протеин C действует как антикоагулянт, необратимо протеолитически инактивируя факторы V a и фактор VIII a , превращая их в фактор VI и фактор VIII i соответственно. Будучи все еще связанным с EPCR, активированный белок C оказывает цитопротекторное действие, воздействуя на эффекторный субстрат PAR-1, рецептор-1, активируемый протеазой . В некоторой степени антикоагулянтные свойства APC не зависят от его цитопротекторных свойств, поскольку на экспрессию одного пути не влияет существование другого. [9] : 3162 [34] : 26С
Активность протеина С можно подавлять за счет уменьшения количества доступного тромбомодулина или EPCR. Это может быть сделано с помощью воспалительных цитокинов , таких как интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли-α (TNF-α). Активированные лейкоциты высвобождают эти медиаторы воспаления во время воспаления, ингибируя образование тромбомодулина и EPCR и вызывая их отторжение с поверхности эндотелия. Оба этих действия подавляют активацию протеина С. Сам тромбин также может влиять на уровень EPCR. Кроме того, белки, высвобождаемые из клеток, могут препятствовать активации протеина С, например эозинофилов , что может объяснить тромбоз при гиперэозинофильном заболевании сердца. [β] Белок C может регулироваться тромбоцитарным фактором 4 . Предполагается, что этот цитокин улучшает активацию белка C путем образования электростатического мостика между доменом Gla белка C и гликозаминогликановым (GAG) доменом тромбомодулина, уменьшая константу Михаэлиса (K M ) для их реакции. [16] : 2386 [34] : 29S Кроме того, протеин C ингибируется ингибитором протеина C. [35] : 369
Протеин С является основным компонентом антикоагуляции в организме человека. Он действует как зимоген сериновой протеазы : APC протеолизирует пептидные связи в активированном факторе V и факторе VIII (фактор V a и фактор VIII a ), и одной из аминокислот в связи является серин . [16] : 2381 Эти белки, которые инактивирует APC, Фактор Va и Фактор VIIIa , являются высокопрокоагулянтными кофакторами в выработке тромбина , который является решающим элементом в свертывании крови; вместе они являются частью протромбиназного комплекса . [34] 26S Кофакторы инактивации фактора Va и фактора VIIIa включают белок S , фактор V, липопротеин высокой плотности , анионные фосфолипиды и гликосфинголипиды . [9] : 3161
Фактор Va связывается с протромбином и фактором Xa , увеличивая скорость образования тромбина на четыре порядка (в 10 000 раз). Таким образом , инактивация фактора Va практически останавливает выработку тромбина. Фактор VIII, с другой стороны, является кофактором в производстве активированного фактора X, который, в свою очередь, превращает протромбин в тромбин. Фактор VIII a увеличивает активацию фактора X примерно в 200 000 раз. Из-за своей важности для свертывания крови фактор VIII также известен как антигемофильный фактор, а дефицит фактора VIII вызывает гемофилию А. [16] : 2382, 3
APC инактивирует фактор Va , совершая три расщепления (Arg 306 , Arg 506 , Arg 679 ). Расщепление как по Arg 306 , так и по Arg 506 уменьшает притяжение молекулы к фактору Xa , и хотя первый из этих сайтов расщепляется медленно, это совершенно необходимо для функционирования фактора V. Белок S способствует этому процессу, катализируя протеолиз по Arg 306 , при котором домен А2 фактора V диссоциирует от остальной части белка. [36] Белок S также связывается с фактором Xa , препятствуя последнему уменьшать инактивацию APC фактора Va . [16] : 2386
Инактивация фактора VIIIа не так хорошо изучена. Период полувыведения фактора VIIIa составляет всего около двух минут, если только не присутствует фактор IXa, стабилизирующий его. Некоторые ставят под сомнение значимость инактивации APC фактора VIIIa , и неизвестно, в какой степени фактор V и белок S являются кофакторами в его протеолизе. Известно, что APC воздействует на Фактор VIIIa путем расщепления по двум сайтам: Arg 336 и Arg 562 , любого из которых достаточно, чтобы отключить Фактор VIII a и преобразовать его в Фактор VIII i . [16] : 2387
Когда APC связан с EPCR, он выполняет ряд важных цитозащитных (т.е. клеточно-защитных) функций, большинство из которых, как известно, требуют EPCR и PAR-1. К ним относятся регуляция экспрессии генов, противовоспалительные эффекты, антиапоптотические эффекты и защита барьерной функции эндотелия. [9] : 3162
Обработка клеток APC демонстрирует, что модуляция экспрессии его генов эффективно контролирует основные пути воспалительного и апоптотического поведения. Существует около 20 генов, активность которых повышается с помощью протеина С, и 20 генов, активность которых снижается: первые, как правило, отвечают за противовоспалительные и антиапоптотические пути, а вторые имеют тенденцию быть провоспалительными и проапоптотическими. Механизмы APC для изменения профилей экспрессии генов недостаточно изучены, но считается, что они, по крайней мере частично, включают ингибирующее действие на активность транскрипционных факторов . [9] : 3162, 4 Важные белки, которые активируют APC, включают Bcl-2 , eNOS и IAP . APC вызывает значительное снижение уровня p53 и Bax . [16] : 2388
АПК оказывает противовоспалительное действие на эндотелиальные клетки и лейкоциты . APC влияет на эндотелиальные клетки, ингибируя высвобождение медиаторов воспаления и подавляя молекулы сосудистой адгезии . Это уменьшает адгезию и инфильтрацию лейкоцитов в тканях, а также ограничивает повреждение подлежащих тканей. APC поддерживает функцию эндотелиального барьера и снижает хемотаксис . АПК ингибирует высвобождение медиаторов воспалительного ответа в лейкоцитах, а также эндотелиальных клетках за счет снижения цитокинового ответа и, возможно, уменьшения системного воспалительного ответа, например, наблюдаемого при сепсисе . Исследования на крысах и людях показали, что APC уменьшает вызванное эндотоксином повреждение и воспаление легких. [9] : 3164
Ученые признают антиапоптотические эффекты активированного протеина С, но неясны точные механизмы, с помощью которых ингибируется апоптоз. Известно, что АПК обладает нейропротекторным действием . Антиапоптоз достигается за счет снижения активации каспазы 3 и каспазы 8 , улучшения соотношения Bax/Bcl-2 и снижения регуляции р53. [16] : 2388
Активированный протеин С также обеспечивает надежную защиту барьерной функции эндотелия. Разрушение эндотелиального барьера и соответствующее увеличение проницаемости эндотелия связаны с отеками , гипотонией и воспалением – всеми проблемами сепсиса. APC защищает функцию эндотелиального барьера , индуцируя PAR-1-зависимую активацию сфингозинкиназы-1 и активируя сфингозин-1-фосфат сфингозинкиназой . [9] : 3165
Несколько исследований показали, что протеолитическая активность APC способствует наблюдаемым цитопротекторным свойствам APC, но протеолитически неактивные варианты также способны регулировать образование PAR-активаторов тромбина и фактора Ха и проявлять цитопротекторные свойства in vitro и in vivo. [37] [38]
Генетический дефицит белка С в легкой форме, связанный с простой гетерозиготностью , вызывает значительно повышенный риск венозного тромбоза у взрослых. Если плод является гомозиготным или компаунд-гетерозиготным по дефициту, могут наблюдаться молниеносная пурпура , тяжелое диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и одновременная венозная тромбоэмболия в утробе матери; [21] : 1214 это очень серьезно и обычно смертельно. [39] : 211s Делеция гена протеина C у мышей приводит к гибели плода примерно во время рождения. Плоды мышей, у которых отсутствует белок С, сначала развиваются нормально, но у них наблюдаются сильное кровотечение, коагулопатия , отложение фибрина и некроз печени. [9] : 3161
Частота дефицита протеина С среди бессимптомных людей составляет от 1 из 200 до 1 из 500. Напротив, значительные симптомы дефицита обнаруживаются у 1 из 20 000 человек. Никаких расовых или этнических предубеждений не обнаружено. [21] : 1215
Обнаружено по меньшей мере 177 мутаций в этом гене, вызывающих заболевания. [40] Устойчивость к активированному протеину С возникает, когда APC не может выполнять свои функции. Это заболевание имеет симптомы, схожие с дефицитом протеина С. Наиболее распространенная мутация, приводящая к резистентности к активированному белку С среди европеоидов, находится в месте расщепления фактора V для APC. Там Arg 506 заменяется на Gln, образуя фактор V Лейдена . Эту мутацию также называют R506Q. [16] : 2382 Мутация, приводящая к потере этого сайта расщепления, фактически не позволяет APC эффективно инактивировать как фактор Va, так и фактор VIIIa . Таким образом, у человека слишком быстро сворачивается кровь, и он постоянно подвергается повышенному риску тромбоза. [41] : 3 Лица, гетерозиготные по лейденской мутации фактора V, несут риск венозного тромбоза в 5–7 раз выше, чем в общей популяции. У гомозиготных субъектов риск в 80 раз выше. [7] : 40 Эта мутация также является наиболее распространенным наследственным риском венозного тромбоза среди представителей европеоидной расы . [16] : 2382
Около 5% устойчивости к APC не связаны с указанной выше мутацией и фактором V Лейдена . Другие генетические мутации вызывают устойчивость к APC, но не в такой степени, как фактор V Лейдена . Эти мутации включают различные другие версии фактора V, спонтанную генерацию аутоантител, нацеленных на фактор V, и дисфункцию любого из кофакторов APC. [16] : 2387 Кроме того, некоторые приобретенные состояния могут снижать эффективность АПК в выполнении его антикоагулянтных функций. [7] : 33 Исследования показывают, что от 20% до 60% пациентов с тромбофилией страдают той или иной формой резистентности к АПК. [7] : 37
Варфариновый некроз — это приобретенный дефицит протеина С, возникающий в результате лечения варфарином , который является антагонистом витамина К и сам по себе антикоагулянтом. Однако лечение варфарином может вызвать парадоксальные поражения кожи, подобные тем, которые наблюдаются при молниеносной пурпуре. Вариант этого ответа проявляется в виде венозной гангрены конечностей , когда варфарин используется для лечения тромбоза глубоких вен, связанного с раком. В таких ситуациях прием варфарина можно возобновить в низкой дозе, чтобы гарантировать, что дефицит протеина С не появится до того, как будут подавлены факторы свертывания крови II, IX и X витамина К. [39] : 211с
Активированный протеин С расщепляет гистоны Plasmodium falciparum , которые высвобождаются во время инфекции: расщепление этих гистонов устраняет их провоспалительные эффекты. [42]
В ноябре 2001 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов одобрило Дротрекогин альфа-активированный (DrotAA) для клинического лечения взрослых, страдающих тяжелым сепсисом и с высоким риском смерти. [43] : 1332 Дротрекогин альфа-активированный представляет собой рекомбинантную форму активированного белка С человека (rhAPC). Он продается под названием Xigris компанией Eli Lilly and Company , [27] : 224.
Активированный дротрекогин альфа был предметом серьезных споров, когда он был одобрен для клинического использования, поскольку было обнаружено, что он увеличивает кровотечение, а не снижает смертность. [44] В октябре 2011 года rhAPC (Xigris) был отозван с рынка компанией Eli Lilly из-за более высокой смертности в исследовании среди взрослых. [12] [44]
АПК изучался как способ лечения повреждений легких после того, как исследования показали, что у пациентов с повреждением легких снижение уровней АПК в определенных частях легких коррелирует с худшими исходами. [9] : 3167, 8 APC также рассматривался для улучшения исходов пациентов в случаях ишемического инсульта , неотложной медицинской помощи, при которой закупорка артерии лишает область мозга кислорода, вызывая гибель тканей. Многообещающие исследования показывают, что APC можно сочетать с единственным одобренным в настоящее время лечением тканевым активатором плазминогена (tPA), чтобы защитить мозг от очень вредных побочных эффектов tPA , а также предотвратить гибель клеток из-за недостатка кислорода ( гипоксии ). [45] : 211 Клиническое использование АПК также было предложено для улучшения результатов трансплантации островков поджелудочной железы при лечении диабета I типа . [16] : 2392
Цепротин был одобрен для медицинского применения в Европейском Союзе в июле 2001 года. [46] Цепротин показан при молниеносной пурпуре и кумарин-индуцированном некрозе кожи у людей с тяжелым врожденным дефицитом протеина С. [46]
